Summary
המטרה של פרוטוקול זה נועד להקל על המחקר של קולטני NMDA (NMDAR) בקנה מידה גדול יותר, לאפשר הבחינה של תופעות modulatory של מולקולות קטנות ושימושיהם טיפולית.
Abstract
N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) קולטנים (NMDAR) מסווגים רצפטורים גלוטמט ionotropic ויש תפקידים חיוניים בלמידה ובזיכרון. תקלה NMDAR, מבוטא כמו גם נגמר - או תחת - activity נגרמת על ידי מוטציות, ביטוי שונה, סחר או לוקליזציה, יכול לתרום מחלות רבות, במיוחד במערכת העצבים המרכזית. לכן, הבנה ביולוגיה של הקולטן וכן הקלת הגילוי של תרכובות מולקולות קטנות הוא מכריע המאמצים המתמשכים כדי להתמודד עם מחלות נוירולוגיות. לגישות ללמוד את הקולטן יש מגבלות כולל תפוקה נמוכה, עלות גבוהה של חוסר היכולת ללמוד יכולותיו פונקציונלי בשל נוכחותם הכרחי של חוסמי ערוצים כדי למנוע excitotoxicity בתיווך NMDAR. בנוסף, המערכות assay קיימים רגישים לגירוי על ידי גלוטמט בלבד, חסרי רגישות גירוי על-ידי גליצין, ליגנד שיתוף אחרים של NMDAR. כאן, אנו מציגים וזמינותו הראשון המבוסס על צלחת עם תפוקה גבוהה כוח ללמוד על קולטן NMDA עם רגישות ליגנדים שיתוף, גלוטמט, D-סרין/גליצין. גישה זו מאפשרת לימוד יצירות שונות של יחידת משנה NMDAR ומאפשר לימודי פונקציונלי של הקולטן במצבי גליצין - ו/או רגישים גלוטמט. בנוסף, השיטה אינה דורשת הנוכחות של מעכבי במהלך המדידות. ניתן להבחין את השפעות חיוביות ושליליות מאפננים allosteric עם זה וזמינותו, פרמקולוגיה הידוע של NMDAR כוכבנו במערכת שלנו. טכניקה זו גוברת על המגבלות של שיטות קיימות והיא חסכונית. אנו מאמינים טכניקה חדשנית זו. נאיץ את הגילוי של טיפולים בתיווך NMDAR פתולוגיות.
Introduction
עם ההתקדמות הנוכחית ברפואה, אמנם תוחלת החיים עלתה באופן משמעותי; עם זאת, אז יש השכיחות של מחלות הקשורות לגיל. מחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כגון סכיזופרניה, נוירודגנרטיביות (ALS), מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, בין היתר, ללא יוצא מן הכלל, ההקרנות להגדיל מעל הבא העשור1, 2 , 3. לתפקודו של רצפטורים גלוטמט ionotropic המכונה קולטנים N-מתיל-D-אספרטט (NMDAR) נקשר מחלת אלצהיימר סכיזופרניה, פגיעה מוחית טראומטית, שבץ מוחי, סוכרת, גלאוקומה בין היתר, אשר מצדיק צריך ללמוד את הביולוגיה שלהם לפיתוח טיפולים יעילים, מחלות שינוי4,5,6,7.
NMDARs מורכבים ארבע מונומרים או subunits4,8,9. ההרכב מבנית של NMDAR מראה השתנות התפתחותית ואזוריים בתוך המוח ה-7,10. NMDARs מעורבים פלסטיות סינפטית, קוגניציה, הדור של מקצבים נשימה, גפיים11,12,13. כערוץ ממותגת מתח, זה בעיקר הלא-ניצוח ב נח קרומית אפשרית (-70 mV), חסומה על-ידי מגנזיום כדי למנוע הסתננות של יונים. הערוץ מופעל על-ידי האיגוד של ליגנדים שני, גלוטמט, גליצין/D-סרין, דפולריזציה בו זמנית ב קרום סינפטית מתווך על ידי אמפא רצפטורים, מחלקת נוספת של רצפטורים גלוטמט ionotropic. דפולריזציה הסרת חסימה מגנזיום של NMDAR, הפעלת זרם של קטיונים, בעיקר סידן14,15,16. למרות הפעלת NMDAR חיוני להישרדות תא, הפעלת יתר יכול לגרום לתא המוות17,18,19 דרך excitotoxicity. זה, בנוסף האופי המורכב של הקולטן, הופך מאתגרת כדי לבצע מחקרים הדרושים לפיתוח טיפולים יעילים.
