Summary
Målet med detta protokoll är att underlätta studiet av NMDA-receptorer (NMDAR) i större skala och låta granskningen av immunmodulerande effekter av små molekyler och deras terapeutiska tillämpningar.
Abstract
N-metyl-D-aspartat (NMDA)-receptorer (NMDAR) klassificeras som jonotropa glutamatreceptorer och har viktiga roller i inlärning och minne. NMDAR funktionsfel, uttryckt som antingen över - eller under - activity orsakade av mutationer, förändrad uttryck, människohandel eller lokalisering, kan bidra till många sjukdomar, särskilt i det centrala nervsystemet. Därför är förståelse receptorns biologi samt underlätta upptäckten av föreningar och små molekyler avgörande i pågående ansträngningar att bekämpa neurologiska sjukdomar. Nuvarande metoder att studera receptorn har begränsningar inklusive låg genomströmning, höga kostnader och oförmågan att studera dess funktionella förmågor på grund av kalciumantagonister nödvändigt att förhindra att NMDAR-medierad excitotoxicitet. Dessutom de befintliga systemen för analysen är känsliga för stimulering av glutamat bara och saknar känslighet för stimulering av glycin, annan samtidig liganden av NMDAR. Här presenterar vi den första plattan-baserad analysen med hög genomströmning makt att studera en NMDA-receptorn med känslighet för både Co ligander, glutamat och D-serin/glycin. Detta tillvägagångssätt kan studiet av olika NMDAR subenhet kompositioner och funktionella studier av receptorn i glycin- eller glutamat-känsliga lägen. Metoden kräver dessutom inte förekomsten av hämmare under mätningarna. Effekterna av positiva och negativa Allosteriska modulatorer kan upptäckas med denna analys och den kända farmakologin för NMDAR har replikerats i vårt system. Denna teknik övervinner begränsningarna i befintliga metoder och är kostnadseffektiv. Vi anser att denna nya teknik kommer att påskynda upptäckten av terapier för NMDAR-medierade sjukdomar.
Introduction
Med aktuella framsteg inom medicin, har medellivslängden ökat betydligt. dock så har förekomsten av åldersrelaterade sjukdomar. Sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS) som schizofreni, amyotrofisk lateralskleros (ALS), Alzheimers sjukdom och Parkinsons sjukdom, bland annat är inget undantag och har varit beräknas öka under nästa årtionde1, 2 , 3. fel på jonotropa glutamatreceptorer kallas N-metyl-D-aspartat receptorer (NMDAR) har kopplats till Alzheimers sjukdom, schizofreni, traumatisk hjärnskada, stroke, diabetes och glaukom bland annat som garanterar den behöver du studera deras biologi för utvecklingen av effektiva, sjukdomsmodifierande terapier4,5,6,7.
NMDARs består av fyra monomerer eller subenheter4,8,9. NMDAR strukturella sammansättning visar utvecklingsmässiga och regionala variationer inom de hjärna7,10. NMDARs är involverade i synaptisk plasticitet, kognition och genereringen av rytmer för andning och locomotion11,12,13. Som en spänningskänsliga kanal, är det till stor del icke-dirigering vid vila membranpotential (-70 mV) och blockeras av magnesium för att förhindra ytterligare genomträngning av joner. Kanalen aktiveras av bindningen av två ligander, glutamat och glycin/D-serine, och en samtidig depolarisation på synaptiska membranet medieras av AMPA-receptorer, en annan underklass av jonotropa glutamatreceptorer. Depolarisation tar bort magnesium blockeringen av de NMDAR, möjliggör inflödet av katjoner, särskilt kalcium14,15,16. Även om aktivering av NMDAR är avgörande för cellöverlevnad, kan Överdriven aktivering leda till cell död17,18,19 genom excitotoxicitet. Detta, gör utöver den komplicerade karaktären av receptorn, det utmanande för att utföra studier behövs för att utveckla effektiva behandlingar.
