(HVT) および七面鳥ヘルペス ウイルスは家禽疾病の数に対する遺伝子組換えワクチンの生成のためベクトル プラットフォームとして広く使用されます。統合 NHEJ CRISPR/Cas9 と Cre Lox システムを用いた組換え HVT ベクター ワクチンの生成のシンプルかつ迅速な方法を説明します。
ヘルペス ウイルス (HVT) の七面鳥は、理想的なウイルスのベクトル (AI) 鳥インフルエンザ、ニューカッスル病 (ND)、伝染性ファブリキウス嚢病 (IBD) などの家禽疾病の数に対する遺伝子組換えワクチンの生成のため細菌人工染色体 (を使用してBAC) 突然変異または従来の組換え方法。クラスター化された定期的に空間回文繰り返し (CRISPR)/Cas9 システムが正常に使用されて多くの設定で遺伝子編集のためいくつかの大規模な DNA ウイルスのゲノムの操作を含みます。迅速かつ効率的な CRISPR/Cas9 を介したゲノム編集を生成するパイプライン組換え HVT を開発しました。このメソッドの潜在的な使用を最大にするには、提案はここで IBDV の VP2 蛋白を発現する組換え HVT の生成の方法論に関する詳細情報VP2 式カセットが挿入されます、HVT ゲノム経由(非相同性末端結合)、NHEJ に-依存修復経路。緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発現カセットを簡単に視覚化挿入はまず接続を介してCre LoxP システムを削除し、.このアプローチでは、HVT ゲノム遺伝子組換えワクチンの急速な発展のために他のウイルス抗原を導入する効率的な方法を提供しています。
マレック病 (MD) は、アルファヘルペスウイルス亜科のMardivirus属の血清型 1 (鶏伝染性喉頭ヘルペス ウイルス 2 [GAHV-2]) による鶏のリンパ増殖性疾患です。Mardivirusには 2 つの非病原性の血清型も含まれています: 2 (GaHV 3) 血清型し、血清型 3 (MeHV-1、HVT として歴史的に知られている) メリーランド州に対するワクチンとして使用されています。HVT ワクチン (FC 126 株) は、1970 年代初めに使用されるワクチンの最初の世代はまだ広く使用されている 2価および多価ワクチン製剤メリーランド州に対する強化された保護を提供するためにHVT はその汎用性と両方で ovo皮下孵化場管理と終生の免除を提供する機能のための安全のための家禽疾病の数に対する保護を誘導するワクチンのベクトルとしても広く使用されます。遺伝子組換えの HVT ワクチンを生成するための戦略は、ウイルス感染細胞、重なり合うコスミド Dna、または BAC 変異2いずれかの従来の相同組換えに基づいています。ただし、これらのメソッドは、一般的に時間のかかり、労働集約的で転送ベクトルの建設、大腸菌、プラーク精製ウイルスのゲノムの維持と BAC 順序と選択の除去を必要とします。編集済みウイルス3,4からのマーカー。
編集ツール、その多様性と特異性は近年最も人気のある遺伝子は、CRISPR/関連付けられている (Cas9)。CRISPR/Cas9 システムとして遺伝子組み換え細胞と動物モデル5,6,7,8,9,10の効率的な生成で正常に使用されていますいくつか大きな DNA ウイルスのゲノム11,12,13,14,15,16,17、操作と同様 18,19,20。HVT ゲノム21を編集する CRISPR/Cas9 システムを使用してシンプルかつ効率的な方法を報告した後組換え HVT22の迅速かつ効率的な世代のパイプラインを開発しました。
このメソッドの潜在的なアプリケーションを拡張するために世代組換え HVT ワクチン UL45/46 座本報告では, IBDV の VP2 遺伝子の詳細な方法論について述べる。アプローチを組み合わせた NHEJ CRISPR/Cas9 GFP レポーター遺伝子と GFP 発現カセットを後で削除する Cre LoxP システムが付いた VP2 遺伝子を挿入します。BAC ジーン テクニックと伝統的な組み替えに比べると、NHEJ CRISPR/Cas9 一緒に Cre Lox システムが組換え HVT ワクチンを生成するための迅速かつ効率的なアプローチであることを示します。