שיטות שונות פותחו כדי ללמוד את NMDAR. עם זאת, לכל אחד יש ליווי אזהרות. לדוגמה, טכניקה אחת נפוץ הוא מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית assay המודד בתיווך NMDAR שינויים תאיים הסידן קו תא יציב תחת השליטה של טטרציקלין-inducible מקדם מכירות (ט-על)20. עם זאת, במערכת זו, supramaximal את ריכוזי ליגנדים הנדרשים הדרישה כי מעכבי NMDAR הן נוכח בזמן המדידה מקל כמעט בלתי אפשרי. לאתר הפעילות של אנטגוניסט תחרותי. במערכות דומות אחרות, הביטוי של הקולטן פונקציונלי גורמת רעילות, הדורשים חוסמי ערוצים כגון קטמין21,,22 , כדי לשמר על תרביות תאים. חוסמי ערוצים אלה לשבת בליבה של הקולטן, קשה לשטוף, במיוחד בתבנית המבוססת על צלחת, אז הם מפריעים מחקרים פונקציונלי של הקולטן. לבסוף, ב מדידות אלקטרופיזיולוגיות כגון תיקון מחבר חובק למעקה, יש תפוקה מוגבלת, מחקרים בקנה מידה גדול הם יקרים מאוד23. על אף האמור, המערכות הנ ל הן רגישות לגירוי גליצין; לפיכך, לומד גליצין תלוית פעילות של NMDAR הופך להיות אתגר.
כאן, אנו מתארים גישה מוזרה ללמוד NMDAR מתגבר על המגבלות שנדונו. הטכניקה שלנו הופך לרישית במערכת הביטוי baculovirus להביע את הקולטן ברמות פונקציונלי עם יחס מיטבי של subunits מעט ככל 16 שעות. יתר על כן, השימוש baculovirus מאפשר גישה קומבינטורית ופשוט, אשר מספק אפיון רחבה של סוגי NMDAR רקומביננטי המשנה ברורה. שלא כמו שאר מבחני, פרוטוקול זה אינו דורש חוסמי ערוצים בשל השימוש היריבים חלש. היתרון החזק ביותר של השיטה הזו שטיפה אחרי של אנטגוניסט חלש, הקולטן הוא רגיש אפנון של האתרים הבודדים גליצין ו גלוטמט-מחייב בנוסף אפנון כפול של גליצין/D-סרין והן גלוטמט ליגנד מחייב אתרים. וזמינותו recapitulates ידוע פרמקולוגיה של הקולטן NMDAR ואת ההשפעות של מאפננים הידוע שלה חיוביים ושליליים. לבסוף, מהדור הזה במבחנה הסלולר assay מתגבר על הסלולר רעילות הנגרמת על ידי זרם סידן מופרזת ומאפשר ללימודי פונקציונלי של הקולטן באופן תפוקה גבוהה, אשר יכולים להאיץ את התגליות של NMDAR מאפננים במצבי מחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תאים
הערה: פרוטוקול זה, לרבות נתונים הדור, משתמשת HEK293 תאים transduced עם baculovirus קידוד תאים NR1 ו- NR2A.
- זרע מספר מתאים של תאים HEK293 ולהוסיף את הוירוס NR1 ו/או NR2A בריכוזים הסופית המתאימה (1.00 µL כל אחד). צלחת 384-ובכן, לשימוש 10,000 תאים/טוב באמצעי אחסון הסופי של 30 µL.
- לחלופין, זרע HEK293-NR1-NR2A תאים תאים מתאים המספר, נפח (עבור צלחת 384-ובכן, שימוש 10,000 תאים/באר נפח סופי של 30 µL). להוסיף טטרציקלין בכל ריכוז של µg/mL 2 כדי לגרום NR2A ביטוי ולהוסיף את ההגנה המורכב (100 מיקרומטר MDL105, 519 או 5 מיקרומטר CGP07066724).
