Summary
Le but du présent protocole est de faciliter l’étude des récepteurs NMDA (NMDAR) à grande échelle et de permettre l’examen des effets modulateurs de petites molécules et leurs applications thérapeutiques.
Abstract
Les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) (NMDAR) sont classés comme des récepteurs de glutamate ionotropiques et ont un rôle essentiel dans l’apprentissage et la mémoire. Dysfonctionnement des NMDAR, exprimé comme soit plus - ou moins - sous‑activité causée par des mutations, une expression altérée, trafic ou la localisation, peut contribuer à nombreuses maladies, en particulier dans le système nerveux central. Comprendre la biologie du récepteur mais aussi de faciliter la découverte de composés et de petites molécules est donc crucial dans les efforts visant à lutter contre les maladies neurologiques. Les approches actuelles à l’étude du récepteur ont des limites y compris de faible débit, coût élevé et l’impossibilité d’étudier ses capacités fonctionnelles dues à la présence nécessaire des bloqueurs de canaux afin d’empêcher l’excitotoxicité médiée par NMDAR. En outre, les systèmes de dosage sont sensibles à la stimulation par le glutamate seulement et manquent de sensibilité à la stimulation par la glycine, le ligand autre co de la NMDAR. Nous présentons ici le premier dosage basé sur plaque avec puissance de haut débit afin d’étudier un récepteur NMDA avec sensibilité à la fois des ligands CO, glutamate et D-sérine/glycine. Cette approche permet l’étude de différentes compositions de sous-unité NMDAR et permet des études fonctionnelles du récepteur en modes glycine - et/ou sensibles au glutamate. En outre, la méthode ne requiert pas la présence d’inhibiteurs pendant les mesures. Les effets de MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs et négatifs peuvent être détectées avec ce dosage et la pharmacologie connue des NMDAR a été reproduite dans notre système. Cette technique permet de surmonter les limites des méthodes existantes et est rentable. Nous pensons que cette nouvelle technique permettra d’accélérer la découverte de thérapies pour des pathologies NMDAR-mediated.
Introduction
Avec les progrès actuels en médecine, l’espérance de vie a augmenté de façon significative ; Toutefois, il a donc la prévalence des maladies liées au vieillissement. Maladies du système nerveux central (CNS) tels que la schizophrénie, sclérose latérale amyotrophique (SLA), maladie d’Alzheimer et de Parkinson, entre autres, ne font pas exception et ont été devrait pour augmenter au cours de la prochaine décennie1, 2 , 3. le défaut de fonctionnement des récepteurs du glutamate ionotropiques appelés récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) a été liée à la maladie d’Alzheimer, la schizophrénie, traumatisme crânien, accident vasculaire cérébral, diabète et glaucome parmi d’autres, qui garantit la besoin d’étudier leur biologie pour le développement de thérapies efficaces, modificateurs4,5,6,7.
Récepteurs NMDA est composées de quatre monomères ou sous-unités4,8,9. La composition structurelle de la NMDAR montre la variabilité régionale et de développementale dans le cerveau7,10. Récepteurs NMDA est impliqués dans la plasticité synaptique, la cognition et la génération des rythmes respiratoires et locomotion11,12,13. Comme un canal de voltage-dépendants, c’est en grande partie non conducteur à potentiel membranaire de repos (-70 mV) et est bloquée par le magnésium pour prévenir d’autres perméation des ions. Le canal est activé par la liaison de deux ligands, glutamate et glycine/D-sérine et une dépolarisation simultanée au niveau de la membrane synaptique médiée par les récepteurs AMPA, une autre sous-classe des récepteurs ionotropiques du glutamate. La dépolarisation supprime le blocage de magnésium de la NMDAR, permettant l’afflux des cations, en particulier calcium14,15,16. Même si l’activation des NMDAR est essentielle pour la survie des cellules, activation excessive peut conduire à la mort17,18,19 à l’excitotoxicité de cellules. Cela, en plus de la nature complexe du récepteur, fait qu’il est difficile d’effectuer des études nécessaires au développement de thérapies efficaces.
