Summary
このプロトコルの目標より大きな規模での NMDA 受容器 (NMDAR) の研究と、低分子化合物の変調作用の検討と治療への応用です。
Abstract
N メチル D アスパラギン酸 (NMDA) 受容体 (NMDAR) はグルタミン酸に分類され、学習と記憶に重要な役割を持っています。表現としてどちらかに- または下-activity の突然変異、発現、人身売買、またはローカリゼーションによる NMDAR の故障は、中枢神経系を中心に、多数の病気に貢献できます。したがって、化合物と低分子化合物の探索を促進することと同様、受容体の生物学を理解することは、神経疾患と闘うための継続的な努力で重要です。現在の受容体の勉強方法低スループット、高コスト NMDAR 仲介された毒性を防ぐためにチャネル遮断薬の必要な存在のためにその機能能力を研究することができないなどの制限があります。また、既存のアッセイ系のみグルタミン酸による刺激に敏感である、グリシン、NMDAR の他の共同のリガンドによる刺激に対する感受性を欠いています。両方共配位子、グルタミン酸や D セリン ・ グリシンへの感受性と NMDA 受容体を研究する高スループット力と最初のプレート ベースのアッセイを紹介します。このアプローチ様々 な NMDAR サブユニット組成の研究でき、受容体の機能解析グリシンやグルタミン酸に敏感なモードで。また、メソッドでは、測定中の阻害剤の存在は必要がないです。正と負のアロステリック変調器の効果は、このアッセイで検出できるし、NMDAR の既知の薬理学は、私たちのシステムにレプリケートされています。この手法は既存の方法の限界を克服、経済的であります。この手法は NMDAR を介した病態の治療の発見を加速すると考えています。
Introduction
医学の現在の進歩、平均寿命が大幅に増加します。しかし、加齢に伴う疾患の有病率がのであります。中枢神経系 (CNS)、他の中で、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) 統合失調症などの疾患は例外ではありません、次の十年1,で増加する予測されています。2,3N メチル D アスパラギン酸塩の受容器 (NMDAR) として知られているイオン型グルタミン酸受容体の機能不全は、アルツハイマー病、統合失調症、外傷性脳損傷、脳卒中、糖尿病、緑内障等保証のにリンクされている、。効果的な疾患修飾療法4,5,6、7の開発のための生物を勉強する必要があります。
NMDARs は、4 つのモノマーまたはサブユニット4,8,9で構成されます。NMDAR の構造は、脳7,10内の発達と地域の変動を示しています。NMDARs は、シナプス可塑性と認知及び呼吸と歩行11,12,13のリズムの生成に関与しています。電位依存性チャネルとしてそれは、安静時の膜電位伝導非主 (-70 mV) し、さらにイオンの透過を防ぐためにマグネシウムによってブロックします。2 配位子、グルタミン酸およびグリシン/D-セリン、バインドによってチャネルがアクティブになるし、シナプス膜に同時脱分極は AMPA 受容体、イオン型グルタミン酸受容体の別のサブクラスによって仲介されます。分極防止作用は、特にカルシウム14,,1516陽イオンの流入を有効にする、NMDAR のマグネシウム閉塞を削除します。にもかかわらず NMDAR の活性化は細胞の生存に不可欠な過剰な活性化は細胞死17,18,19応需型につながります。これは、受容体の複雑な性質に加えて難しく研究を実施する効果的な治療法を開発するために必要です。
別の方法は、NMDAR の研究に開発されています。ただし、それぞれの注意事項が付属しています。たとえば、1 つの広く使われている技術は安定したセルライン テトラサイクリン誘導性プロモーター (テトの)20の制御の下での細胞内カルシウム NMDAR 依存性の変化を測定する蛍光ベースの試金であります。ただし、このシステムに必要な配位子の激濃度と NMDAR の阻害剤が測定中に存在している要件不可能になります競争力の拮抗筋の活動を検出します。他の同様のシステムは、機能的受容体の発現は、ケタミン21,22細胞培養を維持するなどの拮抗を必要とする毒性を引き起こします。これらのチャネルのブロッカーは、受容体のコアに座るし、受容体の機能解析と干渉すること特にプレート ベースの形式で、洗いにくい。最後に、パッチなどの電気生理学的計測、スループットの制限があるし、大規模な研究は、非常に高価な23。にもかかわらず、上記のシステムはグリシンの刺激に敏感したがって、課題となる、NMDAR のグリシン依存性活性を勉強します。
