Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو تسهيل دراسة نمدا-مستقبلات (نمدار) على نطاق أوسع، والسماح بدراسة آثار مودولاتوري من الجزيئات الصغيرة وتطبيقاتها العلاجية.
Abstract
ن-الميثيل-د-اسبارتاتي مستقبلات (NMDA) (نمدار) تصنف مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك وأدوار حاسمة في التعلم والذاكرة. عطل نمدار، أعرب أما أكثر-أو وكيل-activity الناجم عن الطفرات، تغيير تعبير أو الاتجار أو التعريب، يمكن أن يسهم في العديد من الأمراض، وبخاصة في الجهاز العصبي المركزي. ولذلك، فهم البيولوجيا المستقبلات، فضلا عن تيسير اكتشاف المركبات والجزيئات الصغيرة حاسمة في الجهود المبذولة لمكافحة الأمراض العصبية. النهج الحالي لدراسة المستقبلات لها حدود بما في ذلك انخفاض الإنتاجية والتكلفة العالية وعدم القدرة على دراسة قدراته الفنية نظراً لوجود الضرورة محصرات قنوات للحيلولة دون وساطة نمدار اكسسيتوتوكسيسيتي. بالإضافة إلى ذلك، نظم التحليل القائمة حساسة للتحفيز قبل غلوتامات فقط وتفتقر إلى الحساسية للتحفيز التي جليكاين، يجند المشارك الأخرى نمدار. نقدم هنا، التحليل القائم على اللوحة الأولى مع السلطة الفائق للدراسة مستقبلات NMDA مع حساسية لكلا يغاندس المشارك وغلوتامات د-سيرين/جليكاين. هذا النهج يتيح دراسة التراكيب وحدة فرعية نمدار مختلفة ويسمح الدراسات الفنية للمستقبلات في أوضاع جليكاين-و/أو الحساسة غلوتامات. بالإضافة إلى ذلك، الطريقة لا تتطلب وجود مثبطات خلال القياسات. ويمكن الكشف عن آثار المغيرون allosteric الإيجابية والسلبية مع هذا التحليل والأدوية المعروفة من نمدار تكررت في نظامنا. هذا الأسلوب يتغلب على أوجه قصور الأساليب القائمة، وفعالة من حيث التكلفة. ونحن نعتقد أن هذه التقنية الجديدة سوف تعجل باكتشاف العلاجات للأمراض بوساطة نمدار.
Introduction
مع التقدم الحالي في الطب، ازداد متوسط العمر المتوقع إلى حد كبير؛ ومع ذلك، قد ذلك انتشار الأمراض المرتبطة بالسن. أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) مثل الفصام والتصلب العضلي الجانبي (المرض)، ومرض الزهايمر ومرض باركنسون، بين أمور أخرى، ليست استثناء، وقد كان المتوقع أن تزيد على مدى العقد القادم1، 2 , 3-خلل مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك المعروف باسم N-الميثيل-د-اسبارتاتي مستقبلات (نمدار) ارتبط بمرض الزهايمر والفصام وإصابات الدماغ الرضية، والسكتة الدماغية، والسكري والزرق بين أمور أخرى، مما يستلزم بحاجة إلى دراسة هذه الأحياء لتطوير علاجات فعالة، والمرض--تعديل4،5،،من67.
نمدارس تتألف من أربعة مونومرات أو الوحدات الفرعية4،،من89. ويبين تشكيل الهيكلية نمدار تقلب التنموية والإقليمية داخل المخ7،10. وتشارك نمدارس في اللدونة متشابك، والإدراك، وتوليد إيقاعات للتنفس والحركة11،،من1213. كقناة لبوابات الجهد، إلى حد كبير غير إجراء في استراحة غشاء المحتملة (-70 mV) وتم حظره بواسطة الماغنسيوم لمنع المزيد من تخلل للايونات. القناة يتم تفعيلها من خلال ربط يغاندس اثنين وغلوتامات جليكاين/د-سيرين، وتوسط depolarization متزامنة في الغشاء متشابك مستقبلات امبا، فئة فرعية أخرى من مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك. ديبولاريزيشن يزيل انسداد المغنيسيوم نمدار، تمكين تدفق الاتصالات، لا سيما الكالسيوم14،،من1516. على الرغم من أن تنشيط نمدار ضروري لبقاء الخلية، يمكن أن يؤدي التنشيط المفرط الخلية وفاة17،،من1819 من خلال اكسسيتوتوكسيسيتي. هذا، بالإضافة إلى الطبيعة المعقدة للمستقبلات، يجعل من تحدي لإجراء الدراسات اللازمة لتطوير علاجات فعالة.