Olika metoder har utvecklats för att studera NMDAR. Var och en har dock kompletterande varningar. Exempelvis är en allmänt använd teknik en fluorescens-baserad analys som mäter NMDAR-medierad förändringar i intracellulära kalcium i en stabil cellinje under kontroll av en tetracyklin-inducerbara promotor (Tet-On)20. Dock i detta system gör supramaximal koncentrationerna av ligander som behövs och kravet att NMDAR-hämmare finns under mätningen det nästan omöjligt att upptäcka aktivitet av den kompetitiv antagonisten. I andra liknande system orsakar uttrycket av den funktionella receptorn toxicitet, som kräver kalciumantagonister såsom ketamin21,22 att bevara cellkulturer. Dessa kalciumantagonister sitta kärnan i receptorn och är svåra att tvätta ur, särskilt i en tallrik-baserat format, så de stör funktionella studier av receptorn. Slutligen i elektrofysiologiska mätningar såsom patch fastspänning, det finns begränsad genomströmning och storskaliga studier är mycket dyra23. Trots är de ovan system okänslig för glycin stimulering; Därför blir studerar glycin-beroende aktivitet av NMDAR en utmaning.
Här beskriver vi en ny metod för att studera NMDAR som övervinner de diskuterade begränsningarna. Vår teknik kapitaliserar på baculoviridae uttryck systemet uttrycka receptorn på funktionella nivåer med en optimal förhållandet av subunitsna i så lite som 16 timmar. Dessutom möjliggör användningen av baculoviridae en enkel och kombinatoriska strategi, vilket ger en bred karakterisering av distinkta rekombinant NMDAR undertyper. Till skillnad från andra analyser kräver detta protokoll inte kalciumantagonister på grund av användningen av svag antagonister. Metodens starkaste fördel är att efter bortspolning av svaga antagonist, receptorn är känslig för modulering av de enskilda glycin - och glutamat-bindande platserna utöver dubbla modulering av både glycin/D-serine och glutamat ligand-bindande platser. Analysens recapitulates känd farmakologi av NMDAR-receptorn och effekterna av dess kända positiva och negativa modulatorer. Slutligen, generation av denna i vitro cellulära analys övervinner cellulär toxicitet orsakad av överdriven kalcium tillströmning och möjliggör funktionella studier av receptorn i en hög genomströmning mode, som kan accelerera upptäckter av NMDAR modulatorer vid sjukdomstillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av celler
Obs: Detta protokoll, inklusive data generation, använder HEK293 celler sensorik med en baculoviridae kodning NR1 och NR2A celler.
- Utsäde lämpliga antalet HEK293 celler och lägger den NR1 eller NR2A viruset på de lämpliga slutliga koncentrationerna (1.00 µL varje). För en plattan med 384 brunnar, använda 10 000 celler per brunn i en slutlig volym av 30 µL.
- Alternativt, utsäde HEK293-NR1-NR2A celler på cell lämplig antalet och volymen (för en 384-väl plåt, använda 10 000 celler/bra i en slutlig volym av 30 µL). Lägg till tetracyklin vid en koncentration på 2 µg/mL inducerar NR2A uttryck och lägga till skydd förening (100 µM MDL105, 519 eller 5 µM CGP07066724).
- Obs: Den baculoviridae kodning NR1 och NR2 bör ha en ungefärlig titer mellan 5 x 109 - 10 x 109 smittsamma enhet per milliliter24.
2. mätning av NMDA-receptor aktivitet
- Förbereda en plattan med 384 brunnar med HEK293 celler sensorik med NR1/NR2 eller HEK293-NR1-NR2A celler i närvaro av antingen skyddande förening. Använd en tydlig botten, svart ram, poly-D-lysin belagda platta.
Obs: Skydd med 100 µM MDL105, 519 används för att ge känslighet för glycin, medan 5 µM CGP070667 används för att ge känslighet för glutamat. - Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2 i 16 timmar (över natten).
- Avlägsna plattan från inkubatorn och försiktigt kasta cell media genom att sakta vända plattan över en kompatibel bioavfall behållare. Knacka försiktigt på plattan på en pappershandduk till ren medier utanför kanterna på plattan och dränera eventuella återstående media.
