Summary
L'obiettivo del presente protocollo è quello di facilitare lo studio dei recettori NMDA (NMDAR) a scala più ampia e consentire l'esame degli effetti modulatory di piccole molecole e le loro applicazioni terapeutiche.
Abstract
I recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) (NMDAR) sono classificati come recettori ionotropici per il glutammato e hanno importanti ruoli nell'apprendimento e nella memoria. Malfunzionamento NMDAR, espresso come entrambi sopra - o sotto - activity causata da mutazioni, espressione alterata, traffico o localizzazione, può contribuire a numerose malattie, soprattutto nel sistema nervoso centrale. Di conseguenza, comprensione della biologia del ricevitore, nonché facilitare la scoperta di composti e piccole molecole è cruciale nei continui sforzi per combattere le malattie neurologiche. Attuali approcci allo studio del recettore presentano limitazioni tra cui bassa velocità effettiva, costo elevato e l'impossibilità di studiare le relative abilità funzionale dovuto la necessaria presenza di bloccanti dei canali per evitare eccitotossicità mediata NMDAR. Inoltre, gli attuali sistemi di dosaggio sono sensibili alla stimolazione da glutammato solo e la mancanza di sensibilità alla stimolazione da glicina, altri co-ligando del NMDAR. Qui, presentiamo il primo test basati su piastra con potenza di alto-rendimento per studiare un recettore NMDA con sensibilità sia co-leganti, glutammato e glicina-serina/D. Questo approccio consente lo studio delle diverse composizioni di subunità NMDAR e studi funzionali del recettore in modalità glicina - e/o sensibili al glutammato. Inoltre, il metodo non richiede la presenza di inibitori durante le misurazioni. Gli effetti di modulatori allosterici positivi e negativi possono essere rilevati con questo test e la farmacologia nota di NMDAR è stata replicata nel nostro sistema. Questa tecnica supera le limitazioni dei metodi esistenti ed è conveniente. Noi crediamo che questa tecnica novella ad accelerare la scoperta di terapie per patologie mediate da NMDAR.
Introduction
Con attuali progressi in medicina, l'aspettativa di vita è aumentata in modo significativo; Tuttavia, così ha la prevalenza delle malattie età-correlate. Malattie del sistema nervoso centrale (CNS) come schizofrenia, sclerosi laterale amiotrofica (ALS), morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson, tra gli altri, non fanno eccezione e sono stati progettati per aumentare sopra il prossimo decennio1, 2 , 3. il malfunzionamento del noto come recettori N-metil-D-aspartato (NMDAR) dei recettori ionotropi del glutammato è stato collegato al morbo di Alzheimer, schizofrenia, trauma cranico, ictus, diabete e glaucoma tra gli altri, che garantisce la bisogno di studiare la loro biologia per lo sviluppo di terapie efficaci, modificante la malattia4,5,6,7.
NMDARs sono composti da quattro monomeri o subunità4,8,9. La composizione strutturale della NMDAR Mostra variabilità inerente allo sviluppo e regionali entro il cervello7,10. NMDARs sono coinvolti nella plasticità sinaptica, cognizione e la generazione dei ritmi per respirazione e locomozione11,12,13. Come un canale voltaggio-dipendente, è in gran parte non conduttore al potenziale di membrana a riposo (-70 mV) e viene bloccato da magnesio per prevenire ulteriori permeazione degli ioni. Il canale è attivato dall'associazione di due ligandi, glutammato e glicina/D-serina, e una depolarizzazione simultanea alla membrana sinaptica mediata da recettori AMPA, un'altra sottoclasse di recettori ionotropici del glutammato. La depolarizzazione rimuove il blocco di magnesio di NMDAR, consentendo l'afflusso dei cationi, in particolare calcio14,15,16. Anche se l'attivazione di NMDAR è essenziale per la sopravvivenza delle cellule, attivazione eccessiva può portare a cellule morte17,18,19 attraverso excitotoxicity. Questo, oltre la complessa natura del recettore, rende difficile effettuare studi necessari per lo sviluppo di terapie efficaci.
