Summary
이 프로토콜의 목표는 더 큰 규모에 NMDA 수용 체 (NMDAR)의 연구를 촉진 하기 위하여 작은 분자의 modulatory 효력의 검사 및 치료 응용 프로그램입니다.
Abstract
N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체 (NMDAR) ionotropic 글루타민 산 염 수용 체로 분류 됩니다 있고 학습과 기억에 중요 한 역할. NMDAR 오작동, 표현으로 어느 이상-또는 아래-activity 돌연변이, 변경된 식, 인신 매매, 또는 지역화로 인 한 수많은 질병, 특히 중앙 신경 조직에에서 기여할 수 있다. 따라서, 화합물 및 작은 분자의 발견을 촉진 뿐만 아니라 이해 하는 수용 체의 생물학 신경 질환에 대처 하기 위해 지속적인 노력에서 결정적 이다. 수용 체를 공부 하 고 현재 접근 제한이 낮은 처리량, 높은 비용과 excitotoxicity NMDAR 중재를 방지 하기 위해 채널 차단제의 필요한 존재로 인해 그것의 기능적인 능력을 공부 하는 무 능력을 포함 하 여. 또한, 기존의 분석 결과 시스템만 조미료에 의해 자극에 민감한 고 글리신은 NMDAR의 다른 공동 ligand에 의해 자극 감도 부족. 여기, 선물이 공동 ligands, 조미료와 D-떠들고/글리신에 감도 NMDA 수용 체를 높은 처리량 힘을 가진 첫 번째 접시 기반 분석 결과. 이 이렇게 다른 NMDAR 소 단위 구성의 연구를 허용 하 고 글리신-또는 조미료에 민감한 모드에서 수용 체의 기능 연구를 허용. 또한, 방법 측정 동안 억제제의 존재를 필요 하지 않습니다. 이 분석 결과 함께 긍정적이 고 부정적인 allosteric 변조기의 효과 검출 될 수 있다 고 NMDAR의 알려진된 약리학 우리의 시스템에 복제 되었습니다. 이 기술은 기존 방법의 한계를 극복 하 고 비용 효율적입니다. 우리는이 새로운 기술은 NMDAR 중재 병 리에 대 한 치료의 발견을 가속화 될 것을 믿습니다.
Introduction
현재 의학의 발전, 수명 크게; 증가 했다 그러나, 그래서 나이 관련 된 질병의 유행이 하고있다. 질병 중앙 신경 조직 (CNS) 정신 분열 증, 루 경화 증 (ALS), 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 다른 사람, 사이 등의 예외가 있으며 향후 10 년간1, 증가 예상 2 , 3. N-메 틸-D-aspartate 수용 체 (NMDAR)로 알려진 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 고장 Alzheimer의 질병, 정신 분열 증, 외상 성 뇌 손상, 뇌졸중, 당뇨병, 및 보증, 녹 내장에 연결 되어있다는 효과적인, 질병 수정 요법4,5,,67의 개발에 대 한 그들의 생물학을 공부 해야 합니다.
NMDARs는 4 개의 단위체 또는 소 단위4,,89의 구성 됩니다. NMDAR의 구조 구성 뇌7,10발달 및 지역 다양성을 보여줍니다. NMDARs는 시 냅 스가 소성, 인식, 그리고 리듬의 세대에서 호흡, 운동11,,1213에서 포함 된다. 주로 휴식 막 잠재력에 비 전도성은 전압-개폐 통로 (-70 mV) 마그네슘 이온의 투과 방지에 의해 차단 됩니다. 채널 두 ligands, 조미료 및 글리신/D-떠들고의 바인딩에 의해 활성화 되 고 시 냅 스 막에 동시 도발은 AMPA 수용 체, ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 다른 서브 클래스에 의해 중재. 도발은 양이온, 특히 칼슘14,,1516의 유입 활성화 NMDAR의 마그네슘 막힘을 제거 합니다. NMDAR 활성화 세포 생존을 위해 필수적 이다, 비록 과도 한 활성화 세포 죽음17,,1819 excitotoxicity 통해 발생할 수 있습니다. 수용 체의 복잡 한 자연 뿐만 아니라 게 연구를 수행 하기 위해 도전 효과적인 치료 개발에 필요한.