وقد وضعت أساليب مختلفة لدراسة نمدار. ومع ذلك، كل واحد لديه المصاحبة للمحاذير. على سبيل المثال، إحدى التقنيات المستخدمة على نطاق واسع هو تحليل القائم على الأسفار الذي يقيس التغيرات نمدار بوساطة في الكالسيوم داخل الخلايا في خط خلية مستقرة تحت سيطرة مروج التتراسيكلين إيندوسيبلي (تيت في)20. ومع ذلك، في هذا النظام، سوبراماكسيمال وتركيزات يغاندس مطلوبة وشرط أن مثبطات نمدار موجودة أثناء أخذ القياس يجعل من المستحيل تقريبا للكشف عن النشاط لخصم تنافسية. وفي نظم أخرى مماثلة، يسبب التعبير عن مستقبلات الوظيفية السمية، التي تتطلب محصرات قنوات مثل الكيتامين21،22 الحفاظ على الثقافات الخلية. الجلوس في صميم المستقبلات هذه محصرات قنوات ويصعب أن يغسل بها، لا سيما في شكل لوحة، حيث تتداخل مع الدراسات الفنية للمستقبلات. وأخيراً، في القياسات الكهربية مثل لقط التصحيح، هناك إنتاجية محدودة، ودراسات واسعة النطاق، هي مكلفة جداً23. على الرغم من أنظمة المذكورة أعلاه حساسة لتحفيز جليكاين؛ ومن ثم دراسة جليكاين-تعتمد على نشاط نمدار يصبح تحديا.
وهنا يصف لنا نهجاً جديداً لدراسة نمدار أن يتغلب على القيود التي نوقشت. لدينا أسلوب يستغل نظام التعبير باكولوفيروس للتعبير عن مستقبلات على المستويات الوظيفية مع نسبة مثلى للوحدات الفرعية بأقل قدر من 16 ساعة. وعلاوة على ذلك، يتيح استخدام باكولوفيروس لنهج بسيط والتوافقي، الذي يوفر وصفاً واسعة من الأنواع الفرعية نمدار المؤتلف متميزة. وخلافا لفحوصات أخرى، لا يتطلب هذا البروتوكول محصرات قنوات بسبب استخدام الخصوم ضعيفة. ميزة أقوى للأسلوب تبييض بعد ذلك لخصم ضعيف، والمستقبلات حساسة لتحوير مواقع الربط جليكاين وغلوتامات الفردية بالإضافة إلى التعديل المزدوج جليكاين/د-سيرين وغلوتامات ملزم يجند المواقع. ويجمل المقايسة الأدوية المعروفة لمستقبلات نمدار وآثار به المغيرون إيجابية وسلبية معروفة. أخيرا، السمية الخلوية الناتجة عن تدفق الكالسيوم المفرط ويتغلب على توليد هذه في المختبر الخلوية المقايسة ويسمح للدراسات الفنية من المستقبلات في طريقة الفائق، التي يمكن أن تعجل باكتشافات المغيرون نمدار في الحالات المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الخلايا
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول، بما في ذلك توليد البيانات، الخلايا HEK293 ترانسدوسيد مع باكولوفيروس ترميز الخلايا NR1 و NR2A.
- البذور عدد مناسب من الخلايا HEK293 وإضافة NR1 و/أو NR2A الفيروس بتركيزات النهائية المناسبة (1.00 ميليلتر في كل). لوحة 384، حسنا، استخدم 10,000 الخلايا/البئر بحجم نهائي في 30 ميليلتر.
- وبدلاً من ذلك، بذور الخلايا HEK293-NR1-NR2A في الخلية المناسبة عدد وحجم (للوحة 384، حسنا، استخدام 10,000 الخلايا/البئر بحجم نهائي في 30 ميليلتر). إضافة التتراسيكلين بتركيز 2 ميكروغرام/مل للحث على التعبير NR2A وإضافة حماية مجمع (100 ميكرومتر MDL105، 5 ميكرومتر CGP07066724أو 519).