Différentes méthodes ont été développées pour étudier le NMDAR. Cependant, chacun a accompagnant les mises en garde. Par exemple, une technique largement utilisée est un test par fluorescence qui mesure les changements NMDAR en calcium intracellulaire dans une lignée cellulaire stable sous le contrôle d’un promoteur inductible par la tétracycline (Tet-On)20. Cependant, dans ce système, les concentrations de supramaximal de ligands qui sont nécessaires et l’exigence que les inhibiteurs NMDAR sont présents lors de la mesure rend presque impossible de détecter l’activité de l’antagoniste compétitif. Dans d’autres systèmes similaires, l’expression du récepteur fonctionnel provoque la toxicité, exigeant que les bloqueurs des canaux calciques comme la kétamine21,22 , afin de préserver les cultures cellulaires. Ces inhibiteurs des canaux calciques s’asseoir au centre du récepteur et sont difficiles à laver, surtout dans un format de plaque, afin qu’ils interfèrent avec des études fonctionnelles du récepteur. Enfin, des mesures électrophysiologiques comme correctif de serrage, il y a un débit limité, en études à grande échelle sont très cher23. Nonobstant, les systèmes ci-dessus sont insensibles à la stimulation de la glycine ; étude de l’activité de la glycine-dépendante de la NMDAR devient donc un défi.
Nous décrivons ici une nouvelle approche pour l’étude de NMDAR qui surmonte les limites discutés. Notre technique capitalise sur le système d’expression baculovirus pour exprimer le récepteur au niveau fonctionnel avec un rapport optimal des sous-unités en aussi peu que 16 heures. Par ailleurs, l’utilisation de baculovirus permet une approche simple et combinatoire, qui prévoit une large caractérisation des sous-types distincts recombinants NMDAR. Contrairement à d’autres épreuves, ce protocole ne nécessite pas de bloqueurs des canaux calciques en raison de l’utilisation des antagonistes des faibles. Les plus fort avantage de la méthode est qu’après sevrage de l’antagoniste faible, le récepteur est sensible à la modulation des sites individuelle glycine-glutamate-liaison et en plus double modulation de glycine/D-sérine et glutamate ligands sites. Le dosage récapitule la pharmacologie connue du récepteur NMDAR et les effets de ses modulateurs positifs et négatifs connus. Enfin, génération de ce test cellulaire in vitro surmonte la toxicité cellulaire provoquée par l’influx de calcium excessif et permet des études fonctionnelles du récepteur dans un mode haut débit, qui peut accélérer les découvertes des modulateurs NMDAR dans les États de la maladie.
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Protocol
1. préparation des cellules
Remarque : Le présent protocole, y compris la génération de données, utilise les cellules HEK293 transduites avec un encodage NR1 et NR2A cellules de baculovirus.
- Le nombre de cellules HEK293 approprié de graines et ajouter le virus NR1 et/ou NR2A aux concentrations finales appropriées (1,00 µL). Pour une plaque 384 puits, utiliser 10 000 cellules/puits dans un volume final de 30 µL.
- Sinon, les cellules HEK293-NR1-NR2A graines dans la cellule appropriée nombre et le volume (pour une plaque 384 puits, utilisation 10 000 cellules/puits dans un volume final de 30 µL). Ajouter la tétracycline à une concentration de 2 µg/mL, pour induire l’expression NR2A et ajouter la protection composée (100µm MDL105, 519 ou 5 µM CGP07066724).
- Remarque : Le baculovirus codant NR1 et NR2 devrait avoir un titre approximatif entre 5 x 109 - 10 x 109 unité infectieuse par millilitre24.
2. mesure de l’activité des récepteurs NMDA
- Préparer une plaque 384 puits avec cellules HEK293 transduites avec cellules NR1/NR2 ou HEK293-NR1-NR2A en présence soit composé de protection. Utiliser un fond transparent, le cadre noir, la plaque revêtu de poly-D-lysine.
NOTE : Protection avec 100 µM MDL105, 519 sert à conférer la sensibilité à la glycine, tandis que 5 µM CGP070667 est utilisé pour conférer la sensibilité au glutamate. - Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 16 heures (une nuit).
- Retirez la plaque de l’incubateur et jeter doucement les milieux cellulaires en ralentissant renversant la plaque au-dessus d’un récipient de biodéchets compatible. Tapoter la plaque sur une serviette en papier pour nettoyer les médias hors bords de la plaque et vider tous les autres médias.
- Préparer le colorant-calcium6 par solubilisation, un flacon de teinture de calcium6 (1 taille de plaque) dans 10 mL de tampon d’incubation (pH de HBSS 7,5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, probénécide 1 mM). Incuber la plaque pendant 2 heures à 37 ° C et 5 % de CO2.