다른 메서드는 NMDAR 연구 개발 되었습니다. 그러나, 각자 주의 동반 했다. 예를 들어 하나의 널리 사용 기법 항생물질을 유도할 수 있는 발기인 (Tet에)20의 통제 안정적인 셀 라인에서 세포내 칼슘에서 NMDAR 중재 변화를 측정 하는 형광 기반 분석 결과 이다. 그러나이 시스템에 필요한 ligands의 supramaximal 농도 NMDAR 억제제는 측정 중에 존재 하는 요구는 그것 경쟁 길 항 근의 활동을 검출 하기 거의 불가능. 다른 유사한 시스템에서 기능 수용 체의 식이 발생 독성, 셀 문화를 보존 하기 위해 마 취 제21,22 같은 채널 차단제를 요구 합니다. 이러한 채널 차단제는 수용 체의 코어에 앉아서 그들은 수용 체의 기능 연구 방해 플레이트 기반 포맷에 (서) 특히, 밖으로 세척 하기 어려운. 마지막으로, 패치 죄 같은 electrophysiological 측정에서 제한 된 처리량, 그리고 대규모 연구는 매우 비싼23. 도 불구 하 고, 위의 시스템은 민감한 글리신 자극; 따라서, 글리신 종속 활동은 NMDAR의 공부는 도전 된다.
여기, 우리가 NMDAR 논의 한계를 극복 하는 공부에 대 한 새로운 접근 방식을 설명 합니다. 우리의 기술은 작은 16 시간에는 소 단위의 최적의 비율로 기능 수준에서 수용 체를 표현 하는 잠재 식 시스템에 대문자로 바꿉니다. 또한, 잠재를 사용 하 여 고유 재조합 NMDAR의 광범위 한 특성을 제공 하는 간단 하 고 조합 접근 수 있습니다. 다른 분석 실험, 달리이 프로토콜은 약한 길 항 제를 사용 하는 채널 차단제를 필요 하지 않습니다. 방법의 가장 강한 장점은 약한 길 항 근의 그 후 유실, 수용 체는 글리신/D-떠들고와 조미료의 듀얼 변조 뿐만 아니라 개별 글리신 및 글루타민 산 염 바인딩 사이트의 ligand 바인딩 사이트입니다. 분석 결과 NMDAR 수용 체의 알려진된 약리학 및 그것의 알려진된 양수와 음수 변조기의 효과. 마지막으로,이 체 외에서 세포 분석 결과의 발생 과도 한 칼슘 유입으로 인 한 세포 독성을 극복 하 고 NMDAR 변조기의 발견을 가속 수 있습니다 높은 처리량 패션에 수용 체의 기능 연구에 대 한 허용 에 질병 상태.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1입니다. 셀의 준비
참고:이 프로토콜을 데이터 생성을 포함 하 여 잠재 인코딩 NR1 및 NR2A 세포로 불리고 HEK293 세포를 사용 합니다.
- HEK293 세포의 적절 한 수 씨 하 고 적절 한 최종 농도 (1.00 µ L 각)에서 NR1 / NR2A 바이러스를 추가 합니다. 384-잘 접시를 사용 하 여 10, 000 셀/잘 30 µ L의 최종 볼륨.
- 또는 적절 한 휴대폰 번호와 (384-잘 접시, 10, 000 사용 하 여 셀/잘 30 µ L의 최종 볼륨에서)에 대 한 볼륨 HEK293 NR1 NR2A 셀 씨. NR2A 식 유도 및 복합 보호 추가 2 µ g/mL의 농도에서 항생물질을 추가 (100 µ M MDL105, 519 또는 5 µ M CGP07066724).
- 참고: 인코딩 NR1, NR2 잠재 5 x 109 -10 x 109 밀리24당 감염 단위 사이 대략 titer가 있어야 합니다.
2입니다. NMDA 수용 체 활동의 측정
- HEK293 세포 중 보호 화합물 존재 NR1/NR2 또는 HEK293 NR1 NR2A 세포 transduced 384-잘 접시를 준비 합니다. 사용 하 여 명확한 바닥, 블랙 프레임, 폴 리-D-리 코팅된 판.
참고: 보호 100 µ M와 MDL105, 519 글리신, 5 µ M 동안에 감도 수 여 하는 CGP070667은 조미료에 감도 부여 하는 데 사용 됩니다. - 16 시간 (하룻밤) 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어.
- 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 부드럽게 호환 유기화학 컨테이너 접시를 뒤집어 감속에 의해 셀 미디어를 삭제. 부드럽게 접시의 가장자리에서 미디어를 청소 하 고 나머지 미디어 배수를 종이 타월에 접시를 누릅니다.
- 인큐베이션 버퍼 (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1mm probenecid) 10 mL에 calcium6 염료 (1 접시 크기)의 한 유리병 solubilizing로 calcium6-염료를 준비 합니다. 37 ° C, 5% CO2에서 2 시간 동안 접시를 품 어.
- 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 10 분 동안 실내 온도에 조정 하는 셀을 하자.
