Summary
El objetivo de este protocolo es facilitar el estudio de receptores de NMDA (NMDAR) a una escala mayor y permitir el examen de los efectos moduladores de pequeñas moléculas y sus aplicaciones terapéuticas.
Abstract
Los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA) (NMDAR) se clasifican como receptores de glutamato ionotrópicos y tienen un papel crítico en el aprendizaje y la memoria. Mal funcionamiento NMDAR, expresado como sea sobre - o debajo - activity causada por mutaciones, expresión alterada, tráfico y localización, puede contribuir a numerosas enfermedades, especialmente en el sistema nervioso central. Por lo tanto, entender la biología del receptor, así como facilitar el descubrimiento de compuestos y moléculas pequeñas es crucial en los esfuerzos para combatir enfermedades neurológicas. Enfoques actuales del estudio de los receptores tienen limitaciones como bajo rendimiento, alto costo y la incapacidad para el estudio de sus capacidades funcionales debido a la necesaria presencia de bloqueadores de los canales para evitar la excitotoxicidad mediada de NMDAR. Además, los sistemas de análisis existentes son sensibles a la estimulación por el glutamato solo y carecen de sensibilidad a la estimulación por glicina, otro ligando co del NMDAR. Presentamos el primer ensayo de placa de base con la energía de alto rendimiento para el estudio de un receptor NMDA con sensibilidad a ligandos Co, glutamato y D-serina/glicina. Este enfoque permite el estudio de las diferentes composiciones de subunidad NMDAR y estudios funcionales del receptor en modos sensibles a glutamato y glicina. Además, el método no requiere la presencia de inhibidores durante las mediciones. Los efectos de los moduladores alostéricos positivos y negativos se pueden detectar con este ensayo y la farmacología conocida de NMDAR ha sido replicada en nuestro sistema. Esta técnica supera las limitaciones de los métodos existentes y es económica. Creemos que esta nueva técnica acelerará el descubrimiento de terapias para patologías de NMDAR-mediada.
Introduction
Con los avances actuales en la medicina, la esperanza de vida ha aumentado significativamente; sin embargo, tiene tan la prevalencia de enfermedades relacionadas con la edad. Enfermedades del sistema nervioso central (SNC) tales como esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer y de Parkinson, entre otros, no son la excepción y se han proyectado para aumentar durante el próximo decenio1, 2 , 3. el mal funcionamiento de receptores de glutamato ionotrópicos conocido como receptores N-metil-D-Aspartato (NMDAR) se ha relacionado con la enfermedad de Alzheimer, esquizofrenia, lesión cerebral traumática, accidente cerebrovascular, diabetes y glaucoma entre otros, que garantiza la necesidad de estudiar su biología para el desarrollo de terapias eficaces, modificadores de la enfermedad4,5,6,7.
NMDARs se componen de cuatro monómeros o subunidades4,8,9. La composición estructural de lo NMDAR muestra variabilidad regional y de desarrollo en el cerebro de7,10. NMDARs están implicados en la plasticidad sináptica, la cognición y la generación de los ritmos de respiración y locomoción11,12,13. Como un canal voltaje-bloqueado, es en gran parte no conductoras en el potencial de membrana de reposo (-70 mV) y es bloqueado por magnesio para evitar la penetración de los iones. El canal es activado por la Unión de dos ligandos, glutamato y glicina/D-serina y una simultánea despolarización en la membrana sináptica mediada por receptores AMPA, otra subclase de receptores de glutamato ionotrópicos. La despolarización elimina el bloqueo de magnesio de NMDAR, permitiendo la afluencia de cationes, particularmente calcio14,15,16. A pesar de que la activación de NMDAR es esencial para la supervivencia de la célula, activación excesiva puede conducir a la célula muerte17,18,19 por excitotoxicidad. Esto, además de la compleja naturaleza de los receptores, hace difícil realizar estudios necesarios para el desarrollo de terapias efectivas.
