Summary
Målet med denne protokollen er å forenkle studiet av NMDA-reseptorer (NMDAR) på en større skala og tillate undersøkelse av modulatory effekter av små molekyler og deres terapeutiske programmer.
Abstract
N-methyl-D-aspartate (NMDA) reseptorer (NMDAR) er klassifisert som ionotropic glutamat reseptorer og avgjørende roller i læring og hukommelse. NMDAR feil, uttrykt som en over - eller under - activity forårsaket av mutasjoner, endret uttrykk, handel eller lokalisering, kan bidra til mange sykdommer, spesielt i sentralnervesystemet. Derfor er forstå reseptorens biologi som forbindelser og små molekyler avgjørende for pågående arbeidet med å bekjempe nevrologiske sykdommer. Gjeldende tilnærminger til å studere reseptoren har begrensninger inkludert lav overføringshastighet, høye kostnader og manglende evne til å studere sin funksjonelle egenskaper av nødvendig kanal blokkere å hindre NMDAR-mediert excitotoxicity. Dessuten de eksisterende analysen systemene er følsomme for stimulering av glutamat bare og mangler følsomhet til stimulering av glysin, andre co ligand av NMDAR. Her presenterer vi første plate-baserte analysen med høy gjennomstrømming kraft til å studere en NMDA reseptor med følsomhet for både co ligander, glutamat og D-serine/glycine. Denne tilnærmingen gir studiet av forskjellige NMDAR delenhet komposisjoner og lar funksjonelle studier av reseptoren i glycine - og/eller glutamat-sensitive moduser. I tillegg krever metoden ikke tilstedeværelse av hemmere under mål. Effekten av positive og negative allosteric modulatorer kan oppdages med denne analysen og kjent farmakologi i NMDAR har blitt kopiert i vårt system. Denne teknikken løser begrensningene for eksisterende metoder og er kostnadseffektiv. Vi tror at denne teknikken vil akselerere oppdagelsen av terapi for NMDAR-mediert patologi.
Introduction
Med gjeldende fremskritt innen medisin, har levealderen økt betydelig; men så har utbredelsen av alder-relaterte sykdommer. Sykdommer i sentralnervesystemet (CNS) som schizofreni, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Alzheimers og Parkinsons sykdom, blant andre, er intet unntak og har vært ventet for å øke over det neste tiår1, 2 , 3. funksjonsfeil på ionotropic glutamat reseptorer kjent som N-methyl-D-aspartate reseptorer (NMDAR) har vært knyttet til Alzheimers, schizofreni, traumatisk hjerneskade, slag, diabetes og glaukom blant annet som garanterer den trenger å studere deres biologi for utviklingen av effektive, sykdom-modifisere terapier4,5,6,7.
NMDARs består av fire4,8,9-med monomerer eller underenheter. Strukturelle sammensetningen av NMDAR viser utviklingsmessige og regionale variasjoner i hjernen7,10. NMDARs er involvert i synaptiske plastisitet, kognisjon og generering av rytmer for pust og bevegelse11,12,13. Som en spenning-gated kanal, er det i stor grad ikke-ledende på hvile membran potensial (-70 mV) og blokkeres av magnesium for å hindre ytterligere gjennomtrengning av ioner. Kanalen er aktivert ved binding av to ligander, glutamat og glysin/D-serine, og en samtidig depolarization på synaptic membranen formidlet av AMPA reseptorer, en underklasse av ionotropic glutamat reseptorer. Depolarization fjerner magnesium blokkeringen av NMDAR, slik at tilstrømningen av kasjoner, særlig kalsium14,15,16. Selv om aktivering av NMDAR er viktig for celle overlevelse, kan overdreven aktivering føre til celle død17,18,19 gjennom excitotoxicity. Dette, gjør i tillegg til den komplekse naturen reseptoren, det utfordrende for å utføre studier nødvendig for å utvikle effektive behandlinger.