- ملاحظة: يجب أن يكون باكولوفيروس ترميز NR1 و NR2 عيار تقريبي بين 5 × 109 -10 × 109 وحدة المعدية كل المليلتر24.
2-قياس نشاط مستقبلات NMDA
- إعداد لوحة 384-جيدا مع الخلايا HEK293 ترانسدوسيد مع خلايا NR1/NR2 أو HEK293-NR1-NR2A حضور أما الحماية المركبة. استخدام أسفل واضحة، والإطار الأسود، لوحة بولي-د-يسين المغلفة.
ملاحظة: حماية مع 100 ميكرومتر ويستخدم MDL105، 519 يضفي حساسية جليكاين، بينما 5 ميكرومتر CGP070667 يستخدم لإضفاء التجاوب غلوتامات. - احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 16 ساعة (بين عشية وضحاها).
- إزالة اللوحة من الحاضنة ولطف تجاهل وسائل الإعلام الخلية بإبطاء تنقلب اللوحة حاوية بيوواستي متوافقة. اضغط برفق لوحة على منشفة ورقية لتنظيف وسائل الإعلام خارج حواف اللوحة واستنزاف أي وسائط الإعلام المتبقية.
- إعداد calcium6-الصبغة قبل سولوبيليزينج قنينة واحدة من صبغة calcium6 (حجم لوحة 1) في 10 مل من حضانة المخزن المؤقت (حبس pH 7.5، 20 مم حبيس، 1 مم مجكل2، البروبينسيد 1 مم). احتضان اللوحة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون2.
- إزالة اللوحة من الحاضنة والسماح للخلايا ضبط درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- صب بلطف calcium6 الصبغ كما هو موضح في الخطوة 2، 3 وإضافة 30 ميليلتر من المخزن المؤقت للفحص (حبس pH 7.5، 20 مم حبيس، 1.8 مم كاكل2، البروبينسيد 1 مم).
- كرر الخطوة 2.6 مرتين لمجموعة من يغسل 3. ترك 30 ميليلتر من المخزن المؤقت للفحص على الخلايا بعد الغسيل الأخير.
- السماح للخلايا الراحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد لوحة يجند بجعل مخزون النوبات من 400 ميكرون جليكاين و 400 ميكرون غلوتامات (التركيز النهائي من 100 ميكرومتر؛ تركيز الأمثل من يغاندس يحدد كما هو موضح أدناه). تحويل الحد أدنى من 25 ميليلتر من الأسهم يجند إلى الخامس-أسفل لوحة 384-جيدا.
- تحميل لوحة يجند ولوحة الخلية في فدس (نظام فحص المخدرات الوظيفية).
- قياس fluorescence خط الأساس (وس) من لوحة الخلية لمدة 30 ثانية. نقل 10 ميليلتر من رصيد يجند في لوحة الخلية باستخدام الدالة الاستغناء عن فدس وقياس تدفق الكالسيوم عن طريق تسجيل الأسفار صبغ calcium6 لمدة 5 دقائق.
- حساب نسبة الأسفار القصوى بتقسيم الأسفار القصوى التي حصل عليها الأسفار خط الأساس (و/Fماكسس).
3-الاستفادة المثلى مستويات التعبير نمدار
- لتحديد مقدار باكولوفيروس لاستخدام الأمثل، إجراء معايرة للفيروسات NR1 و NR2A على حد سواء. إعداد لوحة 384-جيدا مع خلايا HEK293 (التوصية 10,000 الخلايا/بئر، 30 ميليلتر لوسائط الإعلام) وتشمل مركبات الحماية كما هو موضح في الخطوة 2، 1.
- إضافة كميات مختلفة من الفيروس NR1 في صفوف مختلفة من اللوحة (على سبيل المثال: إضافة 0 ميليلتر، ميليلتر 2، 1 ميليلتر، 0.5 ميليلتر، ميليلتر 0.25 في صفوف ألف إلى هاء على التوالي). إضافة تكرارات لدقة البيانات.