Se han desarrollado diferentes métodos para estudiar el NMDAR. Sin embargo, cada uno tiene acompañamiento de advertencias. Por ejemplo, una técnica ampliamente utilizada es un ensayo basado en la fluorescencia que mide los cambios de NMDAR mediada por calcio intracelular en una línea celular estable bajo el control de un promotor inducible por tetraciclina (Tet-en)20. Sin embargo, en este sistema, las concentraciones de supramaximal de ligandos que se necesitan y el requisito de que los inhibidores de NMDAR están presentes durante la medición es casi imposible detectar la actividad del antagonista competitivo. En otros sistemas similares, la expresión del receptor funcional de causa toxicidad, requiriendo bloqueadores de los canales tales como ketamina21,22 para preservar los cultivos celulares. Estos bloqueadores de los canales se sientan en el corazón del receptor y son difíciles de lavar, sobre todo en un formato basado en la placa, para que interfieran con los estudios funcionales del receptor. Finalmente, en medidas electrofisiológicas como fijación con abrazadera del remiendo, hay limitado rendimiento, y estudios de gran escala son muy caro23. No obstante, los sistemas anteriores son insensibles a la estimulación de la glicina; por lo tanto, estudiando la actividad dependiente de la glicina de la NMDAR se convierte en un reto.
Aquí, describimos un nuevo enfoque para el estudio de NMDAR que supera las limitaciones discutidas. Nuestra técnica aprovecha el sistema de expresión de baculovirus para expresar el receptor a nivel funcional con una relación óptima de las subunidades en tan poco como 16 horas. Además, el uso de baculovirus permite un enfoque simple y combinatorio, que proporciona una caracterización amplia de los distintos subtipos NMDAR recombinantes. A diferencia de otros ensayos, este Protocolo no requiere bloqueadores de los canales por el uso de antagonistas débiles. Ventaja más fuerte del método es que lavado después de la débil antagonista, el receptor es sensible a la modulación de los sitios individuales de glicina y glutamato enlace además de doble modulación de D/glicina-serina y glutamato-ligando sitios. El ensayo recapitula conocido farmacología del receptor NMDAR y los efectos de sus conocidos moduladores positivos y negativos. Finalmente, la generación de este ensayo celular en vitro supera la toxicidad celular causada por la afluencia excesiva de calcio y permite estudios funcionales del receptor de la manera un alto rendimiento, que puede acelerar descubrimientos de moduladores NMDAR en Estados de enfermedad.
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Protocol
1. preparación de las células
Nota: Este protocolo, incluyendo la generación de datos, utiliza las células HEK293 transduced con un baculovirus codificación NR1 y NR2A las células.
- Semillas el número apropiado de células HEK293 y añada el virus NR1 y NR2A las concentraciones finales apropiadas (1.00 μl cada una). Para una placa de 384 pozos, utilice 10.000 células/pozo en un volumen final de 30 μl.
- Como alternativa, las células HEK293-NR1-NR2A en el número de células adecuado y el volumen (para una placa de 384 pozos, uso 10.000 células/pozo en un volumen final de 30 μL) de la semilla. Añadir tetraciclina en una concentración de 2 μg/mL inducen la expresión de NR2A y agregar la protección compuesta (100 μm MDL105, 519 o 5 μm CGP07066724).
- Nota: El baculovirus codificación NR1 y N2 deben tener un título aproximado entre 5 x 109 - 10 x 109 infecciosas unidad por mililitro24.
2. medición de la actividad del receptor de NMDA
- Preparar una placa de 384 pocillos con células HEK293 transduced con células HEK293-NR1-NR2A NR1/N2 en presencia de cualquier compuesto de protección. Utilice un fondo claro, marco negro, placa revestida poly-D-lisina.
Nota: Protección con 100 μm MDL105, 519 se utiliza para conferir sensibilidad a glicina, mientras que 5 μm CGP070667 se utiliza para conferir sensibilidad al glutamato. - Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO2 para 16 horas (noche).
- Retire la placa de la incubadora y deseche suavemente los medios de comunicación celular, retardando la placa de los bancos sobre un contenedor de residuos biológicos compatibles. Golpear suavemente la placa sobre papel absorbente para limpiar los medios de comunicación fuera de los bordes de la placa y drenar cualquier medio restante.
- Para preparar el tinte calcium6 solubilización de un frasco de tintura de calcium6 (1 tamaño de la placa) en 10 mL de tampón de incubación (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, probenecid 1 mM). Incube la placa durante 2 horas a 37 ° C y 5% CO2.