- Retirez la plaque de l’incubateur et permet dajuster les cellules à température ambiante pendant 10 minutes.
- Versez doucement le colorant-calcium6 comme indiqué au point 2.3, ajouter 30 µL de tampon (pH de HBSS 7,5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, probénécide 1 mM).
- Répétez l’étape 2.6 deux fois pour un total de 3 lavages. Laisser 30 µL de tampon sur les cellules après le dernier lavage.
- Laisser les cellules reposer pendant 5 minutes à température ambiante.
- Préparer la plaque de ligand en faisant un point sur 4 x 400 µM glycine et 400 µM glutamate (concentration finale de 100 µM ; concentration optimale des ligands à déterminer comme décrit ci-dessous). Transférer un minimum de 25 µL de stock de ligand dans une plaque 384 puits de V-fond.
- Charger la plaque de ligand et la plaque cellulaire dans les FDSS (système de dépistage des drogues fonctionnelle).
- Mesurer la fluorescence de la ligne de base (Fo) de la plaque cellulaire pendant 30 secondes. Transférer 10 µL de la crosse de ligand dans la plaque cellulaire à l’aide de la fonction de distribution FDSS et mesure le flux de calcium en enregistrant la fluorescence calcium6-colorant pendant 5 minutes.
- Calculer le ratio de fluorescence maximale en divisant la fluorescence maximale obtenue par la fluorescence de la ligne de base (Fmax/fo).
3. optimisation des niveaux d’Expression de NMDAR
- Pour déterminer la quantité optimale de baculovirus d’utiliser, effectuez un titrage de NR1 tant NR2A virus. Préparer une plaque 384 puits avec cellules HEK293 (recommandation de 10 000 cellules/puits, 30 µL de médias) et comprennent les composés de protection comme indiqué au point 2.1.
- Ajouter des quantités variables du virus NR1 dans différentes lignes de la plaque (par exemple : ajouter 2 µL, 1 µL, 0,5 µL, µL 0, 0,25 µL dans les lignes A-E respectivement). Ajouter les doublons pour l’exactitude des données.
- Ajouter des quantités variables du virus NR2A dans différentes colonnes de la plaque (par exemple : ajouter 2 µL, 1 µL, 0,5 µL, µL 0, 0,25 µL dans les lignes A-E respectivement). Ajouter les doublons pour l’exactitude des données.
- Incuber les plaques à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 16 heures (une nuit).
- Déterminer le ratio optimal et la quantité des virus NR1 et NR2A en effectuant une mesure de flux de calcium sur le FDSS (voir ci-dessus).
4. titrage de ligand
- Préparer les cellules comme indiqué au point 2.3.
- Préparer des dilutions de chaque ligand en présence de concentrations (100 µM) saturantes du autre ligand comme une solution-mère 4 fois. Par exemple : pour une concentration de test final de 10 µM de la glycine, préparer une solution 40 µM de glycine dont 400 µM glutamate.
- Procéder à la mesure des FDSS comme indiqué au point 2.11.
5. composé stable
- Préparer les cellules comme décrit à l’étape 1.
- Préparer la plaque de ligand avec un stock de 5 fois de la concentration de ligand final dans le tampon.
- Préparer la plaque de composés avec le stock 4 fois de la concentration finale souhaitée de composés dans le tampon. Pour une concentration finale de composé de 10 µM dans le tampon, préparer une solution 40 µM.
- Maintenir la concentration de la diméthyl sulfoxyde (DMSO) constante à travers tous les échantillons en préparant une dilution préalable du composé dans le DMSO avant plus de dilution dans le tampon.
- Pour une dose réponse du composé dans l’analyse finale comprise entre 3 et 30 µM, préparer une dilution préalable du composé dans le DMSO allant de 1 à 10 mM. Diluer dans le tampon à la concentration en stock 4 fois. La concentration finale du DMSO ne devrait pas dépasser 0,5 %.
NOTE : Il est recommandé de tester chaque échantillon en géométrie.
- Charger le ligand, composé et plaque cellulaire dans FDSS.
- Mesurer la fluorescence de base pendant 30 secondes.
- Ajouter 10 µL de stock composé et mesurer la fluorescence pendant 5 minutes.
- Ajouter 10 µL de stock de ligand et mesurer la fluorescence pendant 5 minutes.
- Déterminer l’intégrale de la ratio de fluorescence en calculant l’aire sous la courbe des ratios fluorescents durant les 5 dernières minutes de la mesure.