- إضافة كميات مختلفة من الفيروس NR2A في أعمدة مختلفة من اللوحة (على سبيل المثال: إضافة 0 ميليلتر، ميليلتر 2، 1 ميليلتر، 0.5 ميليلتر، ميليلتر 0.25 في صفوف ألف إلى هاء على التوالي). إضافة تكرارات لدقة البيانات.
- احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 16 ساعة (بين عشية وضحاها).
- تحديد نسبة مثلى وكمية من الفيروسات NR1، و NR2A عن طريق إجراء قياس تدفق كالسيوم في فدس (انظر أعلاه).
4-يجند المعايرة
- إعداد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2، 3.
- إعداد تخفيف ليجند كل حضور تشبع تركيزات (100 ميكرومتر) من يجند الأخرى كحل أسهم النوبات. فعلى سبيل المثال: لتركيز اختبار نهائي 10 ميكرون من جليكاين، إعداد حل جليكاين بما في ذلك 400 ميكرون غلوتامات أسهم 40 ميكرومتر.
- المضي قدما بقياس فدس كما هو موضح في الخطوة 2.11.
5-مجمع اختبار
- إعداد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.
- إعداد لوحة يجند مع أسهم 5 إضعاف تركيز يجند النهائي في المخزن المؤقت للمقايسة.
- إعداد لوحة المركبات مع الأسهم النوبات التركيز النهائي المطلوب للمركبات في المخزن المؤقت للمقايسة. لتركيز مركب نهائي من 10 ميكرون في المخزن المؤقت للمقايسة، تعد حلاً أسهم 40 ميكرومتر.
- يبقى تركيز ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) ثابت عبر كافة العينات بإعداد إضعاف ما قبل المجمع في [دمس] قبل المزيد من إضعاف في المخزن المؤقت للمقايسة.
- لاستجابة جرعة من المجمع في التحليل النهائي تتراوح ما بين 3 و 30 ميكرون، وإعداد إضعاف ما قبل المجمع في [دمس] تتراوح بين 1 إلى 10 مم. إضعاف تلك الموجودة في المخزن المؤقت المقايسة لتركيز المخزون النوبات. التركيز [دمس] النهائي ينبغي أن لا تتجاوز 0.5%.
ملاحظة: من المستحسن اختبار كل عينة في تريبليكاتيس.
- تحميل يجند ومجمع، ولوحة الخلية في فدس.
- قياس fluorescence الأساس لمدة 30 ثانية.
- إضافة 10 ميليلتر من الأسهم المركب وقياس الأسفار لمدة 5 دقائق.
- إضافة 10 ميليلتر من الأسهم يجند وقياس الأسفار لمدة 5 دقائق.
- تحديد متكاملة لنسبة الأسفار عن طريق حساب المنطقة تحت المنحنى نسب الفلورسنت خلال آخر 5 دقائق للقياس.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، نسبة الأسفار بعد إضافة يجند القصوى يمكن استخدامها لتحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قبل اختبار آثار الجزيئات الصغيرة، واحد يجب أن تحدد مستويات التعبير الأمثل نمدارس، فضلا عن تركيزات يجند الأمثل. كما هو موضح، HEK293 كانت تبذر الخلايا في الخلايا 10,000 كل بئر في صفيحة 384، حسنا، حضور 5 ميكرومتر CGP060667، ثم ترانسدوسيد بمقادير متفاوتة من NR1 و NR2A الفيروسات. تم قياس الجريان بعد الحضانة بين عشية وضحاها، والتي يسببها يجند الكالسيوم (الشكل 1). وتكشف نتائج هذه التجارب أفضل كمية ونسبة من الفيروسات باستخدام لكل وحدة فرعية (الشكل 1، مربع أصفر).
متى تم تحديد الكمية المثلى ونسبة لتوصيل ب NR1 و NR2A، أجرى معايرة يجند لتحديد تركيز يجند الأمثل لتنشيط نمدارس. لتحقيق هذا الهدف، واحدة من يغاندس المشارك أضيفت بتركيزات متفاوتة في ثابت، تشبع تركيزات يجند المشارك الأخرى (الشكل 2A-2B). تم الحصول على نتائج مماثلة لمجموعات فرعية أخرى نمدار مثل NR1/NR2B و NR1/NR2D (الشكل 2)، مما يدل على انطباق للمقايسة لسائر أفراد الأسرة نمدار24. بعد تحديد مستويات التعبير الأمثل وتركيزات يجند، أحد يمكن المضي قدما في اختبار آثار نمدار-المغيرون في المقايسة.