- Förbered calcium6-färgen av solubilizing en injektionsflaska med calcium6 dye (1 tallrik storlek) i 10 mL inkubation buffert (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM probenecid). Inkubera plattan i 2 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
- Avlägsna plattan från inkubatorn och låt cellerna justera rumstemperatur i 10 minuter.
- Försiktigt hälla ut calcium6-färgämnet som beskrivs i steg 2,3 och tillsätt 30 µL analysbuffert (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, 1 mM probenecid).
- Upprepa steg 2,6 gånger för totalt 3 tvättar. Lämna 30 µL analysbuffert på cellerna efter den sista tvättningen.
- Låt cellerna vila i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Förbereda ligand plattan genom att göra en 4-faldig lager av 400 µM glycin och 400 µM glutamat (slutlig koncentration på 100 µM, optimala koncentrationen av ligander till bestämmas som beskrivs nedan). Överföra minst 25 µL av liganden lager i plattan med 384 brunnar en V-botten.
- Läsa in den ligand och cell plåt i FDSS (funktionell Drug Screening System).
- Mäta baslinjen fluorescensen (Fo) av cellen plattan i 30 sekunder. Över 10 µL av liganden beståndet i cell plattan med FDSS tubens funktion och mäta kalcium flux genom inspelning calcium6-dye fluorescens i 5 minuter.
- Beräkna maximal fluorescens förhållandet genom att dividera den maximal fluorescensen erhålls genom baslinjen fluorescensen (Fmaxfo).
3. optimering av NMDAR uttrycksnivåerna
- För att avgöra den optimala mängden baculoviridae att använda, utföra en titrering av både NR1 och NR2A virus. Förbereda en plattan med 384 brunnar med HEK293 celler (rekommendation av 10 000 celler per brunn, 30 µL av media) och omfattar föreningarna som skydd som beskrivs i steg 2.1.
- Lägg till varierande mängder NR1 viruset på olika rader i plattan (till exempel: Lägg till 2 µL, 0,5 µL, 1 µL, 0 µL, 0,25 µL i rader A-E respektive). Lägg till dubbletter för korrekta data.
- Lägg till varierande mängder av NR2A viruset i olika kolumner av plattan (till exempel: Lägg till 2 µL, 0,5 µL, 1 µL, 0 µL, 0,25 µL i rader A-E respektive). Lägg till dubbletter för korrekta data.
- Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2 i 16 timmar (över natten).
- Bestämma den optimala förhållandet och mängden NR1 och NR2A virus genom att utföra en kalcium flux mätning på FDSS (se ovan).
4. ligand titrering
- Förbereda cellerna som beskrivs i steg 2,3.
- Preparera utspädningar av varje ligand i närvaro av mättar koncentrationer (100 µM) av andra liganden som en 4-faldig stamlösning. Till exempel: för en 10 µM slutprov koncentration av glycin, förbereda en 40 µM stamlösningen av glycin inklusive 400 µM glutamat.
- Fortsätt med FDSS mätning som beskrivs i steg 2.11.
5. sammansatta testning
- Förbereda cellerna som beskrivs i steg 1.
- Förbereda ligand plattan med en 5 gånger lager av slutliga ligand koncentration i analysbuffert.
- Förbereda föreningar plattan med 4-faldig beståndet av önskad slutlig koncentration av föreningar i analysbuffert. För sammansatta koncentration på 10 µM i analysbuffert, förbereda en 40 µM stamlösningen.
- Hålla koncentrationen av dimetyl sulfoxid (DMSO) konstant över alla prover genom att förbereda en utspädning av föreningen i DMSO före ytterligare spädning i analysbuffert.
- För en dos-respons av föreningen i den slutliga analysen varierar mellan 3 och 30 µM, förbereda en utspädning av föreningen i DMSO som sträcker sig från 1 till 10 mM. Späd i analysbuffert i 4-faldig lager koncentrationen. Den slutliga koncentrationen av DMSO bör inte överstiga 0,5%.
Obs: Det rekommenderas att testa varje prov i exemplar.
- Ladda ligand, förening och cell platta i FDSS.
- Mäta baslinjen fluorescensen i 30 sekunder.
- Tillsätt 10 µL av sammansatta materiel och mäta fluorescensen i 5 minuter.