- הערה: baculovirus קידוד NR1 ו NR2 צריך כייל נוגדנים משוער של בין 5 x 109 - 10 x 109 יחידה זיהומיות לכל מיליליטר24.
2. מדידה של פעילות קולטן NMDA
- להכין צלחת 384-טוב עם HEK293 תאים transduced עם תאים NR1/NR2 או HEK293-NR1-NR2A בנוכחות או מתחם הגנתי. השתמש התחתון ברור, מסגרת שחורה, לוח מצופה פולי-D-ליזין.
הערה: הגנה עם 100 מיקרומטר MDL105, 519 משמש כדי להתייעץ רגישות גליצין, תוך 5 מיקרומטר CGP070667 משמש כדי להתייעץ רגישות גלוטמט. - תקופת דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2 של 16 שעות (לילה).
- הסר את הלוחית של החממה וזורקים בעדינות את המדיה הנייד על ידי האטה של היפוך את הצלחת מיכל biowaste תואם. טפח בעדינות על הלוחית מגבת נייר נקי התקשורת את קצות של הצלחת ומסננים כל התקשורת הנותרים.
- הכן calcium6-לצבוע באמצעות solubilizing בקבוקון אחד של צבע calcium6 (בגודל צלחת 1) ב- 10 מ"ל הדגירה מאגר (HBSS pH 7.5, 20 מ מ. HEPES, מ מ 1 MgCl2, probenecid 1 מ"מ). תקופת דגירה לצלחת של 2 שעות-CO 37 ° C ו-5%2.
- הסר את הלוחית של החממה ולתת את התאים להסתגל בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
- שופכים בעדינות את calcium6-הצבע כפי שמתואר בשלב 2.3 ולהוסיף µL 30 מאגר assay (HBSS pH 7.5, 20 מ מ. HEPES, מ מ 1.8 CaCl2, probenecid 1 מ"מ).
- חזור על שלב 2.6 פעמיים עבור סכום כולל של 3 מנקי. השאירו 30 µL assay מאגר על התאים לאחר לשטוף את האחרון.
- תן את התאים לנוח 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכן את הצלחת ליגנד על ידי מלאי 4-fold של 400 מיקרומטר גליצין ו- 400 גלוטמט מיקרומטר (הריכוז הסופי של 100 מיקרומטר; ריכוז אופטימלי של ליגנדים נקבע כמפורט להלן). העברת מינימום של 25 µL של ליגנד מניות לתוך צלחת 384-ובכן V-התחתון.
- טען את צלחת ליגנד וצלחת תא FDSS (פונקציונלי סמים הקרנת מערכת).
- למדוד את הבסיס קרינה פלואורסצנטית (Fo) של צלחת תא למשך 30 שניות. העברת µL 10 של המניה ליגנד לתוך הלוח התא באמצעות הפונקציה שחולק FDSS ולמדוד את שטף סידן על ידי הקלטה calcium6 צבעי זריחה במשך 5 דקות.
- לחשב את יחס פלורסצנטיות מקסימלי על ידי חלוקת של זריחה מקסימלי מתקבל על ידי ידי קרינה פלואורסצנטית בסיסית (Fמקסימום/Fo).
3. אופטימיזציה של רמות הביטוי NMDAR
- כדי לקבוע את כמות אופטימלית baculovirus להשתמש, בצע טיטור של וירוסים הן NR1 והן NR2A. להכין צלחת 384-ובכן עם תאים HEK293 (המלצה של 10,000 תאים/טוב, 30 µL של המדיה), כוללים את תרכובות הגנה כפי שמתואר בשלב 2.1.
- להוסיף כמויות משתנות של הנגיף NR1 בשורות שונות של הצלחת (לדוגמה: להוסיף 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0.5 µL, 0.25 µL בשורות A-E בהתאמה). הוסף פריטים כפולים על דיוק הנתונים.