Ulike metoder har blitt utviklet for å studere i NMDAR. Men har hver tilhørende begrensninger. For eksempel er en brukte teknikk en fluorescens-baserte analysen som måler NMDAR-mediert endringer i intracellulær kalsium i en stabil cellen linje under kontroll av en tetracycline-induserbart promoter (Tet-på)20. Men i dette systemet gjør supramaximal konsentrasjonen av ligander som trengs og kravet at NMDAR hemmere finnes under målingen det nesten umulig å oppdage aktivitet av konkurransedyktige antagonist. I andre lignende systemer forårsaker uttrykk for funksjonell reseptoren toksisitet, krever kanal blokkere som ketamin21,22 å bevare i cellekulturer. Disse kanal blokkere sitter ved kjernen av reseptoren og er vanskelig å vaske ut, spesielt i en plate-basert format, så de forstyrre funksjonelle studier av reseptoren. Til slutt i elektrofysiologiske målinger som oppdateringen clamping, det er begrenset kapasitet og store studier er svært dyrt23. Uansett er over systemene ufølsomme til glysin stimulering; Derfor blir studerer glycine-avhengige aktiviteten til NMDAR en utfordring.
Her beskriver vi en ny tilnærming for å studere NMDAR som overvinner diskutert begrensningene. Våre teknikk kapitaliserer på baculovirus uttrykk systemet til å uttrykke reseptoren på funksjonell nivåer med en optimal ratio på underenheter som 16 timer. Videre gir bruk av baculovirus en enkel og kombinasjon tilnærming som gir bred karakteristikk av forskjellige rekombinant NMDAR undertypene. I motsetning til andre analyser krever ikke denne protokollen kanal blokkere på grunn av bruk av svak antagonister. Metodens sterkeste fordelen er at etter bleke av svak antagonist, reseptoren er følsom for modulering av de personlige glysin og glutamat-bindende områdene i tillegg til dobbel modulering av både glysin/D-serine og glutamat ligand-bindende nettsteder. Analysen viser kjente farmakologi av NMDAR reseptoren og effekten av sine kjente positive og negative modulatorer. Til slutt denne i vitro mobilnettet analysen overvinner mobilnettet toksisitet skyldes overdreven kalsium tilstrømningen og gir funksjonell studier av reseptoren i en høy gjennomstrømming mote, som kan akselerere funn av NMDAR modulatorer i sykdom stater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av celler
Merk: Denne protokollen, inkludert data generasjon, bruker HEK293 celler transduced med en baculovirus koding NR1 og NR2A celler.
- Frø riktig antall HEK293 celler og legge NR1 og/eller NR2A viruset på riktig siste konsentrasjonen (1.00 µL hver). En 384-vel plate, bruke 10 000 celler/godt i et siste volum på 30 µL.
- Alternativt frø HEK293-NR1-NR2A celler i riktig celle nummer og volum (for en 384-vel plate, bruk 10 000 celler/godt i et siste volum på 30 µL). Legge til tetracycline i en konsentrasjon av 2 µg/mL å indusere NR2A uttrykk og beskytte sammensatte (100 µM MDL105, 519 eller 5 µM CGP07066724).
- Merk: Baculovirus koding NR1 og NR2 bør ha en omtrentlig titer mellom 5 x 109 - 10 x 109 smittsomme enhet per milliliter24.
2. måling av NMDA-receptor aktivitet
- Forberede en 384-vel plate med HEK293 celler transduced med NR1/NR2 eller HEK293-NR1-NR2A celler i nærvær av enten beskyttende sammensatte. Bruk en klar bunnen, svart ramme, poly-D-lysine belegg plate.
Merk: Beskyttelse med 100 µM MDL105, 519 brukes til å tildele følsomhet til glysin, mens 5 µM CGP070667 brukes til å tildele følsomhet for glutamat. - Inkuber platen på 37 ° C og 5% CO2 16 timer (overnatting).
- Fjerne platen fra inkubator og forsiktig kast cellen media ved å bremse bla platen over en kompatibel våtorganisk beholder. Forsiktig Tapp plate på et papirhåndkle å feilfri media av kantene av platen og avløp eventuelle gjenværende media.
- Klargjør calcium6-fargestoff ved solubilizing en flaske calcium6 fargestoff (1 plate størrelse) i 10 mL inkubasjon bufferen (HBSS pH 7.5 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM probenecid). Inkuber plate i 2 timer på 37 ° C og 5% CO2.
- Fjern platen settefiskanlegg og la cellene justere til romtemperatur i 10 minutter.
- Forsiktig helle ut calcium6-fargestoff som beskrevet i trinn 2.3 og legge 30 µL av analysebuffer (HBSS pH 7.5 20 mM HEPES, 1,8 mM CaCl2, 1 mM probenecid).