- 부드럽게 2.3 단계에서 설명한 대로 calcium6 염료를 쏟아 하 고 분석 결과 버퍼 (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1.8 m m CaCl2, 1mm probenecid)의 30 µ L를 추가 합니다.
- 3 세척의 2.6 두 번 총에 대 한 단계를 반복 합니다. 마지막 세척 후 분석 결과 버퍼의 30 µ L 셀에 둡니다.
- 실 온에서 5 분간 휴식 하는 셀을 하자.
- 400 µ M 글리신 및 400 µ M 조미료 (100 µ M의 최종 농도, 아래 설명 된 대로 결정 되는 ligands의 최적 농도) 4-fold 재고 하 여 리간드 접시를 준비 합니다. V-아래 384-잘 접시에 ligand 주식의 25 µ L의 최소 전송.
- Ligand 접시와 셀 플레이트 FDSS (기능성 약물 검사 시스템)로 로드 합니다.
- 30 초 동안 셀 플레이트의 기준선 형광 (Fo)를 측정 합니다. 5 분 동안 calcium6 염료 형광을 기록 하 여 FDSS 분배 기능과 측정 칼슘 플럭스를 사용 하 여 셀 접시에 ligand의 10 µ L를 전송 합니다.
- 기준선 형광 (F최대/Fo)에 의해 얻은 최대 형광을 나누어 최대한 형광 비율을 계산 합니다.
3입니다. NMDAR 식 레벨의 최적화
- 사용 하 여 잠재의 최적 크기를 결정, NR1 및 NR2A 바이러스의 적정을 수행 합니다. HEK293 세포 (10, 000 셀/잘의 추천, 미디어의 30 µ L) 384-잘 접시를 준비 하 고 단계 2.1에에서 설명 된 대로 보호 화합물 포함.
- 접시의 다른 행에 있는 NR1 바이러스의 다양 한 금액을 추가 (예: 행 A-E 0 µ L, 2 µ L, 1 µ L, 0.5 µ L, 0.25 µ L를 각각 추가). 데이터의 정확성에 대 한 중복을 추가 합니다.
- 접시의 다른 열에 NR2A 바이러스의 다양 한 금액을 추가 (예: 행 A-E 0 µ L, 2 µ L, 1 µ L, 0.5 µ L, 0.25 µ L를 각각 추가). 데이터의 정확성에 대 한 중복을 추가 합니다.
- 16 시간 (하룻밤) 37 ° C, 5% CO2 접시를 품 어.
- FDSS (위 참조)에 칼슘 플럭스 측정을 수행 하 여 최적의 비율과 NR1 및 NR2A 바이러스의 금액을 결정 합니다.
4. 리간드 적정
- 2.3 단계에서 설명한 대로 셀을 준비 합니다.
- 4-fold 재고 솔루션으로 다른 ligand의 농도 (100 µ M)를 흠뻑 젖 게 하는 면 전에 서 각 ligand의 희석을 준비 합니다. 예: 글리신의 10 µ M 최종 테스트 농도, 글리신 400 µ M 조미료 등의 40 µ M 재고 솔루션을 준비.
- FDSS 측정 단계 2.11에에서 설명 된 대로 진행 합니다.
5. 복합 테스트
- 1 단계에서 설명한 대로 셀을 준비 합니다.
- 분석 결과 버퍼에서 최종 ligand 농도의 5 재고 ligand 접시를 준비 합니다.
- 4-fold 재고 분석 결과 버퍼에서 화합물의 원하는 최종 농도의 화합물 접시를 준비 합니다. 분석 결과 버퍼에 10 µ M의 최종 화합물 농도, 40 µ M 재고 솔루션을 준비 합니다.
- 계속 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 농도 상수 모든 샘플에서 분석 결과 버퍼에 더 희석 하기 전에 DMSO에 화합물의 사전 희석을 준비 하 여.
- 최종 분석 결과 3 그리고 30 µ M 사이에서 화합물의 복용량 응답, 1에서 10 m m까지 DMSO에 화합물의 사전 희석을 준비 합니다. 4-fold 재고 농도 분석 결과 버퍼에 희석. DMSO의 최종 농도 0.5%를 넘지 말아야 한다.
참고: 그것은 triplicates에 각 샘플을 테스트 하 고 좋습니다.
- FDSS에 ligand, 화합물, 및 셀 접시를 로드 합니다.
- 30 초 동안 기준선 형광을 측정 합니다.
- 복합 주식의 10 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 형광을 측정.
- Ligand 주식의 10 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 형광을 측정.