Sono stati sviluppati diversi metodi per studiare la NMDAR. Tuttavia, ciascuno di essi è corredato da avvertimenti. Ad esempio, una tecnica ampiamente utilizzata è un'analisi di fluorescenza-basata che misura i cambiamenti di NMDAR-mediati in calcio intracellulare in una linea cellulare stabile sotto il controllo di un promotore inducibile tetraciclina (Tet-On)20. Tuttavia, in questo sistema, le concentrazioni di sopramassimale di ligandi che sono necessari e l'obbligo che gli inibitori di NMDAR sono presenti durante la misurazione rende quasi impossibile rilevare l'attività dell'antagonista competitivo. In altri sistemi simili, l'espressione del recettore funzionale provoca tossicità, che richiedono di bloccanti dei canali come ketamina21,22 per preservare le colture cellulari. Questi antagonisti sedersi al centro del recettore e sono difficili da lavare fuori, soprattutto in un formato basato su piastra, in modo da interferire con gli studi funzionali del recettore. Infine, nelle misurazioni elettrofisiologiche come patch di bloccaggio, c'è la velocità effettiva limitata e studi su larga scala sono molto costosi23. Nonostante, i sistemi di cui sopra sono insensibili alla stimolazione di glicina; quindi, studiando attività di glicina-dipendente del NMDAR diventa una sfida.
Qui, descriviamo un nuovo approccio per lo studio di NMDAR che supera le limitazioni discusse. La nostra tecnica sfrutta il sistema di espressione di baculovirus per esprimere il recettore a livello funzionale con un rapporto ottimale delle subunità in meno di 16 ore. Inoltre, l'uso di baculovirus consente un approccio semplice e combinatorio, che fornisce un'ampia caratterizzazione dei sottotipi distinti ricombinante NMDAR. A differenza di altri saggi, questo protocollo non richiede bloccanti dei canali a causa dell'uso di antagonisti deboli. Vantaggio più forte del metodo è quello dopo interruzione dell'antagonista debole, il recettore è sensibile alla modulazione dei siti individuali della glicina e del glutammato-associazione oltre a doppia modulazione di glutammato e glicina/D-serina ligand-legantesi siti. Il dosaggio ricapitola noto farmacologia del recettore NMDAR e gli effetti dei suoi noti modulatori positivi e negativi. Infine, generazione di questo test in vitro cellular supera la tossicità cellulare causata da afflusso del calcio eccessivo e permette per studi funzionali del recettore in un modo ad alta velocità, che può accelerare le scoperte dei modulatori NMDAR negli Stati di malattia.
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Protocol
1. preparazione delle celle
Nota: Questo protocollo, tra cui la generazione dei dati, utilizza cellule HEK293 trasformate con un baculovirus codifica NR1 e NR2A cellule.
- Il numero appropriato di cellule HEK293 di semi e aggiungere il virus NR1 e/o NR2A alle concentrazioni finali appropriate (da 1.00 µ l). Per un piatto di 384 pozzetti, utilizzare 10.000 cellule/pozzetto in un volume finale di 30 µ l.
- In alternativa, seme cellule HEK293-NR1-NR2A presso il numero di cella appropriata e il volume (per un piatto di 384 pozzetti, uso 10.000 cellule/pozzetto in un volume finale di 30 µ l). Aggiungere tetraciclina ad una concentrazione di 2 µ g/mL per indurre l'espressione di NR2A e aggiungere la protezione composta (100 µM MDL105, 519 o 5 µM CGP07066724).
- Nota: Il baculovirus codifica NR1 e NR2 dovrebbe avere un titolo approssimativo tra 5 x 109 - 10 x 109 unità infettive per millilitro24.
2. misurazione dell'attività del recettore NMDA
- Preparare una piastra 384 pozzetti con cellule HEK293 trasformate con cellule NR1/NR2 o HEK293-NR1-NR2A in presenza sia composto protettivo. Utilizzare un fondo chiaro, telaio nero, piastra rivestita di poli-D-lisina.
Nota: Protezione con 100 µM MDL105, 519 viene utilizzato per conferire la sensibilità a glicina, mentre 5 µM CGP070667 viene utilizzato per conferire sensibilità al glutammato. - Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO2 per 16 ore (una notte).
- Rimuovere la piastra dall'incubatrice e scartare delicatamente il supporto cellulare rallentando lanciare la piastra sopra un contenitore di rifiuti organici compatibili. Picchiettare delicatamente la piastra su un tovagliolo di carta per pulire il supporto i bordi della piastra e drenare qualsiasi media rimanenti.
- Preparare il calcium6-colorante solubilizzanti un flaconcino di colorante calcium6 (1 dimensioni piastra) in 10 mL di tampone di incubazione (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, probenecid 1 mM). Incubare la piastra per 2 ore a 37 ° C e 5% CO2.