- להוסיף כמויות משתנות של הנגיף NR2A בעמודות שונות של הצלחת (לדוגמה: להוסיף 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0.5 µL, 0.25 µL בשורות A-E בהתאמה). הוסף פריטים כפולים על דיוק הנתונים.
- תקופת דגירה לצלחת-CO 37 ° C ו-5%2 של 16 שעות (לילה).
- לקבוע את יחס אופטימלי והכמות של וירוסים NR1 ו- NR2A על ידי ביצוע מדידה השטף סידן FDSS (ראה לעיל).
4. ליגנד טיטור
- הכינו את התאים כפי שמתואר בשלב 2.3.
- להכין דילולים של כל ליגנד בנוכחות קולח ריכוזי (100 מיקרומטר) של ליגנד אחרים כמו פתרון מניות 4-fold. לדוגמה: עבור ריכוז המבחן האחרון 10 מיקרומטר של גליצין, להכין פתרון מיקרומטר 40 מניות של גליצין כולל 400 גלוטמט מיקרומטר.
- להמשיך עם מדידה FDSS כפי שמתואר בשלב 2.11.
5. מתחם בדיקות
- הכינו את התאים כפי שמתואר בשלב 1.
- הכינו את הצלחת ליגנד עם מלאי 5-fold של ליגנד הסופי ריכוז במאגר וזמינותו.
- הכינו את הצלחת תרכובות עם התבואה 4-fold ריכוז הסופי הרצוי של תרכובות במאגר וזמינותו. עבור ריכוז במתחם הסופי של 10 מיקרומטר במאגר assay, להכין פתרון מניות 40 מיקרומטר.
- לשמור את הריכוז של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) קבוע בכל הדוגמאות על-ידי הכנת לדילול מראש מתחם דימתיל סולפוקסיד לפני דילול נוסף למאגר וזמינותו.
- לתגובה במינון של המתחם ב הסופית assay הנעים בין 3 ל 30 מיקרומטר, להכין מראש לדילול של המתחם ב דימתיל סולפוקסיד בין 1 ל 10 מ מ. לדלל אותם במאגר assay לריכוז מניות 4-fold. ריכוז דימתיל סולפוקסיד הסופי לא יעלה על 0.5%.
הערה: מומלץ לבדוק כל מדגם triplicates.
- לטעון של ליגנד, מתחם ו תא צלחת לתוך FDSS.
- למדוד את פלורסצנטיות בסיסית למשך 30 שניות.
- להוסיף 10 µL של מניות מתחם ולמדוד את זריחה במשך 5 דקות.
- להוסיף 10 µL של ליגנד מניות ולמדוד את זריחה במשך 5 דקות.
- לקבוע האינטגרל של היחס בין זריחה על-ידי חישוב השטח מתחת העקומה של היחסים פלורסנט במהלך 5 הדקות האחרונות של המדידה.
הערה: לחלופין, היחס מקסימלי של קרינה פלואורסצנטית לאחר תוספת ליגנד יכול לשמש לניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני בחינת השפעת מולקולות קטנות, אחד חייב לקבוע את רמות ביטוי אופטימלית של NMDARs, כמו גם ריכוז אופטימלי ליגנד. כפי שתואר, HEK293 התאים היו נזרע ב 10,000 תאים לכל טוב בצלחת 384-ובכן, בנוכחות 5 מיקרומטר CGP060667, ואז transduced עם כמויות משתנות של NR1 ו- NR2A וירוסים. לאחר דגירה לילה, הנוצרות על-ידי ליגנד סידן נמדדה השטף (איור 1). התוצאות של ניסויים אלה חושפים את כמות הטוב ביותר ואת יחס של וירוס לשימוש עבור כל יחידה משנית (איור 1, תיבת צהוב).
פעם אחת כמות אופטימלית ואת יחס עבור התמרה חושית עם NR1 ו NR2A היו נחושים, טיטור ליגנד בוצעה כדי לקבוע ריכוז ליגנד אופטימלית עבור ההפעלה של NMDARs. כדי לעשות זאת, לאחד ליגנדים שיתוף נוספה בריכוזים שונים-קבוע, קולח ריכוזי ליגנד שיתוף אחרים (איור 2 א-2B). תוצאות דומות התקבלו עבור שילובים אחרים יחידת משנה של NMDAR כגון NR1/NR2B NR1/NR2D (איור 2C), הממחיש את הישימות של וזמינותו-בני משפחה אחרים NMDAR24. לאחר קביעת רמות הביטוי אופטימלית וריכוזי ליגנד, אחד יכול להמשיך עם בחינת השפעת NMDAR-מאפננים ב וזמינותו.