وفقا للتقارير المنشورة، يستنسخ هذا التحليل القائم على لوحة الأولى لدراسة نمدارس بحساسية جليكاين والغلوتامات على نطاق واسع بيانات عن الخصائص المعروفة نمدار14،،من25إلى26. هنا، نحن نستخدم نشاط مجمعين، [(حمض R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic (النيفيرابين-AAM077)، خصم الموقع غلوتامات، و [7-الكلورو-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) فينيل-2 (ح) quinolone] (L701، 324)، خصم موقع جليكاين، لتجسيد النتائج المتوقعة للمقايسة27،28 (الشكل 3). وأخيراً، تم اختبار كل مجمع في EC80 ليجند الطبيعية كل موقع ملزم. ومن المتوقع خفض تركيزات يجند لزيادة فاعلية الخصوم، في حين أنه من المتوقع أن ليس لها أي أثر على فاعلية مثبطات غير تنافسية أو سد المسام.
رقم 1: معايرة مفارز NR1 و NR2A- أحجام مختلفة من الفيروسات ترميز مفارز نمدار NR1 و NR2A معاير لتحديد المبلغ المطلوب للنشاط الوظيفي الأمثل للمستقبلات. وقد لوحظ بنسبة 1:1 (v/v) NR1:NR2A كنسبة مثلى مع 1 ميليلتر من كل (المربع الأصفر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: معايرة يجند. ألف-في تركيز ثابت من جليكاين (100 ميكرومتر)، كانت متفاوتة غلوتامات تركيزات معاير وسجل تدفق الكالسيوم. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. غلوتامات باء لا يزال بتركيز 100 ميكرومتر وكان معاير ضد تركيزات مختلفة د-سيرين وجليكاين، وتم قياس تدفق الكالسيوم. وكان هناك لا يوجد فرق كبير بين تدفق الكالسيوم في جليكاين وفي د-سيرين. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. جيم حفز الخلايا ترانسدوسيد مع باكولوفيروس NR1 و NR2D مع أما غلوتامات 100 ميكرومتر وتتراوح تركيزات د-سيرين أو 100 ميكرومتر تركيزات د-سيرين ومتفاوتة من التمويه غلوتامات والكالسيوم وتم قياس. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: وصف نشاط خصم الموقع ملزم يجند. استخدام التعبيرات الأمثل يجند ووحدة فرعية محددة سلفا، وآثار خصم موقع غلوتامات الملزمة والنيفيرابين AAM077 خصم موقع ملزم جليكاين، L701، اتسمت 324 بمقايسة التمويه الكالسيوم ل NR1/NR2A في رد تركيزات. واستخدمت بتركيز يساوي EC80 جليكاين أو غلوتامات حضور تركيز تشبع (100 ميكرومتر) يجند أخرى بعد إضافة النيفيرابين AAM077 و L701، 324، على التوالي. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعتمد نجاح هذا التحليل إلى حد كبير على صحة الخلايا HEK المستخدمة. الخلايا تشهد نمواً متسارعا وينبغي أن تستخدم بعدد مرور منخفضة. هذا التحليل ينطوي على العديد من عمليات النقل وإضافات حلول، وذلك باستخدام الحذر سوف ضمان دقة أعلى في نتائجه. ينبغي أن تكون تركيزات مركبات وجميع الكواشف الأخرى أيضا تدقيق للتقليل من الأخطاء. عند استبدال الوسائط المحمولة مع المخزن المؤقت المقايسة لتحليل تدفق الكالسيوم، اللوحة يجب أن يميل بلطف حيث أن عدم فصل الخلايا. وأخيراً، استخدام ألواح بولي-د-يسين المغلفة في هذا البروتوكول يزيد ارتباط الخلايا باللوحة.