- Retire la placa de la incubadora y dejar que las células a ajustar a la temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Verter suavemente el tinte de calcium6 como se describe en el paso 2.3 y añadir 30 μl de tampón de ensayo (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, probenecid 1 mM).
- Repita el paso 2.6 dos veces para un total de 3 lavados. Dejar 30 μl de tampón de ensayo en las células después del último lavado.
- Que las células reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Preparar la placa de ligando, haciendo un caldo 4 veces de 400 μm glicina y el glutamato 400 μm (concentración final de 100 μm, concentración óptima de ligandos que se determinará como se describe a continuación). Transferencia de un mínimo de 25 μl del stock de ligando en una placa de 384 pocillos V-inferior.
- Cargue la placa celular y placa de ligando en la FDSS (sistema de detección de drogas funcional).
- Medir la fluorescencia basal (Fo) de la placa celular durante 30 segundos. Transferir 10 μl de la acción del ligando en la placa de la célula usando la función dispensadora FDSS y mida el flujo de calcio mediante el registro de fluorescencia calcium6-colorante durante 5 minutos.
- Calcular el cociente de la fluorescencia máxima dividiendo la fluorescencia máxima obtenida por la fluorescencia basal (Fmáx/fo).
3. optimización de los niveles de expresión de NMDAR
- Para determinar la cantidad óptima de baculovirus para utilizar, realizar una titulación de virus NR1 y NR2A. Prepare una placa de 384 pocillos con células HEK293 (recomendación de 10.000 células/pozo, 30 μl de medios de comunicación) e incluyen los compuestos de protección tal como se describe en el paso 2.1.
- Añadir cantidades variables del virus NR1 en filas diferentes de la placa (por ejemplo: agregar 0 μL 2 μl, 1 μl, 0,5 μl, 0.25 μL en filas A-E, respectivamente). Agregar duplicados para la exactitud de los datos.
- Añadir cantidades variables del virus NR2A en diferentes columnas de la placa (por ejemplo: agregar 0 μL 2 μl, 1 μl, 0,5 μl, 0.25 μL en filas A-E, respectivamente). Agregar duplicados para la exactitud de los datos.
- Incubar la placa a 37 ° C y 5% CO2 para 16 horas (noche).
- Determinar la relación óptima y la cantidad de los virus de NR1/NR2A realizando una medición del flujo de calcio en la FDSS (véase arriba).
4. ligando titulación
- Preparar las células como se describe en el paso 2.3.
- Preparar diluciones de cada ligando en presencia de concentraciones (100 μm) se satura de otro ligando como una solución madre 4 veces. Por ejemplo: para una concentración de prueba final de 10 μm de glicina, prepare una solución stock de 40 μm de glicina como 400 μm glutamato.
- Proceder con la medición de la FDSS como se describe en el paso 2.11.
5. compuesto de prueba
- Preparar las células como se describe en el paso 1.
- Preparar la placa de ligando con una 5-fold acción de la concentración de ligando final en el tampón de ensayo.
- Preparar la placa de compuestos con el caldo 4 veces de la concentración final deseada de compuestos en el tampón de ensayo. Para una concentración final compuesta de 10 μm en el tampón de ensayo, preparar una solución stock de 40 μm.
- Mantener la concentración de dimetilsulfóxido (DMSO) constante a través de todas las muestras mediante la preparación de una dilución previa del compuesto en DMSO antes de la mayor dilución en el tampón de ensayo.
- Para una respuesta a la dosis del compuesto en el ensayo final que oscila entre 3 y 30 μm, preparar una dilución previa del compuesto en DMSO que van desde 1 mm a 10 mM. Diluir en el tampón de ensayo a la concentración de acción 4 veces. La concentración final del DMSO no debe exceder 0.5%.
Nota: Es aconsejable probar cada muestra en triplicado.
- Cargue la placa celular, ligando y compuesto en FDSS.
- Medir la fluorescencia basal durante 30 segundos.
- Añadir 10 μl de caldo compuesto y medir la fluorescencia durante 5 minutos.
- Añadir 10 μl del stock de ligando y medir la fluorescencia durante 5 minutos.
- Determinar la integral de la relación de fluorescencia calculando el área bajo la curva de los cocientes fluorescentes durante los últimos 5 minutos de la medida.