- 측정의 마지막 5 분 동안 형광 비율의 곡선 아래의 영역을 계산 하 여 형광 비율의 전체를 확인 합니다.
참고: 또는, ligand 추가 후 형광의 비율을 최대한 사용할 수 있습니다 분석을 위해.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
작은 분자의 효과 테스트 하기 전에 하나 NMDARs 최적의 ligand 농도의 최적의 식 수준을 결정 해야 합니다. 설명, HEK293 세포 384-잘 접시에 잘 당 10000 셀에서 시드 했다 5 µ M의 CGP060667, 다음 불리고 NR1 및 NR2A의 다양 한 양의 바이러스. 인큐베이션 하룻밤, ligand 유도 된 칼슘 후 유량 측정 되었다 (그림 1). 이러한 실험의 결과 공개 최고의 수량 및 각 소 단위 (그림 1, 노란색 상자)를 사용 하는 바이러스의 비율.
일단 최적의 양과 NR1와 NR2A 변환에 대 한 비율 결정 했다, ligand 적정 NMDARs의 활성화를 위한 최적의 ligand 농도 결정 하기 위해 수행 되었다. 이 위해 공동 ligands의 하나 추가 되었습니다에서 다양 한 농도에서 고정, 다른 공동 ligand의 농도 포화 (그림 2A-2B). 유사한 결과 다른 NMDAR 가족24분석 결과 적용을 보여주는 NMDAR NR1/NR2B NR1/NR2D (그림 2C) 등의 다른 소 단위 조합에 대 한 획득 했다. 최적의 식 수준과 ligand의 농도 결정 한 후 하나는 분석 결과에 NMDAR 변조기의 효과 테스트 진행할 수 있다.
게시 된 보고서와 일치,이 첫 번째 접시 기반 분석 결과 글리신을 대규모 조미료 감도 NMDARs을 NMDAR14,,2526의 알려진된 속성에 데이터를 재현 합니다. 우리가 여기, 두 화합물의 활동을 사용 하 여 [(R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic 산 (NVP-AAM077), 조미료 사이트 적, 그리고 [7-클로-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) 페 닐-2 (H) quinolone] (L701, 324), 분석 결과27,28 (그림 3)의 예측된 결과 예증 하는 글리신 사이트 적. 마지막으로, 각 화합물 바인딩 사이트의 각각 자연 ligand의 EC80에서 시험 되었다. Ligand 농도의 감소는 비 경쟁 억제 물 또는 기 공 차단기의 힘에 영향을 주지 않습니다 것으로 예상 된다 하는 동안, 길 항 근의 힘을 증가 예정입니다.
그림 1: NR2A, NR1 소 단위의 적정. 인코딩할 NMDAR subunits NR1 및 NR2A 다른 양의 바이러스 수용 체의 최적의 기능 활동에 필요한 금액을 결정 하기 위해 적정 했다. NR1:NR2A 1:1 (v/v) 비 각 (노란색 상자)의 1 µ L 최적의 비율로 관찰 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Ligand 적정. A. 글리신 (100 µ M)의 농도 고정된, 다양 한 조미료 농도 적정 했다 고 칼슘 유출 기록 했다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. B. 조미료 100 µ M의 농도에서 남아 있었다 하 고 D-떠들고와 글리신의 다른 농도 대 한 적정 했다 칼슘 플럭스 측정 되었다. 글리신 및 D 떠들고 칼슘 유출 사이 발견 하는 상당한 차이가 있었습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. C. 셀 NR1 및 NR2D 잠재로 불리고 어느 100 µ M 조미료와 자극 되었다 하 고 떠들고 D의 농도 또는 조미료 및 칼슘 유출의 100 µ M D-떠들고와 다양 한 농도 변화를 측정 했다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: ligand 바인딩 사이트 길 항 근의 활동을 특성화. 미리 정해진된 최적의 리간드 및 소 단위 식, 조미료 바인딩 사이트 길 항 근, NVP-AAM077, 및 글리신 바인딩 사이트 적 L701, 효과 사용 하 여 324는 칼슘 유출 분석 결과 NR1/NR2A에 대 한 제시 된에 의해 특징 했다 농도입니다. 글리신 또는 다른 ligand의 saturating 농도 (100 µ M)의 존재는 조미료의 농도 EC80와 같은 각각의 추가 NVP AAM077와 L701, 324, 후 사용 되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 분석 결과의 성공 사용 HEK 세포의 건강에 따라 달라 집니다. 지 수 성장을 겪고 세포와 낮은 통로 번호와 함께 사용 해야 합니다. 이 분석 결과 많은 전송 고 추가 그렇게 주의 사용 하 여 솔루션의 결과에 더 높은 정확도 보장 합니다. 화합물 및 다른 모든 시 약의 농도 또한 오류를 최소화 하기 위해 크로스 체크 해야 합니다. 칼슘 유출 분석 결과 대 한 분석 결과 버퍼와 셀 미디어를 교체할 때 접시 해야 될 기울어져 부드럽게 되도록 셀을 분리 하지 않습니다. 마지막으로,이 프로토콜에 폴 리-D-리 코팅된 접시를 사용 하 여 접시에 셀 첨부 파일을 증가합니다.