ここでは、議論の制限を克服 NMDAR の勉強への新しいアプローチについて述べる。バキュロ ウイルス発現系としてはほとんど 16 時間で受容体のサブユニットの最適比の機能レベルを表現する技術を使用します。さらに、バキュロ ウイルスの使用によりシンプルかつコンビナトリアル アプローチは、異なる組換え NMDAR のサブタイプの広範な評価を提供します。他のアッセイとは異なり、このプロトコルには弱いアンタゴニストの使用のためチャネル遮断薬は必要ありません。メソッドの最も強い利点は弱い拮抗薬の後のウォッシュ アウトはグリシン/D-セリン、グルタミン酸の両方のデュアルの変調に加えて個々 グリシンとグルタミン酸結合部位の変調に敏感で受容体リガンド結合サイト。試金は NMDAR 受容体の既知の薬理学とその既知の正と負の変調器の効果を繰り返します。最後に、この生体外細胞アッセイの生成過剰なカルシウムの流入によって引き起こされる細胞毒性を克服でき、NMDAR の変調器の発見を加速することができます高スループット方法で受容体の機能解析病にある州。
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Protocol
1. 細胞の調製
注: このプロトコルは、データの生成を含むエンコーディング NR1 と NR2A 細胞バキュロ ウイルスで導入した HEK293 細胞を使用します。
- HEK293 細胞の適切な数をシードし、適切な最終濃度 (各 1.00 μ L) で NR1 および NR2A のウイルスを追加します。384 ウェル プレート 10,000 30 μ L の最終巻で細胞/ウェルを使用します。
- また、適切な細胞数と (384 ウェル プレート使用 10,000 細胞/ウェル 30 μ L の最終巻で) のためのボリュームで HEK293 NR1 NR2A 細胞をシードします。NR2A 式を誘導する化合物の保護を追加する 2 μ G/ml の濃度でテトラサイクリンを追加 (100 μ M MDL105、519 または 5 μ M CGP07066724)。
- 注: エンコード NR1 と NR2 バキュロ ウイルス 5 x 109 - 10 x 109感染単位ミリリットル24間概算価が必要です。
2. NMDA 受容体活性の測定
- いずれかの保護化合物存在下での NR1/NR2 HEK293 NR1 NR2A セル増殖型 HEK293 細胞で 384 ウェル プレートを準備します。透明な底、黒フレーム、ポリ-D-リジン コーティング プレートを使用します。
注: 保護 100 μ m MDL105, 519 5 μ M 中のグリシンに感度を与えるため CGP070667 グルタミン酸感受性を付与するために使用します。 - 16 時間 (夜間) 37 ° C および 5% の CO2でプレートを孵化させなさい。
- インキュベーターからプレートを削除し、優しくプレートをひっくり返す互換性存在コンテナーを遅くことによって携帯メディアを破棄します。プレートの端から媒体をきれいにし、残りのメディアをドレイン紙タオルの上にプレートを軽くたたきます。
- Calcium6 色素 (1 プレート サイズ) の 1 つのバイアルを可でインキュベーション バッファー (HBSS pH 7.5、20 mM HEPES、1 mM MgCl2、1 mM プロベネシド) 10 mL に calcium6 染料を準備します。プレートを 37 ° C、5% CO2で 2 時間インキュベートします。
- インキュベーターからプレートを削除し、10 分間部屋の温度に調整する細胞。
- 優しく 2.3 の手順で説明されているように calcium6 染料を注ぐ、アッセイバッファー (HBSS pH 7.5、20 mM HEPES、CaCl2、1.8 mM 1 mM プロベネシド) の 30 μ L を追加します。