בקנה אחד עם דיווחים שפורסמו, זה הראשון המבוסס על צלחת assay ללמוד NMDARs עם רגישות גליצין והן גלוטמט בקנה מידה גדול מתרבה נתונים על המאפיינים הידועים של25,14,NMDAR26. כאן, אנו משתמשים הפעילות של שתי תרכובות, [(חומצה R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic (nvp ב- AAM077), אנטגוניסט האתר גלוטמט, ו [7-כלורו-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) phenyl-2 (H) quinolone] (L701, 324), אנטגוניסט האתר גליצין, כדי להדגים את תוצאות חזויות של27,assay28 (איור 3). לבסוף, כל המתחם נבחנה ב EC80 של ליגנד טבעי בהתאמה של אתר האיגוד. הפחתת ריכוז ליגנד צפויה להגדיל את העוצמה של היריבים, בזמן זה צפויה להיות השפעה על עוצמת מעכבי תחרותי או נקבובית חוסמי בטא.
איור 1: טיטור של subunits NR1, NR2A. אמצעי אחסון שונים של וירוס אשר קידוד subunits NMDAR NR1, NR2A, היו טיטרציה כדי לקבוע את הסכום הדרוש לפעילות פונקציונלי אופטימלי של הקולטן. יחס של 1:1 (v/v) NR1:NR2A נצפתה כיחס אופטימלית עם µL 1 של כל (תיבת צהוב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ליגנד טיטור. א ריכוז קבוע של גליצין (100 מיקרומטר), ריכוזים שונים של גלוטמט היו טיטרציה, השטף סידן נרשמה. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. גלוטמט ב' נשאר בבית ריכוז של 100 מיקרומטר היה טיטרציה נגד ריכוזים שונים של D-סרין, גליצין ו סידן השטף נמדדה. היה הבדל משמעותי למצוא בין שטף סידן D-סרין, גליצין. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. ג תאים transduced עם baculovirus NR1, NR2D היו מגורה עם גם גלוטמט 100 מיקרומטר, משתנה ריכוזים של D-סרין או 100 מיקרומטר D-סרין, משתנות ריכוזים של השטף גלוטמט וסידן נמדדה. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: אפיון פעילות של ליגנד איגוד האתר אנטגוניסט. באמצעות הבעות ליגנד, יחידת משנה אופטימלית מראש, את ההשפעות של אנטגוניסט אתר גלוטמט-קישור nvp ב- AAM077, אנטגוניסט באתר מחייב גליצין, L701, 324 התאפיינו וזמינותו השטף סידן על NR1/NR2A הצביעו ריכוזים. ריכוז שווה EC80 של גליצין או גלוטמט בנוכחות saturating ריכוז (100 מיקרומטר) ליגנד אחרים היה בשימוש לאחר תוספת של nvp ב- AAM077 L701, 324, בהתאמה. קווי שגיאה לייצג סטיית תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצלחת assay זו תלויה במידה רבה על בריאות התאים HEK בשימוש. תאים שעברו הצמיחה המעריכית, עם מספר נמוך המעבר אמור לשמש. Assay הזה כרוך העברות רבות, תוספות של פתרונות, זאת באמצעות התראה יבטיחו דיוק גבוה יותר בתוצאות שלה. ריכוזים של תרכובות וחומרים כל אחרים צריך להיות גם הצלבת למזער שגיאות. בעת החלפת המדיה הנייד עם המאגר assay וזמינותו השטף סידן, הלוח צריך להיות מוטה בעדינות כך התאים אל תנתק כעת. בסופו של דבר, השימוש של פולי-D-ליזין צלחות מצופה ב פרוטוקול זה מגדילה את קובץ מצורף של התאים לצלחת.