- Tillsätt 10 µL av liganden lager och mäta fluorescensen i 5 minuter.
- Bestämma integralen av fluorescens förhållandet genom att beräkna arean under kurvan för de fluorescerande nyckeltal under de sista 5 minuterna av mätningen.
Obs: Alternativt maximal förhållandet mellan fluorescens efter ligand tillägg kan användas för analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan du testar effekterna av små molekyler, måste man bestämma de optimala uttrycksnivåerna för NMDARs samt optimal ligand koncentrationerna. Som beskrivits, HEK293 celler var seedad på 10 000 celler per brunn i en plattan med 384 brunnar, i närvaro av 5 µM sensorik CGP060667, sedan med varierande mängder NR1 och NR2A virus. Efter inkubering över natten, ligand-inducerad kalcium flux mättes (figur 1). Resultaten av dessa experiment avslöjar bästa kvantitet och förhållandet mellan virus att använda för varje subenhet (figur 1, gul ruta).
När optimal kvantitet och förhållandet för transduktion med NR1 och NR2A bestämdes, utfördes en ligand titrering för att fastställa optimala ligand koncentrationen för aktivering av NMDARs. För att åstadkomma detta, en av de Co liganderna lades i varierande koncentrationer på fast, mättar koncentrationer av andra co liganden (figur 2A-2B). Liknande resultat erhölls för andra subenhet kombinationer av NMDAR såsom NR1/NR2B och NR1/NR2D (figur 2 c), visar analysens tillämplighet till andra NMDAR familjemedlemmar24. Efter att fastställa optimala nivåer och ligand koncentrationer, kan man fortsätta med testa effekterna av NMDAR-modulatorer i analysen.
Konsekvent med publicerade rapporter, denna första plattan-baserad analys att studera NMDARs med känslighet för både glycin och glutamat i stor skala återger data på de kända egenskaperna av NMDAR14,25,26. Här, vi använda aktiviteten av två föreningar, [(R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic syra (NVP-AAM077), en glutamat webbplats antagonist, och [7-kloro-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) fenyl-2 (H) kinolon] (L701, 324), en glycin webbplats antagonist, att exemplifiera förutspådda resultaten av analys27,28 (figur 3). Slutligen, testades varje förening på EC80 av den respektive naturliga liganden av bindningsstället. Minskning av liganden koncentrationer förväntas öka styrkan av antagonister, medan det förväntas inte påverka styrkan av icke-kompetitiva hämmare eller por-blockerare.
Figur 1: titrering av NR1 och NR2A subenheter. Olika volymer av virus som kodar NMDAR-subenheter NR1 och NR2A var titreras för att fastställa beloppet för optimal funktionell aktivitet av receptorn. Förhållandet 1:1 (v/v) NR1:NR2A observerades som det optimala förhållandet med 1 µL av varje (gul ruta). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Ligand titrering. A. i en fast koncentration av glycin (100 µM), varierande glutamat koncentrationer var titreras och kalcium flux spelades. Felstaplar representera standardavvikelse. B. glutamat återstod vid en koncentration på 100 µM och titrerades mot olika koncentrationer av D-serine och glycine, och kalcium flux mättes. Det var ingen signifikant skillnad mellan kalcium flux i glycin och i D-serine. Felstaplar representera standardavvikelse. C. celler sensorik med NR1 och NR2D baculoviridae stimuleras med antingen 100 µM glutamat och varierande koncentrationer av D-serin eller 100 µM D-serine och varierande koncentrationer av glutamat och kalcium flux mättes. Felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: karakterisera aktiviteten av liganden bindande webbplats antagonist. Med förutbestämd optimal ligand och subenhet uttrycken, effekterna av en glutamat-bindningsstället antagonist, NVP-AAM077 och en glycin-bindande webbplats antagonist, L701, präglades 324 av kalcium flux analysen för NR1/NR2A på indikerad koncentrationer. En koncentration som är lika med EC80 av glycin eller glutamat i närvaro av mättar koncentrationen (100 µM) av andra liganden användes efter tillsats av NVP-AAM077 och L701, 324, respektive. Felstaplar representera standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framgången för denna analys beror på hälsan hos de HEK celler används. Celler som genomgår exponentiell tillväxt och med låg passage nummer ska användas. Denna analys innebär många överföringar och tillägg av lösningar, så använder försiktighet kommer att säkerställa högre noggrannhet i dess resultat. Koncentrationer av föreningar och alla andra reagens bör även dubbelkontrollera att minimera fel. När du ersätter cellen media med Analysbuffert för kalcium flux analysen, bör plattan lutas försiktigt så att cellerna inte lossa. Slutligen ökar användningen av poly-D-lysin plattorna i detta protokoll fastsättning av cellerna till plattan.