Nota: Alternativamente, el cociente máximo de fluorescencia después de la adición de ligandos puede utilizarse para el análisis.
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Representative Results
Antes de probar los efectos de moléculas pequeñas, uno debe determinar los niveles de expresión óptima de NMDARs, así como las concentraciones de ligando óptima. Como se describe, las células fueron sembradas a 10.000 células por pocillo en una placa de 384 pozos, HEK293 en presencia de 5 μm CGP060667, luego transduced con cantidades variables de NR1 y NR2A virus. Después de incubación durante la noche, inducida por el ligando calcio se midió flujo (figura 1). Los resultados de estos experimentos revelan la mejor cantidad y proporción de virus a utilizar para cada subunidad (figura 1, cuadro amarillo).
Una vez que se determinaron la cantidad óptima y el cociente para la transducción con el NR1 y NR2A, una titulación de ligando se realizó para determinar la concentración de ligando óptimo para la activación de NMDARs. Para lograr esto, uno de los ligandos Co fue agregado en concentraciones variables en fijos, saturando las concentraciones de otros ligando Co (figura 2A-2B). Resultados similares fueron obtenidos por otras combinaciones de la subunidad de NMDAR NR1/NR2B como NR1/NR2D (figura 2), demostrando la aplicabilidad del ensayo a otros miembros de la familia de NMDAR24. Después de determinar los niveles de expresión óptimo y las concentraciones de ligando, uno puede proceder con las pruebas de los efectos de los moduladores de NMDAR en el ensayo.
De acuerdo con informes publicados, este primer ensayo placa base para el estudio de NMDARs con sensibilidad a la glicina y el glutamato en gran escala reproduce datos sobre las propiedades conocidas de los NMDAR14,25,26. Aquí, utilizamos la actividad de dos compuestos, [(ácido R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic (NVP-AAM077), un antagonista del sitio de glutamato y [7-chloro-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) fenil-2 (H) quinolona] (L701, 324), un antagonista del sitio de glicina, para ejemplificar los resultados predichos del ensayo27,28 (figura 3). Finalmente, cada uno de ellos fue probado en el EC80 del respectivo ligando natural del sitio de Unión. Se espera que la reducción de las concentraciones de ligando para aumentar la potencia de los antagonistas, mientras que se espera que tengan ningún efecto sobre la potencia de los inhibidores no competitivos o bloqueadores de poros.
Figura 1: valoración de subunidades NR1 y NR2A. Diferentes volúmenes del virus que codifican subunidades NMDAR NR1 y NR2A se titulan para determinar la cantidad necesaria para una óptima actividad funcional del receptor. Se observó una proporción de 1:1 (v/v) NR1:NR2A como la relación óptima con 1 μl de cada uno (cuadro amarillo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: valoración de Ligand. A. en una concentración fija de glicina (100 μm), diversas concentraciones de glutamato se titulan y se registró el flujo de calcio. Barras de error representan la desviación estándar. B. glutamato se mantuvo en una concentración de 100 μm y se tituló contra diferentes concentraciones de D-serina y glicina, y se midió el flujo de calcio. No hubo ninguna diferencia significativa entre el flujo de calcio, D-serina y glicina. Barras de error representan la desviación estándar. C. células transduced con baculovirus NR1 y NR2D fueron estimuladas con cualquier glutamato de 100 μm y variando las concentraciones de D-serina o 100 μm D-serina y diferentes concentraciones de glutamato y calcio del flujo fue medido. Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: caracterización de la actividad de antagonista del ligando vinculante sitio. Utilizando las expresiones de ligando y subunidad óptima predeterminadas, los efectos de un antagonista del sitio de unión del glutamato, NVP-AAM077 y un antagonista del sitio obligatorio glicina, L701, 324 fueron caracterizados por el análisis de flujo de calcio de NR1/NR2A en el indicado concentraciones. Una concentración igual a la EC80 de glicina o el glutamato en presencia de la concentración de saturación (100 μm) de otro ligando fue utilizada después de la adición de NVP-AAM077 y L701, 324, respectivamente. Barras de error representan la desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El éxito de este ensayo depende en gran medida la salud de las células HEK. Las células que experimentan un crecimiento exponencial y con número de paso bajo se debe utilizar. Este análisis implica a muchos traslados y adiciones de soluciones, así que con cuidado asegurarán una mayor precisión en sus resultados. Concentraciones de compuestos y otros reactivos deben ser también revisado en cruz para minimizar los errores. Al sustituir los medios de comunicación de la célula con el tampón de ensayo para el análisis del flujo de calcio, la placa se debe inclinarse suavemente para que las células no se desmontan. Finalmente, el uso de placas cubiertas poly-D-lisina en este protocolo aumenta la fijación de las células de la placa.