- 3 洗浄の合計のために二度 2.6 手順を繰り返します。最後の洗浄後、セルにアッセイバッファーの 30 μ L を残します。
- 室温で 5 分間、残りの細胞ができます。
- 400 μ M のグリシンと 400 μ M グルタミン酸 (最終濃度 100 μ m; 下記のとおり決定する配位子の最適濃度) の 4 倍在庫することによって配位子板を準備します。V 底 384 ウェル プレートにリガンド株式の 25 μ L の最小値を転送します。
- フリーダイヤル (機能薬物スクリーニング システム) にリガンド板とセル板を読み込みます。
- 30 秒間セル板のベースライン蛍光 (Fo) を測定します。5 分間 calcium6 色素蛍光を記録することによってフリーダイヤル調剤機能と測定カルシウム フラックスを使用して細胞板にリガンド株式の 10 μ L を転送します。
- 最大蛍光比を計算する、ベースラインの蛍光 (F最大/Fo) によって得られる最大の蛍光を割る。
3. NMDAR 発現レベルの最適化
- 使用するバキュロ ウイルスの量を調べるには、滴定、NR1 および NR2A のウイルスを実行します。HEK293 細胞 (10,000 細胞/ウェルの推薦、メディアの 30 μ L) で 384 ウェル プレートを準備し、手順 2.1 保護化合物が含まれます。
- プレートの異なる行の NR1 ウイルスの様々 な量を追加 (例: 行 A E 0 μ L、2 μ、1 μ L、0.5 μ L、0.25 μ L をそれぞれ追加)。データの正確性の重複を追加します。
- プレートの別の列に NR2A ウイルスの様々 な量を追加 (例: 行 A E 0 μ L、2 μ、1 μ L、0.5 μ L、0.25 μ L をそれぞれ追加)。データの正確性の重複を追加します。
- 16 時間 (夜間) 37 ° C および 5% の CO2でプレートを孵化させなさい。
- フリーダイヤル (上記参照) にカルシウム フラックス測定を実行することによって、最適な比率と NR1 および NR2A のウイルスの量を決定します。
4. 配位子の滴定
- 2.3 の手順で説明するように、セルを準備します。
- 4 倍原液として他の配位子の飽和濃度 (100 μ M) の存在下でそれぞれの ligand の希釈液を準備します。たとえば: グリシン最終試験濃度 10 μ M、40 μ M の原液 400 μ M グルタミン酸を含むグリシンの準備します。
- フリーダイヤル測定 2.11 の手順で説明するように進みます。
5. 複合試験
- 手順 1 で説明したように、セルを準備します。
- アッセイ バッファーに最終的なリガンド濃度の 5-fold 株式を持つリガンド プレートを準備します。
- アッセイ バッファーにおける化合物の所望の最終濃度の 4 倍の株式を持つ化合物のプレートを準備します。最終的な化合物の濃度、アッセイバッファーで 10 μ m、40 μ M の原液を準備します。
- ジメチルスルホキシド (DMSO) の濃度を一定に保つすべてのサンプル測定バッファーにさらに希薄化前に、の DMSO の化合物の前希釈を準備することによって。
- 3 と 30 μ M の間で及ぶ最終試金の化合物の線量応答を 1 から 10 の mM まで及ぶ DMSO の化合物の前希釈を準備します。4 倍のストック濃度にアッセイバッファーで希釈します。DMSO の最終濃度 0.5% を超えてはなりません。
注: トリプリケートで各サンプルをテストすることをお勧めします。
- フリーダイヤルにリガンド、化合物、及び細胞板を読み込みます。
- 30 秒のベースライン蛍光を測定します。
- 化合物の在庫の 10 μ L を追加し、5 分の蛍光を測定します。
- リガンド株式の 10 μ L を追加し、5 分の蛍光を測定します。
- 蛍光比の積分を測定の最後の 5 分間蛍光比の曲線下面積を計算することによって決定します。
注: また、蛍光リガンド添加後の最大比使用できます分析のため。
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Representative Results