- Rimuovere la piastra dall'incubatore e lasciare che le celle regolare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Versare delicatamente il calcium6-colorante come descritto al punto 2.3 e aggiungere 30 µ l di tampone di dosaggio (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, probenecid 1 mM).
- Ripetere il passaggio 2.6 due volte per un totale di 3 lavaggi. Lasciare 30 µ l di tampone del saggio sulle cellule dopo l'ultimo lavaggio.
- Lasciare che le celle riposare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Preparare la piastra di ligando facendo un 4 volte stock di 400 µM glicina e 400 µM glutammato (concentrazione finale di 100 µM; concentrazione ottimale di ligandi deve essere determinato come descritto di seguito). Trasferire un minimo di 25 µ l di brodo di ligando in una piastra di fondo V 384 pozzetti.
- Caricare la piastra ligando e cella in Franzese (sistema funzionale di Screening di stupefacenti).
- Misurare la fluorescenza di base (Fo) della piastra cellulare per 30 secondi. Trasferire 10 µ l di brodo ligando nella piastra cellulare utilizzando la funzione di erogazione di scenografo e misura il flusso di calcio registrando fluorescenza calcium6-colorante per 5 minuti.
- Calcolare il rapporto di massima fluorescenza dividendo la massima fluorescenza ottenuta mediante la fluorescenza di base (Fo).
3. ottimizzazione dei livelli di espressione di NMDAR
- Per determinare la quantità ottimale di baculovirus utilizzare, eseguire una titolazione del virus sia NR1 e NR2A. Preparare una piastra 384 pozzetti con cellule HEK293 (raccomandazione di 10.000 cellule/pozzetto, 30 µ l di media) e includono i composti di protezione come descritto al punto 2.1.
- Aggiungere quantità variabili del virus NR1 in righe diverse della piastra (ad esempio: aggiungere rispettivamente 0 µ l, 2 µ l, 1 µ l, 0,5 µ l e 0,25 µ l in righe A-E). Aggiungere duplicati per accuratezza dei dati.
- Aggiungere quantità variabili del virus NR2A in diverse colonne del piatto (ad esempio: aggiungere rispettivamente 0 µ l, 2 µ l, 1 µ l, 0,5 µ l e 0,25 µ l in righe A-E). Aggiungere duplicati per accuratezza dei dati.
- Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO2 per 16 ore (una notte).
- Determinare il rapporto ottimale e la quantità dei virus NR1 e NR2A eseguendo una misurazione del flusso di calcio su Franzese (Vedi sopra).
4. ligando titolazione
- Preparare le celle come descritto al punto 2.3.
- Preparare diluizioni di ogni ligand in presenza di saturare le concentrazioni (100 µM) altri del ligand come una soluzione di riserva 4 volte. Ad esempio: per una concentrazione di prova finale di 10 µM di glicina, preparare una soluzione stock di 40 µM di glicina compreso 400 µM glutammato.
- Procedere con la misurazione di Franzese come descritto al punto 2.11.
5. composti test
- Preparare le celle come descritto nel passaggio 1.
- Preparare la piastra di ligando con uno stock di 5 volte della concentrazione del ligando finale nel tampone.
- Preparare la piastra di composti con il brodo 4 volte della concentrazione di composti nel buffer di analisi finale desiderata. Per una concentrazione finale composta di 10 µM nel tampone, preparare una soluzione stock di 40 µM.
- Mantenere costante la concentrazione di dimetilsolfossido (DMSO) attraverso tutti i campioni di preparare una pre-diluizione del composto in DMSO prima ulteriore diluizione nel buffer di analisi.
- Per una reazione al dosaggio del composto nel test finale compresa tra 3 e 30 µM, preparare una pre-diluizione del composto in DMSO che vanno da 1 a 10 mM. Diluire quelli nel tampone alla concentrazione stock 4 volte. La concentrazione finale di DMSO non deve superare 0,5%.
Nota: Si consiglia di testare ogni campione in triplici copie.
- Caricare il ligando, composto e piastra in Franzese.
- Misurare la fluorescenza di base per 30 secondi.
- Aggiungere 10 µ l di brodo composto e misurare la fluorescenza per 5 minuti.
- Aggiungere 10 µ l di brodo di ligando e misurare la fluorescenza per 5 minuti.
- Determinare l'integrale del rapporto fluorescenza calcolando l'area sotto la curva dei rapporti fluorescente durante gli ultimi 5 minuti della misurazione.