- Gjenta trinn 2.6 to ganger for totalt 3 vasker. La 30 µL av analysebuffer på cellene etter siste vask.
- La cellene hvile i 5 minutter ved romtemperatur.
- Forbered ligand platen ved å gjøre en 4-fold lager av 400 µM glysin og 400 µM glutamat (siste konsentrasjon av 100 µM; optimal konsentrasjon av ligander bestemmes som beskrevet nedenfor). Overføre 25 µL av ligand lager i en V 384-vel-bunnplaten.
- Legg ligand plate og celle platen i FDSS (funksjonell narkotika Screening System).
- Måle planlagte fluorescens (Fo) av cellen plate i 30 sekunder. Overfør 10 µL av ligand aksjer til celle platen ved hjelp av FDSS dispensering funksjon og måle kalsium fluks ved calcium6-dye fluorescens i 5 minutter.
- Beregne maksimal fluorescens forholdet ved maksimal fluorescens ved baseline fluorescens (Fmaxfo).
3. optimalisering av NMDAR uttrykk
- For å fastslå den optimale mengden av baculovirus du bruker, kan du utføre en titrering både NR1 og NR2A virus. Forberede en 384-vel plate med HEK293 celler (anbefaling av 10.000 celler/Vel, 30 µL av media) og inkluderer beskyttelse forbindelser som beskrevet i trinn 2.1.
- Legge til varierende mengder NR1 viruset i forskjellige rader av platen (for eksempel: legge til 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL, 0,25 µL i rader AE henholdsvis). Legg duplikater for nøyaktige data.
- Legge til varierende mengder NR2A viruset i forskjellige kolonner av platen (for eksempel: legge til 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0,5 µL, 0,25 µL i rader AE henholdsvis). Legg duplikater for nøyaktige data.
- Inkuber platen på 37 ° C og 5% CO2 16 timer (overnatting).
- Bestemme optimale forhold og mengden NR1 og NR2A virus ved å utføre en kalsium flux måling på FDSS (se ovenfor).
4. ligand titrering
- Forberede cellene som beskrevet i trinn 2.3.
- Forberede fortynninger av hver ligand i nærvær av Mette konsentrasjoner (100 µM) av andre ligand som 4-fold lager løsning. For eksempel: for en 10 µM siste test konsentrasjon av glysin, forberede en 40 µM lager løsning av glysin inkludert 400 µM glutamat.
- Fortsett med FDSS målingen som beskrevet i trinn 2.11.
5. sammensatte Testing
- Forberede cellene som beskrevet i trinn 1.
- Forbered ligand platen med en 5-fold lager siste ligand konsentrasjon i analysen bufferen.
- Forbered forbindelser platen med 4-fold lager ønsket endelige konsentrasjon av forbindelser i analysebuffer. For en endelig sammensatte konsentrasjon av 10 µM i analysen bufferen, forberede en 40 µM lagerløsning.
- Holde konsentrasjonen av dimethyl sulfoxide (DMSO) konstant over alle prøver av forbereder en pre fortynning av sammensatt i DMSO før videre fortynning inn i analysebuffer.
- For en dose-respons av sammensatt i den endelige analysen varierer mellom 3 og 30 µM, forberede en pre fortynning av sammensatt i DMSO alt fra 1 til 10 mM. Fortynne de i analysebuffer i 4-fold lager konsentrasjonen. Siste konsentrasjonen av DMSO bør ikke overstige 0,5%.
Merk: Det anbefales å teste hvert utvalg i triplicates.
- Legg det ligand, sammensatte og celle plate i FDSS.
- Måle den planlagte fluorescensen i 30 sekunder.
- Legg til 10 µL av sammensatte lager og måle fluorescens i 5 minutter.
- Legg til 10 µL av ligand lager og måle fluorescens i 5 minutter.
- Bestemme integrert av fluorescens forholdet ved å beregne området under kurven av fluorescerende forholdstallene under de siste 5 minuttene av måling.
Merk: Alternativt maksimal forholdet mellom fluorescens etter ligand kan brukes for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før testing av små molekyler, må en bestemme optimale uttrykk nivåene av NMDARs samt de optimale ligand konsentrasjonene. Som beskrevet, HEK293 celler var frø på 10.000 celler per brønn i en 384-vel plate, i nærvær av 5 µM transduced CGP060667, så med varierende mengder NR1 og NR2A virus. Etter inkubasjon over natten, ligand-indusert kalsium flux ble målt (figur 1). Resultatene av disse eksperimentene avsløre beste mengden og forholdet mellom virus bruke for hver delenhet (figur 1, gul boks).