NMDAR 식에 차이 변환 시 통로 번호와 HEK293 세포의 적합성에 따라 소 단위 식에 필요한 바이러스 양의 수 있습니다. 또한,는 잠재 짧은 수명 6 개월에서 1 년까지 있다. 따라서, 바이러스의 품질이 분석이 결과 대 한 중요 한 매개 변수입니다. 표준 면역 형광 분석 결과 감지 하 여 식 수준 및 지역화 추가 실험24전에 NMDAR 단위의 확인 사용할 수 있습니다. 다른 셀 라인 NMDA 수용 체가이 프로토콜을 사용 하 여 공부를 사용할 수 있습니다. 그러나, 관용과 표현의 NMDARs는 잠재를 사용 하 여 프로토콜;와 함께 진행 하기 전에 확인 되어야 합니다. 그렇지 않으면 예기치 않은 결과가 발생할 수 있습니다. 또한, 화합물 topoisomerase II 억제제 등 잠재 식29의 효능을 증가 보고 되었습니다. 이러한 대안 테스트 하 고 사용자의 기본 설정에 따라 최적화 된 수 있습니다.
원래 셀 유형 보다 다른 셀 형식에서 생물 학적 과정의 연구 질문 과학 지역 사회 내에서 발생합니다. 이 분석 결과의 한계는 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체, NMDAR 공부를 모델 시스템으로 신장 세포 라인 (HEK 293)의 사용을 이다. HEK 세포는 depolarized 신경의 그들의 depolarized 막 잠재력 때문에 사용 되었다. 또한, NMDARs 두뇌 및 우리의 모델 사이의 유사성은 우리의 보충 연구에 의해 확인 됩니다. GNE-8324 같은 긍정적인 allosteric 변조기, ifenprodil, 같은 부정적인 변조기와 케 타 민, 같은 채널 차단제의 활동 뿐만 아니라 전압 의존은 NMDAR의 모든 우리의 모델22,23 에서에서 확인 되었다 24. 또한, NR2A, NR1 소 단위에 대 한 바이러스의 양을 조정할 수 최적의 기능 식 수준을 보장 합니다.
낮은 효율, 높은 비용, 및 최소한의 성공 결과, 개별 수용 체와 그들의 독특한 약리학의 특성화는 현재 낮은 처리량 수동 패치 클램프 분석 실험22,23에서 실시 됩니다. 다른 한편으로, excitotoxicity 남아 있다 주요 장애물 때 안정적으로 사용 하 여 셀, 페 기능 NMDARs의 overexpression 셀18미디어 배포 되는 ligands (글루타민 산 염 그리고 글리신/D-떠들고) 때문에 유해 하기 때문에. 강한 대신, 우리의 분석 결과 잠재 중재 표현의 기능 NMDARs excitotoxicity 극복 하 고 빠른, titratable 식 수용 체의 생성을 사용 합니다. 채널 차단제의 끈끈한 특성에 의해 제한 되 고, 보다는 오히려이 분석 결과 또한 활용 약한 ligand 바인딩 사이트의 길 항 근의. 이 길 항이 근 미디어에서 내 인 성 ligands와 경쟁 하 고 ligand 바인딩 사이트를 보호 합니다. 따라서, 후에 길 항 근의 유실, 조미료 및 글리신/D-떠들고-바인딩 사이트의 것 추가 ligands에 감도 복원 됩니다.
이 분석 결과, CRISPR, 등 분자 생물학의 최근 발전을 함께 대상 도움이 되며 NMDAR 표현과 기능의 소설 레 귤 레이 터 특징. 동시에,이 분석 결과 수 있습니다 직접 또는 간접적으로 조절 함으로써 유전 및 작은 분자 기반 스크린 호환성을 제공 안정적인 셀 라인을 생성 하는 필요 없이 NMDAR 활동 작은 분자 식별 도움이 됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 충돌의 관심 및 공개 아무것도 있습니다.
Acknowledgments
저자는이 연구 자금에 대 한 전체 게시물 학위 학자 프로그램 사무실과 노바 티 스 연구소 생물 의학 연구에 대 한 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