Remarque : Vous pouvez également le rapport maximal de fluorescence après addition de ligand peut être utilisé pour l’analyse.
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Representative Results
Avant de tester les effets de petites molécules, il faut déterminer les niveaux d’expression optimale de NMDAR ainsi que les concentrations du ligand optimale. Tel que décrit, HEK293 cellules ont été injectées à 10 000 cellules par puits dans une plaque 384 puits, en présence de 5 µM CGP060667, puis transduites avec des quantités variables de NR1 et NR2A virus. Après incubation pendant la nuit, induite par le ligand calcium flux a été mesurée (Figure 1). Les résultats de ces expériences révèlent la meilleure quantité et proportion de virus à utiliser pour chaque sous-unité (Figure 1, boîte jaune).
Une fois que la quantité optimale et le ratio pour la transduction avec le NR1 et NR2A ont été déterminés, un titrage de ligand a été réalisé afin de déterminer la concentration de ligand optimal pour l’activation des récepteurs NMDA. Pour ce faire, un des ligands CO a été ajouté à des concentrations variables à fixe, saturant les concentrations du ligand autre co (Figure 2 a-2 b). Des résultats similaires ont été obtenus pour les autres combinaisons de sous-unité de la NMDAR comme NR1/NR2B et NR1/NR2D (Figure 2), démontrer l’applicabilité de l’essai d’autres membres de la famille de NMDAR24. Après avoir déterminé les niveaux d’expression optimale et la concentration de ligand, il peut procéder à tester les effets des NMDAR-modulateurs dans le dosage.
Compatible avec les rapports publiés, ce premier test axée sur la plaque pour l’étude des récepteurs NMDA avec sensibilité à la fois de glycine et de glutamate à grande échelle reproduit des données sur les propriétés connues des NMDAR14,25,26. Ici, nous utilisons l’activité des deux composés, [(acide R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic (NVP-AAM077), un antagoniste du glutamate site et [7-chloro-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) phényl-2 (H) quinolones] (L701, 324), un antagoniste de site de glycine, pour illustrer les résultats prévus de l’essai27,28 (Figure 3). Enfin, chacun des composés a été testé à la CE80 du ligand naturel respectif de l’accepteur. Réduction de la concentration de ligand est censée augmenter le pouvoir des antagonistes, alors qu’il devrait n’avoir aucun effet sur l’activité des inhibiteurs non compétitifs ou pore-bloquants.
Figure 1 : titrage des sous-unités NR1 et NR2A. Différents volumes de virus qui codent des sous-unités NMDAR NR1 et NR2A ont été titrés pour déterminer la quantité requise pour une activité fonctionnelle optimale du récepteur. Un ratio de 1:1 (v/v) NR1:NR2A a été observé comme le ratio optimal avec 1 µL de chaque (boîte jaune). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : titrage Ligand. A. dans une concentration fixe de glycine (100 µM), des concentrations variables de glutamate ont été titrées et le flux de calcium a été enregistré. Barres d’erreur représentent déviation standard. B. Glutamate est resté à une concentration de 100 µM et a été titré sur différentes concentrations de D-sérine et de la glycine et le flux de calcium a été mesuré. Il n’y avait aucun différence significative entre le flux de calcium en glycine et en D-sérine. Barres d’erreur représentent déviation standard. C. cellules transduites avec baculovirus NR1 et NR2D ont été stimulées avec soit du glutamate 100µm et faisant varier les concentrations de la D-sérine ou 100 µM D-sérine et changeante des concentrations du flux de glutamate et de calcium a été mesurée. Barres d’erreur représentent déviation standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : caractériser l’activité d’antagoniste de ligand binding site. En utilisant les expressions de ligand et la sous-unité optimales prédéterminées, les effets d’un antagoniste du glutamate-accepteur, NVP-AAM077 et un antagoniste du site glycine-liaison, L701, 324 ont été caractérisés par l’analyse de flux de calcium pour NR1/NR2A à indiqués concentrations. Une concentration égale à la CE80 de glycine ou glutamate en présence de la concentration de saturation (100 µM) de l’autre ligand a été utilisée après l’addition de NVP-AAM077 et L701, 324, respectivement. Barres d’erreur représentent déviation standard. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La réussite de ce test dépend largement de la santé des cellules HEK utilisé. Les cellules en croissance exponentielle et au nombre de passage bas doit être utilisé. Ce test comporte de nombreux transferts et ajouts des solutions, donc attention, en utilisant assurera une plus grande précision dans ses résultats. Les concentrations de composés et de tous les autres réactifs doivent être également une vérification croisée afin de minimiser les erreurs. Lors du remplacement des milieux cellulaires avec le tampon pour le dosage du flux calcique, la plaque doit être inclinée doucement afin que les cellules ne retirez pas. Enfin, l’utilisation de plaques revêtus de poly-D-lysine dans le présent protocole augmente la fixation des cellules à la plaque.