小分子の効果をテストする前に、1 つは NMDARs として最適なリガンド濃度の最適な発現レベルを定めなければなりません。前述、HEK293 細胞/ウェルの 384 ウェル プレートで 10,000 細胞播種 5 μ M の存在下で CGP060667、その後導入 NR1 と NR2A の変化量とウイルス。孵化翌日、リガンド誘導性カルシウム後フラックスを測定した (図 1)。これらの実験の結果では、最高の量とそれぞれのサブユニット (図 1、黄色のボックス) を使用するウイルスの比を明らかにします。
最適量および NR2A の NR1 と伝達の比率が決定されると、配位子の滴定を行った NMDARs の活性化のための最適なリガンド濃度を決定します。これを達成するために共同配位子の 1 つ追加されましたでさまざまな濃度の固定、その他の共同のリガンドの濃度を飽和状態 (図 2 a-2B)。似たような結果が得られて NMDAR NR1/NR2B、NR1/NR2D (図 2) などの他のサブユニットの組み合わせ他 NMDAR 家族24への試験の適用性を実証します。最適な発現レベルおよびリガンド濃度の決定後、1 つはアッセイで NMDAR 変調器の効果のテストを続行できます。
パブリッシュされたレポートと同様に、感受性グリシンと大規模なグルタミン酸と一緒に NMDARs を勉強するこの最初プレート ベースのアッセイは NMDAR14,25,26の知られているプロパティにデータを再現します。ここでは、我々 は 2 つの化合物のアクティビティを使用して [(R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic 酸 (NVP AAM077)、グルタミン酸サイト拮抗薬と [7-クロロ-4-hydroxy-3-(3-phenoxy)フェニル 2 (H) キノロン系] (L701、324)、グリシン サイト拮抗薬, アッセイ27,28 (図 3) の予測結果を例示します。最後に、各化合物は、それぞれの天然リガンド結合部位の EC80 でテストされました。リガンド濃度の減少は、非競争阻害剤や細孔ブロッカーの効力に影響がないように、それは拮抗薬の効力を増加する予定です。
図 1: NR2A、NR1 亜単位の滴定します。受容体の最適な機能活動のために必要な量を決定する NR1 と NR2A NMDAR のサブユニットをコードするウイルスの別のボリュームで滴定します。1:1 (v/v) 比 NR1:NR2A は、各 (黄色のボックス) の 1 μ L での最適な比率として観察されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 配位子滴定します。A. グリシン (100 μ M) の一定濃度のグルタミン酸濃度の変化で滴定してカルシウム変化が記録されました。エラーバーは標準偏差を表します。B. グルタミン酸が 100 μ M の濃度で推移している D-セリン、グリシンの濃度に対して滴し、カルシウム変化を測定しました。グリシン、D-セリン カルシウム変化間に有意差はありませんでした。エラーバーは標準偏差を表します。C. NR1 と NR2D バキュロ ウイルスで導入した細胞促進されたどちらかの 100 μ M のグルタミン酸と D-セリンの濃度やグルタミン酸、カルシウムのフラックスの 100 μ M D-セリン、さまざまな濃度の変化を測定しました。エラーバーは標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: リガンド結合サイト拮抗筋の活動を特徴づけるします。324 はで示された NR1/NR2A のカルシウム フラックス測定により特徴づけられた所定の最適なリガンドとサブユニット式のグルタミン酸塩結合部位の拮抗薬、NVP-AAM077 とグリシン結合サイトの拮抗筋、L701、効果を使用して濃度。それぞれ NVP AAM077 と L701、324、添加後グリシンやグルタミン酸他の配位子の飽和濃度 (100 μ M) の存在下で、EC80 に等しい濃度で使用されました。エラーバーは標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この試金の成功は、使用される HEK 細胞の状態によって大きく異なります。細胞の急激な増加を受けて、低通過数を使用する必要があります。このアッセイ多く転送と警告を使用して、ソリューションの追加はその結果で高い精度を確保します。化合物およびその他のすべての試薬の濃度は、エラーを最小限に抑えるためにクロス チェックもする必要があります。アッセイバッファー カルシウム フラックスの試金のための携帯メディアを交換する際、セルを切断しないでください、プレートが優しく傾斜する必要があります。最後に、このプロトコルではポリ-D-リジン コーティング プレートの使用セルのプレートに添付ファイルが増加します。