قد تكون هناك اختلافات في التعبير نمدار وكمية الفيروس اللازمة للتعبير وحدة فرعية اعتماداً على عدد مرور واللياقة البدنية للخلايا HEK293 في وقت توصيل. أيضا، قد باكولوفيروس حياة الرف قصيرة تتراوح من ستة أشهر إلى سنة. ولذلك، نوعية الفيروس معياراً هاما لهذا التحليل. يمكن استخدامها مقايسة الفلورة قياسية الكشف والتأكد من مستويات التعبير والترجمة من وحدات نمدار قبل مواصلة التجارب24. يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى لدراسة مستقبلات NMDA استخدام هذا البروتوكول. ومع ذلك، يجب تأكيد التسامح والتعبير عن نمدارس باستخدام باكولوفيروس قبل المضي قدما في البروتوكول؛ وإلا، قد تحدث نتائج غير متوقعة. بالإضافة إلى ذلك، أبلغ عن المركبات مثل مثبطات الثاني توبويسوميراسي لزيادة فعالية التعبير باكولوفيروس29. يمكن اختبار هذه البدائل والأمثل وفقا لتفضيلات المستخدم.
دراسة العمليات البيولوجية في خلية نوع مختلف عن نوع الخلية الأصلية يثير تساؤلات في الأوساط العلمية. حد من هذا التحليل هو استخدام خطوط الخلايا الكلي (HEK 293) كنظام نموذجي لدراسة مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك، نمدار. وقد استخدمت الخلايا HEK بسبب إمكاناتها غشاء ديبولاريزيد مماثلة لتلك التي ديبولاريزيد من الخلايا العصبية. وبالإضافة إلى ذلك، تؤكد لنا الدراسات التكميلية التشابه بين نمدارس في المخ وفي نموذجنا. النشاط المغيرون allosteric إيجابية مثل جن-8324، المغيرون السلبية مثل إيفينبروديل، ومحصرات قنوات مثل الكيتامين، فضلا عن اعتماد الجهد نمدار، تأكدت جميع لدينا نموذج22،23 ،24. أيضا، ولدينا القدرة على ضبط كمية الفيروس للوحدات الفرعية NR1 و NR2A يضمن مستويات التعبير الوظيفي الأمثل.
نظراً لانخفاض كفاءة وتكلفة عالية، ونتائج النجاح ضئيلة، توصيف المستقبلات الفردية وعلى علم الصيدلة فريدة من نوعها تجري حاليا في الإنتاجية المنخفضة دليل التصحيح-المشبك فحوصات22،23. من ناحية أخرى، اكسسيتوتوكسيسيتي لا يزال عقبة رئيسية عند استخدام ستابلي transfected الخلايا، لأن overexpression نمدارس الفنية تضر بالخلايا بسبب يغاندس (الغلوتامات وجليكاين/د-سيرين) التي تصدر في وسائل الإعلام18. كبديل أقوى، لدينا المقايسة يستخدم التعبير باكولوفيروس بوساطة من نمدارس الفنية، التي يتغلب excitotoxicity وغلة التعبير السريع، تيتراتابل مستقبلات. بدلاً من أن تقتصر بالطبيعة لزجة محصرات قنوات، يأخذ هذا التحليل أيضا استفادة الخصوم من ضعف ملزم يجند المواقع. هذه الخصوم تتنافس مع يغاندس الذاتية في وسائط الإعلام، وحماية مواقع الربط يجند. ومن ثم، بعد تبييض للخصوم، يتم استعادة حساسية لإضافة مناشئ يغاندس غلوتامات-ومواقع جليكاين/د-سيرين-الربط.
هذا التحليل، جنبا إلى جنب مع التطورات الحديثة في مجال البيولوجيا الجزيئية مثل كريسبر، سيساعد المستهدفة وتميز المنظمين رواية نمدار التعبير والدالة. في الوقت نفسه، سيساعد هذا الفحص تحديد الجزيئات الصغيرة التي قد مباشر أو غير مباشر تعدل نمدار النشاط دون الحاجة إلى إنشاء خطوط الخلايا مستقرة، مما يوفر التوافق مع الشاشات الوراثية-والصغيرة جزيء-على أساس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد المؤلفون لا تضارب في المصالح وليس للكشف عن.
Acknowledgments
الكتاب يود أن يشكر مكتب البريد البكالوريا علماء البرنامج ومعاهد نوفارتيس "البحوث الطبية الحيوية" ككل من أجل تمويل هذه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