Det kan finnas skillnader i NMDAR uttryck och mängden virus behövs för subenhet uttryck beroende på passagen nummer och fitness HEK293 celler vid tidpunkten för transduktion. Baculoviridae har också en kort hållbarhetstid som sträcker sig från sex månader till ett år. Kvaliteten på viruset är därför en viktig parameter för denna analys. En standard immunofluorescens-analysen kan användas för att upptäcka och bekräfta uttrycksnivåerna och lokalisering av NMDAR enheterna innan ytterligare experiment24. Andra cellinjer kan användas för att studera den NMDA-receptorn som använder detta protokoll. Men måste den tolerans och uttryck för NMDARs använda baculoviridae bekräftas innan du fortsätter med protokollet. Annars kan det uppstå oväntade resultat. Dessutom har föreningar såsom topoisomeras II-hämmare rapporterats öka effekten av baculoviridae uttryck29. Dessa alternativ kan testas och optimeras enligt användarens preferenser.
Att studera biologiska processer i en celltyp som är annorlunda än den ursprungliga celltypen väcker frågor inom det vetenskapliga samfundet. En begränsning av denna analys är användningen av njure cellinjer (HEK 293) som modellsystem studera jonotropa glutamat receptorn, NMDAR. HEK celler användes på grund av deras Aricebo membranet potential liknar Aricebo nervceller. Dessutom bekräftas likheten mellan NMDARs i hjärnan och i vår modell av vår kompletterande studier. Aktiviteten av positiva Allosteriska modulatorer såsom GNE-8324, negativa modulatorer såsom ifenprodil och kalciumantagonister såsom ketamin samt spänning beroendet av NMDAR, bekräftades alla i vår modell22,23 ,24. Dessutom säkerställer vår förmåga att justera mängden virus för NR1 och NR2A subunitsna optimala funktionella nivåer.
På grund av låg effektivitet, hög kostnad och minimal framgång resultatet genomförs för närvarande karakterisering av enskilda receptorer och deras unika farmakologi i låg genomströmning manuell patch-clamp analyser22,23. Däremot, excitotoxicitet är fortfarande ett stort hinder när med stabilt transfekterade celler, eftersom överuttryck av funktionella NMDARs är skadligt för celler på grund av de ligander (glutamat och glycin/D-serine) som släpps ut i media18. Som ett starkare alternativ använder våra assay baculoviridae-medierade uttryck för funktionella NMDARs, som övervinner excitotoxicitet och ger snabb, titrerbar uttryck av receptorer. Snarare än att begränsas av den klibbiga naturen av kalciumantagonister, utnyttjar denna analys också antagonister av svag ligand-bindande platser. Dessa antagonister konkurrera med endogena ligander i media och skydda de ligand-bindande platserna. Därför efter bortspolning av antagonists återställs känslighet för exogent-lade ligander av glutamat- och glycin/D-serine-bindningsställen.
Denna analys, kombinerat med senaste framstegen inom molekylärbiologi såsom CRISPR, hjälper mål och karakterisera roman regulatorer av NMDAR uttryck och funktion. Samtidigt, hjälper denna analys dig identifiera små molekyler som kan direkt eller indirekt modulera NMDAR aktivitet utan att generera stabila cellinjer, vilket ger kompatibilitet med genetiska- och liten molekyl-baserade skärmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter och något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka de postkontor studentexamen Scholars Program och Novartis forskningsinstitut för biomedicinsk forskning som helhet för att finansiera denna studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