Nota: In alternativa, il rapporto massimo di fluorescenza dopo aggiunta di legante può essere utilizzato per l'analisi.
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Representative Results
Prima di testare gli effetti di piccole molecole, si devono determinare i livelli di espressione ottimale di NMDARs così come le concentrazioni di ligando ottimale. Come descritto, HEK293 cellule sono state seminate a 10.000 cellule per pozzetto di una piastra a 384 pozzetti, in presenza di 5 µM CGP060667, quindi trasdotte con quantità variabili di NR1 e NR2A virus. Dopo incubazione overnight, indotta da legante di calcio è stato misurato il flusso (Figura 1). I risultati di questi esperimenti rivelano migliore quantità e il rapporto di virus da utilizzare per ogni subunità (Figura 1, riquadro giallo).
Una volta che sono state determinate quantità ottimale e il rapporto per la trasduzione con il NR1 e NR2A, una titolazione di ligando è stata effettuata per determinare la concentrazione di ligando ottimale per l'attivazione di NMDARs. A tale scopo, uno dei co-ligandi è stato aggiunto in concentrazioni variabili a fisso, saturando le concentrazioni di altri co-ligando (Figura 2A-2B). Risultati simili sono stati ottenuti per altre combinazioni di subunità di NMDAR come NR1/NR2B e NR1/NR2D (Figura 2), dimostrando l'applicabilità del dosaggio di altri membri della famiglia di NMDAR24. Dopo aver determinato i livelli di espressione ottimale e concentrazioni di ligando, si può procedere con gli effetti di NMDAR-modulatori di prova nel dosaggio.
Coerente con i rapporti pubblicati, questo primo test basati su piastra per studiare NMDARs con sensibilità sia glicina e del glutammato su larga scala riproduce dati sulle proprietà noti di NMDAR14,25,26. Qui, usiamo l'attività di due composti, [(acido R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic (NVP-AAM077), un antagonista del glutammato sito e [7-chloro-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) fenil-2 (H) chinolonici] (L701, 324), un antagonista del sito di glicina, per esemplificare i risultati attesi il dosaggio27,28 (Figura 3). Infine, ogni composto è stato testato presso il EC80 del rispettivo ligando naturale del luogo obbligatorio. Riduzione delle concentrazioni di ligando è previsto per aumentare la potenza degli antagonisti, mentre si prevede che non hanno alcun effetto sulla potenza di inibitori non-competitivi o poro-bloccanti.
Figura 1: titolazione delle subunità NR1 e NR2A. Diversi volumi del virus che codificano per subunità NMDAR NR1 e NR2A sono stati titolati per determinare la quantità necessaria per una ottimale attività funzionale del recettore. Un rapporto di 1:1 (v/v) NR1:NR2A è stato osservato come il rapporto ottimale con 1 µ l di ogni (casella gialla). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: titolazione ligando. A. in una concentrazione fissa di glicina (100 µM), variazione delle concentrazioni di glutammato sono stati titolati e flusso di calcio è stato registrato. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. B. glutammato è rimasto ad una concentrazione di 100 µM ed è stato titolato contro diverse concentrazioni di D-serina e glicina, e flusso di calcio è stato misurato. Non c'era differenza significativa tra il flusso di calcio in glicina e in D-serina. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. C. cellule trasformate con baculovirus NR1 e NR2D sono state stimolate con entrambi glutammato di 100 µM e variando le concentrazioni di D-serina o 100 µM D-serina e variando le concentrazioni di flusso di glutammato e di calcio è stato misurato. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: caratterizzazione attività dell'antagonista di ligand binding sito. Utilizzando le espressioni di ligando e subunità ottimale predeterminate, gli effetti di un antagonista del glutammato-associazione sito, NVP-AAM077 e un antagonista di glicina-associazione sito, L701, 324 sono stati caratterizzati dall'analisi del flusso di calcio per NR1/NR2A presso l'indicato concentrazioni. Una concentrazione uguale alla EC80 di glicina o glutammato in presenza la concentrazione di saturazione (100 µM) altri del ligand è stata utilizzata dopo l'aggiunta di NVP-AAM077 e L701, 324, rispettivamente. Barre di errore rappresentano la deviazione standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il successo di questo test dipende in gran parte la salute delle cellule HEK utilizzato. Le cellule in fase di crescita esponenziale e con numero di passaggio basso dovrebbe essere usato. Questo test comporta molti trasferimenti e aggiunte di soluzioni, così uso attenzione garantirà maggiore precisione nei suoi risultati. Concentrazioni di composti e di tutti gli altri reagenti dovrebbero essere anche controllato per minimizzare gli errori. Quando si sostituisce media delle cellule con il buffer di analisi per il dosaggio del flusso di calcio, la piastra dovrebbe essere inclinata delicatamente affinché le cellule non si staccano. Infine, l'uso di piastre rivestite con poli-D-lisina in questo protocollo aumenta attacco delle cellule alla piastra.