Il peut y avoir des différences dans l’expression de NMDAR et la quantité de virus nécessaire pour l’expression de la sous-unité selon le nombre de passage et de remise en forme des cellules HEK293 au moment de la transduction. En outre, le baculovirus a une durée de vie courte, allant de six mois à un an. Par conséquent, la qualité du virus est un paramètre important pour ce dosage. Un test d’immunofluorescence standard peut être utilisé pour détecter et confirmer les niveaux d’expression et la localisation des unités NMDAR avant d’autres expériences de24. Autres lignées cellulaires peuvent être utilisées pour étudier le récepteur NMDA utilisant ce protocole. Cependant, la tolérance et l’expression des récepteurs NMDA, en utilisant le baculovirus doivent être confirmées avant de commencer le protocole ; dans le cas contraire, des résultats inattendus peuvent se produire. En outre, les composés tels que les inhibiteurs de la topoisomérase II ont été signalés pour augmenter l’efficacité de baculovirus expression29. Ces solutions de rechange peuvent être testées et optimisées selon les préférences de l’utilisateur.
L’étude des processus biologiques dans un type de cellule différent de celle du type cellulaire d’origine soulève des questions au sein de la communauté scientifique. Une limitation de ce test est l’utilisation de lignées cellulaires de rein (HEK 293) comme un système modèle pour étudier les récepteurs de glutamate ionotropiques, NMDAR. Des cellules HEK ont été utilisées en raison de leur potentiel de membrane dépolarisée semblable à celui des neurones dépolarisées. En outre, la similitude entre les récepteurs NMDA dans le cerveau et dans notre modèle est confirmée par nos études complémentaires. L’activité de MODULATEURS ALLOSTÉRIQUES positifs tels que GNE-8324, modulateurs négatifs tels qu’ifenprodil et inhibiteurs calciques comme la kétamine, ainsi que la dépendance de la tension de la NMDAR, ont été confirmés dans notre modèle22,23 ,24. Notre capacité d’ajuster la quantité de virus pour les sous-unités NR1 et NR2A assure également, les niveaux d’expression fonctionnelle optimale.
En raison de la faible efficacité, coût élevé et résultat minimal de réussite, la caractérisation des récepteurs individuels et leur pharmacologie unique sont présentement effectuées en bas-débit manuel patch clamp dosages22,23. En revanche, l’excitotoxicité demeure un obstacle majeur quand utilisant stablement transfected des cellules, parce que la surexpression des récepteurs NMDA fonctionnelles sont nocifs pour les cellules à cause des ligands (glutamate et glycine/D-sérine) qui sont libérées dans les médias18. Comme une alternative plus forte, notre essai utilise expression baculovirus-mediated des NMDAR fonctionnels, qui surmonte l’excitotoxicité et donne une expression rapide, titrable des récepteurs. Plutôt que d’être limité par la nature collante des inhibiteurs des canaux calciques, ce dosage tire également parti des antagonistes des sites de liaison du ligand faibles. Ces antagonistes rivaliser avec des ligands endogènes dans les médias et protègent les sites de liaison du ligand. C’est pourquoi, après le lavage des antagonistes, sensibilité aux ligands exogènes-ajout du glutamate - et glycine/D-sérine-accepteurs est restaurée.
Ce dosage, combiné avec les progrès récents en biologie moléculaire comme CRISPR, aidera la cible et caractériser de nouveaux régulateurs de NMDAR expression et la fonction. Parallèlement, cette analyse permettra d’identifier les petites molécules qui peuvent directement ou indirectement modulent l’activité de NMDAR sans la nécessité de produire des lignées cellulaires stables, fournissant ainsi la compatibilité avec les écrans de molécule génétique - et petit-basé.
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Disclosures
Les auteurs ont aucun conflit d’intérêts et rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier le Post baccalauréat Scholars Program Office et Novartis Institutes for BioMedical Research dans son ensemble pour le financement de cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
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