ייתכנו הבדלים בביטוי NMDAR ואת מידת וירוס לצורך ביטוי יחידת משנה בהתאם מספר המעבר ואת כושר של התאים HEK293 בזמנו של התמרה חושית. גם, baculovirus יש חיי מדף קצרים ועד שישה חודשים בשנה. לכן, האיכות של הווירוס הוא פרמטר חשוב עבור זה וזמינותו. Assay immunofluorescence סטנדרטי ניתן לזהות, לאשר את רמות הביטוי ולוקליזציה של יחידות NMDAR לפני ניסויים נוספים24. שורות תאים אחרים ניתן ללמוד את קולטן NMDA באמצעות פרוטוקול זה. עם זאת, סובלנות ועל ביטוי של NMDARs באמצעות baculovirus וחייבות להיות מאושרות לפני שתמשיך עם הפרוטוקול; אחרת, תוצאות בלתי צפויות עלולות להתרחש. בנוסף, תרכובות כגון מעכבי II טופואיזומראז דווחו כדי להגביר את היעילות של baculovirus ביטוי29. חלופות אלה יכול להיות נבדק, ממוטב לפי ההעדפות של המשתמש.
המחקר של תהליכים ביולוגיים בסוג התא שונה מאשר סוג התא המקורי מעלה שאלות בתוך הקהילה המדעית. מגבלה של assay זו הוא השימוש של שורות תאים כליות (HEK 293) כמערכת מודל ללמוד הקולטן גלוטמט ionotropic, NMDAR. תאים HEK שימשו בגלל הפוטנציאל הממברנה depolarized שלהם דומה לזה של נוירונים depolarized. בנוסף, הדמיון בין NMDARs במוח, במודל שלנו אושר על ידי לימודי השלמה שלנו. הפעילות של מאפננים allosteric חיוביים כגון GNE-8324, מאפננים שליליות כגון ifenprodil, חוסמי ערוצים כגון קטמין, כמו גם את התלות מתח NMDAR, אומתו כל שלנו דגם22,23 ,24. בנוסף, היכולת שלנו להתאים את כמות וירוס עבור subunits NR1 ו- NR2A מבטיח רמות הביטוי פונקציונלי אופטימלי.
בשל יעילות נמוכה, עלות גבוהה, תוצאות הצלחה מינימלית, אפיון קולטנים בודדים ו פרמקולוגיה הייחודי שלהם מתנהלים כעת בתפוקה נמוכה תיקון ידני-קלאמפ מבחני22,23. מצד שני, excitotoxicity נותר מכשול גדול בעת שימוש stably transfected תאים, כי ביטוי של NMDARs תפקודית מזיקים לתאים עקב ליגנדים (גלוטמט, גליצין/D-סרין) שפורסמו לתוך המדיה18. בתור חלופה חזקה, וזמינותו שלנו משתמשת ביטוי בתיווך baculovirus NMDARs תפקודית, אשר מתגבר על excitotoxicity ותשואות מהירה, titratable ביטוי של קולטני. ולא להיות מוגבל על-ידי הטבע דביק של חוסמי ערוצים, וזמינותו הזה גם מנצל היריבים של אתרים מחייב ליגנד חלש. היריבים האלה להתחרות ליגנדים אנדוגני בתקשורת ולהגן על האתרים מחייב ליגנד. לפיכך, לאחר שטיפה של היריבים, משוחזר רגישות exogenously-נוסף ליגנדים של גלוטמט - ו אתרי גליצין/D-סרין-קישור.
זה וזמינותו, בשילוב עם ההתקדמות האחרונה בביולוגיה מולקולרית כגון CRISPR, לסייע היעד, לאפיין את הרגולטורים הרומן של הביטוי NMDAR ותפקוד. במקביל, וזמינותו זו תסייע לזהות מולקולות קטנות עשוי במישרין או בעקיפין לווסת פעילות NMDAR ללא צורך ליצור שורות תאים יציבה, ובכך מספק תאימות עם גנטי - וקטנים מולקולה מבוססת מסכי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים ולא לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות סניף בגרות מלומדים תוכנית ומכונים נוברטיס למחקר ביורפואי בכללותה למימון מחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