Ci possono essere differenze nell'espressione di NMDAR e la quantità di virus necessaria per l'espressione della subunità a seconda del numero di passaggio e fitness delle cellule HEK293 al momento della trasduzione. Inoltre, il baculovirus ha una vita breve che vanno da sei mesi ad un anno. Di conseguenza, la qualità del virus è un parametro importante per questo test. Un test di immunofluorescenza standard può essere utilizzato per rilevare e confermare i livelli di espressione e la localizzazione delle unità NMDAR prima di ulteriori esperimenti24. Altre linee cellulari possono essere utilizzati per studiare il recettore NMDA utilizzando questo protocollo. Tuttavia, la tolleranza e l'espressione di NMDARs utilizzando il baculovirus deve essere confermate prima di procedere con il protocollo; in caso contrario, potrebbero verificarsi risultati imprevisti. Inoltre, i composti quali gli inibitori di topoisomerasi II sono stati segnalati per aumentare l'efficacia di espressione di baculovirus29. Queste alternative possono essere testate e ottimizzate secondo le preferenze dell'utente.
Lo studio dei processi biologici in un tipo di cella diverso da quella del tipo di cellula originale solleva domande all'interno della comunità scientifica. Una limitazione di questo test è l'uso di linee di cellule di rene (HEK 293) come sistema modello per studiare il recettore del glutammato ionotropici, NMDAR. Le cellule HEK sono state usate a causa del loro potenziale di membrana depolarizzato simile a quello dei neuroni depolarizzati. Inoltre, la somiglianza tra NMDARs nel cervello e nel nostro modello è confermata dai nostri studi supplementari. L'attività di modulatori allosterici positivi come GNE-8324, modulatori negativi quali ifenprodil e antagonisti come ketamine, come pure la dipendenza della tensione di NMDAR, sono stati confermati nel nostro modello22,23 ,24. Inoltre, la nostra capacità di regolare la quantità di virus per le subunità NR1 e NR2A assicura livelli di espressione funzionale ottimale.
A causa della bassa efficienza, costo elevato e successo minimo risultato, la caratterizzazione dei singoli recettori e loro unica farmacologia sono attualmente condotte in basso-velocità di trasmissione manuale patch clamp saggi22,23. D'altra parte, eccitotossicità rimane un ostacolo quando utilizzo stabile transfected le cellule, perché sovraespressione di NMDARs funzionale sono dannosi per le cellule dovuto i ligandi (glutammato e glicina/D-serina) che vengono rilasciati nella media18. Come un'alternativa più forte, il nostro saggio utilizza espressione di baculovirus-mediata di NMDARs funzionale, che sormonta il excitotoxicity e produce rapida, titolabile espressione dei recettori. Piuttosto che essere limitato dalla natura appiccicosa di bloccanti dei canali, questo saggio si avvale degli antagonisti di deboli ligand-legantesi siti anche. Questi antagonisti competono con ligandi endogeni nei media e proteggono i siti di ligand-legantesi. Quindi, dopo l'interruzione degli antagonisti, sensibilità ai leganti esogenicamente aggiunto del glutammato e glicina/D-serina-associazione siti viene ripristinato.
Questo test, combinato con i recenti progressi nella biologia molecolare, come CRISPR, aiuterà la destinazione e caratterizzare nuovi regolatori di NMDAR espressione e funzione. Contemporaneamente, questo test vi aiuterà a identificare piccole molecole che possono direttamente o indirettamente modulano l'attività NMDAR senza la necessità di generare linee cellulari stabili, fornendo in tal modo la compatibilità con schermi piccoli e genetica molecola-basato.
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Disclosures
Gli autori hanno senza conflitti di interesse e niente da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare il Post Diploma di maturità Scholars Program Office e Novartis Institutes for BioMedical Research nel suo complesso per il finanziamento di questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
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