Puede haber diferencias en la expresión de NMDAR y la cantidad de virus necesaria para la expresión de la subunidad según el paso número y aptitud de las células HEK293 en el momento de transducción de señales. También, el baculovirus tiene una corta vida de anaquel que van desde seis meses a un año. Por lo tanto, la calidad del virus es un parámetro importante para este análisis. Un análisis de la inmunofluorescencia estándar puede utilizarse para detectar y confirmar los niveles de expresión y localización de las unidades NMDAR antes otros experimentos24. Otras líneas celulares pueden ser utilizados para estudiar el receptor NMDA mediante este protocolo. Sin embargo, la tolerancia y la expresión de NMDARs usando el baculovirus deben confirmarse antes de proceder con el protocolo; de lo contrario, pueden ocurrir resultados inesperados. Además, compuestos como inhibidores de Topoisomerasa II se han divulgado para aumentar la eficacia de expresión de baculovirus29. Estas alternativas pueden ser probadas y optimizadas según las preferencias del usuario.
El estudio de los procesos biológicos en un tipo de células diferente que el tipo de célula original plantea preguntas dentro de la comunidad científica. Una limitación de este ensayo es el uso de líneas celulares de riñón (HEK 293) como un sistema modelo para el estudio de los receptores de glutamato ionotrópicos, NMDAR. Las células HEK fueron utilizadas debido a su potencial de membrana despolarizado similar a la de las neuronas despolarizadas. Además, la similitud entre NMDARs en el cerebro y en nuestro modelo es confirmada por los estudios complementarios. La actividad de moduladores alostéricos positivos como GNE-8324, moduladores negativos como ifenprodil y bloqueadores de los canales tales como ketamina, así como la dependencia de voltaje de NMDAR, fueron confirmados en nuestro modelo,22,23 ,24. También, nuestra capacidad para ajustar la cantidad de virus de las subunidades NR1 y NR2A asegura niveles de expresión funcional óptima.
Debido al bajo rendimiento, alto costo y resultado mínimo éxito, la caracterización de receptores individuales y su farmacología única se realizan actualmente en ensayos de rendimiento bajo manual patch-clamp22,23. Por otro lado, excitotoxicidad sigue siendo un obstáculo importante cuando uso estable transfected las células, porque la sobreexpresión de NMDARs funcionales son perjudiciales para las células debido a los ligandos (glutamato y glicina/D-serina) que son liberados en los medios de comunicación18. Como una alternativa más fuerte, nuestro análisis utiliza la expresión mediada por baculovirus de NMDARs funcionales, que supera la excitotoxicidad y dosificable, rápida expresión de los receptores de los rendimientos. En lugar de estar limitado por la naturaleza pegajosa de bloqueadores de los canales, este ensayo también aprovecha de antagonistas de sitios de unión a ligando débiles. Estos antagonistas compiten con ligandos endógenos en los medios de comunicación y protegen los sitios de unión a ligando. Por lo tanto, después de lavado de los antagonistas, sensibilidad a los ligandos agregado exógeno de los glutamato - glicina/serina-Unión D sitios y se restaura.
Este ensayo, combinado con los avances recientes en biología molecular como CRISPR, ayudará a destino y caracterizar nuevos reguladores de función y expresión de NMDAR. Al mismo tiempo, este análisis ayudará a identificar las moléculas pequeñas que pueden directamente o indirectamente modulan la actividad NMDAR sin la necesidad de generar líneas de células estables, proporcionando así compatibilidad con pantallas pequeñas y genética molécula-basados.
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Disclosures
Los autores tienen ningún conflicto de intereses y nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean dar las gracias a la oficina del programa de Post bachillerato académicos e institutos de Novartis para la investigación biomédica en su conjunto para la financiación de este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
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