Når optimale mengden og forholdet for signaltransduksjon NR1 og NR2A var bestemt, ble en ligand titrering utført for å bestemme optimale ligand konsentrasjonen for aktivering av NMDARs. Dette en av co ligander ble lagt i ulike konsentrasjoner på faste, mette konsentrasjoner av andre co ligand (figur 2A-2B). Lignende resultater ble oppnådd for andre delenhet kombinasjoner av NMDAR som NR1/NR2B og NR1/NR2D (figur 2C), viser analysens anvendelighet til andre NMDAR familiemedlemmer24. Etter bestemme optimale uttrykk nivåer og ligand konsentrasjoner, kan man fortsette med testing av NMDAR-modulatorer i analysen.
Samsvar med publiserte rapporter, denne første plate-baserte analysen å studere NMDARs med følsomhet for både glysin og glutamat i stor skala gjengir data i NMDAR14,25,26kjente egenskaper. Her bruker vi aktiviteten til to forbindelser, [(R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic acid (NVP-AAM077), en glutamat området antagonist og [7-klor-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) fenyl-2 (H) kinolin] (L701, 324), en glysin området antagonist, formidle den anslåtte resultatene av analysen27,28 (Figur 3). Til slutt, hver sammensatte ble testet på EC80 av respektive naturlig ligand binding området. Reduksjon av ligand konsentrasjonen forventes å øke styrken på antagonister, mens det er forventet å ikke ha innvirkning på styrken på ikke-konkurrerende hemmere eller pore-blokkere.
Figur 1: Serine NR1 og NR2A underenheter. Forskjellige mengder virus som koder NMDAR underenheter NR1 og NR2A var titreres for å se hvor nødvendig for optimal funksjonelle aktiviteten i reseptoren. 1:1 (v/v) forholdet NR1:NR2A ble observert som det optimale forholdet med 1 µL av hver (gul boks). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Ligand titrering. A. i en fast konsentrasjon av glysin (100 µM), varierende glutamat konsentrasjoner ble titreres og kalsium flux ble registrert. Feilfelt representerer standardavvik. B. glutamat forble i en konsentrasjon av 100 µM og var titreres mot ulike konsentrasjoner av D-serine og glysin og kalsium flux ble målt. Det var ingen signifikant forskjell mellom kalsium fluks glysin og D-serine. Feilfelt representerer standardavvik. C. celler transduced med NR1 og NR2D baculovirus ble stimulert med enten 100 µM glutamat og varierende konsentrasjoner av D-serine eller 100 µM D-serine og varierende konsentrasjoner av glutamat og kalsium flux ble målt. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: karakteriserer aktivitet av ligand binding området antagonist. Ved hjelp av forhåndsbestemte optimal ligand og delenhet uttrykkene, virkninger av en glutamat-binding området antagonist, NVP-AAM077 og en glysin bindende nettsted antagonist, L701, var 324 preget av kalsium flux analysen for NR1/NR2A på angitt konsentrasjoner. En konsentrasjon som er lik EC80 glysin eller glutamat i nærvær av Mette konsentrasjonen (100 µM) av andre ligand ble brukt etter NVP-AAM077 L701, 324, henholdsvis. Feilfelt representerer standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Suksessen til denne analysen avhenger i stor grad på helse HEK cellene som brukes. Cellene gjennomgår eksponentiell vekst og med lav passasje nummeret skal brukes. Denne analysen omfatter mange overføringer og tillegg av løsninger, så bruker forsiktig vil sikre høyere nøyaktighet i spørringsresultatene. Konsentrasjoner av forbindelser og alle andre bør være også kryssjekket å redusere feil. Når du erstatter cellen media med analysebuffer for kalsium flux analysen, skal platen vippes forsiktig slik at cellene ikke ta. Til slutt, bruk av poly-D-lysine belagt plater i denne protokollen øker feste cellene til platen.