NMDAR の表現の違い、ウイルスの伝達の時に通路番号と HEK293 細胞の適性に応じてサブユニット式に必要な量の可能性があります。また、バキュロは 6 ヶ月から 1 年まで短い貯蔵寿命を持ちます。したがって、ウイルスの品質は、この試金のための重要なパラメーターです。標準蛍光抗体法は、検出および表現のレベルとさらに実験24前に NMDAR のユニットの局在を確認する使用できます。他の細胞は、このプロトコルを使用する NMDA 受容体の研究に使用できます。しかし、寛容と、バキュロ ウイルスを用いた NMDARs の表現のプロトコルを進める前に確認が必要そうしないと、予期しない結果が生じる。また、バキュロ ウイルス発現29の効力を増大するトポイソメラーゼ II 阻害剤などの化合物が報告されています。これらの選択肢をテストし、ユーザーの好みに合わせて最適化することができます。
元のセル型は異なる細胞型の生物学的過程の研究は、科学的なコミュニティの中で問題を提起します。この試金の制限は、イオン型グルタミン酸受容体、NMDAR を研究するモデル システムとして腎細胞 (HEK 293) の使用です。HEK の細胞は、彼らの脱分極膜電位の脱分極のニューロンのようなために使用されました。また、私たちの補足調査によって NMDARs 脳と私たちのモデルの類似性を確認します。すべてが私たちモデル22,23 で確認された GNE 8324 など正のアロステリック変調、イフェンプロジルなど否定的な変調器と拮抗、ケタミンなどの活動だけでなく、NMDAR の電圧依存性、24。また、NR1 と NR2A のサブユニットのウイルスの量を調整する当社の能力は、最適な機能発現レベルを保証します。
低効率、高コストと最小限の成功結果のため、個々 の受容体およびそれらのユニークな薬理学の評価は現在低スループット手動パッチ ・ クランプの試金22,23においてください。一方、応需型主要な障害、まま安定を使用して transfected セル、機能 NMDARs の過剰発現はメディア18にリリースされているリガンド (グルタミン酸とグリシン/D-セリン) による細胞に有害なためです。強力な代替として我々 の分析表現を使用バキュロ ウイルス媒介機能 NMDARs の毒性を克服し、受容体の急速な滴定の式が得られます。チャネル遮断薬の粘着性の性質によって限定するのではなくこの試金も活用弱いリガンド結合部位の拮抗薬。これらの拮抗薬はメディアで内因性リガンドと競う、リガンド結合部位を保護します。したがって、アンタゴニストのウォッシュ後グルタミン酸・ グリシン/D セリン結合部位の外追加配位子への感度が復元されます。
ターゲットや NMDAR の発現と機能の新規調節因子を特徴づける、CRISPR など分子生物学の最近の進歩と組み合わせて、この試金。同時に、この試金は、可能性があります直接または間接的はそれにより遺伝と小さな分子ベース画面との互換性を提供する安定したセルラインを生成することがなく NMDAR の活動を調節する小分子を特定しやすくなります。
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Disclosures
著者があるない利益相反とは何を開示します。
Acknowledgments
著者は、郵便局バカロレア学者プログラムそしてノバルティス バイオメディカル研究本研究を資金調達のための全体として感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
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