Det kan være forskjeller i NMDAR uttrykk og mengden av virus nødvendig for delenhet uttrykk avhengig av passasje tall og fitness HEK293 cellene ved signaltransduksjon. Baculovirus har også kort holdbarhet, fra seks måneder til et år. Kvaliteten på viruset er derfor en viktig parameter for denne analysen. En standard immunofluorescence analysen kan brukes til å oppdage og bekrefte uttrykk nivåer og lokalisering av NMDAR før videre eksperimenter24. Andre linjer kan brukes å studere NMDA reseptor bruker denne protokollen. Men må toleranse og uttrykk for NMDARs bruke baculovirus bekreftes før du fortsetter med protokollen; ellers kan det oppstå uventede resultater. I tillegg har forbindelser som topoisomerase II hemmere rapportert å øke effekten av baculovirus uttrykk29. Disse alternativene kan testet og optimalisert i henhold til brukerens preferanser.
Studiet av biologiske prosesser i en celle type annerledes enn den opprinnelige celle typen reiser spørsmål i det vitenskapelige samfunnet. En begrensning av denne analysen er bruken av nyre linjer (HEK 293) som en modell å studere ionotropic glutamat reseptor, NMDAR. HEK celler ble brukt på grunn av deres depolarized membran potensial lik som depolarized neurons. I tillegg er likheten mellom NMDARs i hjernen og vår modell bekreftet av våre supplerende studier. Aktiviteten til positiv allosteric modulatorer som GNE-8324, negative modulatorer som ifenprodil, og kanal blokkere som ketamin og spenning avhengighet av NMDAR, ble bekreftet i vår modell22,23 ,24. Også sikrer vår evne til å justere mengden virus for underenheter NR1 og NR2A optimal funksjonelle uttrykk nivåer.
På grunn av lav effektivitet, høye kostnader og minimal suksess utfallet gjennomføres nå karakterisering av personlige reseptorer og deres unike farmakologi i lav gjennomstrømming manuell oppdatering-klemme analyser22,23. På den annen side, excitotoxicity er fortsatt en stor utfordring når bruker stabilt transfekterte celler, fordi overuttrykte funksjonelle NMDARs skade på grunn av ligander (glutamat og glysin/D-serine) som slippes ut i media18. Som en sterkere bruker analysen vår baculovirus-mediert uttrykk for funksjonell NMDARs, som overvinner excitotoxicity og gir rask, titratable uttrykk av reseptorer. I stedet for å være begrenset av klissete natur kanal blokkere, utnytter denne analysen også antagonister svak ligand-bindende nettsteder. Disse antagonister konkurrere med endogene ligander i media og beskytte webområdene ligand-bindende. Derfor, etter bleke av antagonister, følsomhet for exogenously-lagt ligander glutamat - og glycine/D-serine-bindende er gjenopprettet.
Denne analysen, kombinert med nylige fremskritt innen molekylærbiologi som CRISPR, vil hjelpe mål og karakterisere romanen regulatorer av NMDAR uttrykk og funksjon. Samtidig er vil denne analysen hjelpe små molekyler som direkte eller indirekte modulere NMDAR aktivitet uten å generere stabil cellelinjer, noe som gir kompatibilitet med genetisk- og små molekyl-baserte skjermer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter og ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke postkontor for programmet av Baccalaureate forskere og Novartis institutter for biomedisinsk forskning som helhet for finansiering denne studien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Dual Expression Vector | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit | Molecular Devices | R8192 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serine | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| HEPES Buffer | Boston Bio Product | BB-103 | |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Calcium Chloride | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX media | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Synthesized in house | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Synthesized in house | |
| CGP070667 | NIBR | Synthesized in house |
References
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view. Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).
- Wittchen, H. U., et al. The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010. European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).
- Traynelis, S. F., et al. Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function. Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).
- Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential. British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).
- Lau, C. G., Zukin, R. S. NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).
- Zhou, Q., Sheng, M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).
- Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease. Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).
- Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences. Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).
- Neyton, J., Paoletti, P. Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach. Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).
- Shimomura, H., et al. Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses. Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).
- Tajima, N., et al. Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil. Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).
- Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones. Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).
- Zhu, S., et al. Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation. Cell. 165 (3), 704-714 (2016).
- Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).
- Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95. Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).
- Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).
- Hansen, K. B., et al. Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).
- Bettini, E., et al. Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).
- Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system. European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).
- Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).
- Guo, H., et al. A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine. Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).
- Hackos, D. H., et al. Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function. Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).
- Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077. Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).
- Auberson, Y. P., et al. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).
- Danysz, W., Parsons, C. G. Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications. Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).
- Liu, M. K., et al. Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response. International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).