CRISPR/Cas9 システム遺伝子編集で貴重なツールとなっています。組換え相同組換え13や BAC 変異技術25など、HVT ベクター開発の伝統的な技術は通常、ベクトルのクローンを作成、選択、大規模なスクリーニングのいくつかのラウンドを含むこれは数ヶ月をかかることがあります。ここで Cre Lox システムと単一セルの並べ替えと組み合わせる NHEJ CRISPR/Cas9 ベースの戦略を使用して記述されているプロトコルは、組換えワクチン生成をより便利に、効率的かつ高速なアプローチです。このパイプラインを使用すると、わずか 1 〜 2 週間24、内組換えウイルスを得ることができるし、17蛍光活性化細胞を用いた単一ラウンド分離するプラーク精製工程を削減できます。精製組換え HVT ウイルスを取得する gRNA デザインとドナーの建設から、全体のプロセスは、1 ヶ月以内に実現できます。組換え HVT 発生の成功のための重要なステップに外来遺伝子の挿入、Cas9 のチャンスを最大化する高いトランスフェクション効率の効率的な胸の谷間を確実にウイルスのゲノムの対象高効率 gRNA 選択が含まれて/gRNAs と同じセルを編集するためのドナーと gRNA プラスミドのトランスフェクションと Cas9 と gRNA、ウイルス、細胞になる前に合理的なレベルで表現することを許可するウイルス感染の間 12 時間間隔を満たすためにウイルス。
HVT 組換え世代の制限は、GFP 陽性の同一証明の複雑さのジャンクション PCR によってクローンを作成です。GFP VP2 カセットは、どちらかの向きで挿入でした。PCR はここで説明されているジャンクションは意味向きで挿入の識別のためだけです。アンチセンス向きで挿入の場合記載されているプライマー対を用いた PCR は働かないでしょうとこの目的のために内部のプライマーを交換できます。もう一つの潜在的な問題、ドナー構築のみ使えるです GFP 除去後残りの LoxP シーケンスの同じウイルスが存在するために 1 つの遺伝子の挿入のため Cre 処理による。バリアント LoxP シーケンスで新しいドナー コンストラクトは、複数挿入目的の代わりに使用できます。
NHEJ と HDR (ホモロジー監督修理) Cas926,27によって作成された二本鎖切断 (Dsb) を修復する 2 つの経路であります。NHEJ は細胞周期28日全体にわたって HDR は非効率かつ S と G2 段階6,29,30中にのみ発生したに対しより効率的です。対象となる場所に外来遺伝子を導入するより効率的な NHEJ の修復経路を悪用しました。劈開ドナー シーケンスと、オクターリピート ゲノム DNA の相同性に依存しない柔軟な機械論的プロセス31,32を通じて非対応または破損した DNA 端を結合することによってオクターリピートを導入可能性があります、NHEJ 修復がsgA の胸の谷間のサイトでのみ発生することができます、外国の遺伝子発現カセットを受けません。このアプローチの別の利点は、NHEJ は、クローニングの非常に簡単なステップを作るホモロジー アーム構造の制限から自由では。NHEJ の外国の遺伝子を挿入するためのアプリケーションのための大きな可能性が要求されます。両方で普遍的な gRNA ターゲット サイトの紹介は、外国の遺伝子カセット作るのドナー テンプレートは特定の gRNA 選択のための必要性無しですぐに組み立てることができるより迅速なプロセスを終了します。異なるレポーター遺伝子、外国の遺伝子発現カセット、別のウイルスのベクトルは、この新しいアプローチの優位性を与えると sgA ターゲット サイト、LoxP サイト、およびパーチと SfiI サイトを含むドナー プラスミドのバックボーンが広く共有もできます。カスタマイズ。
本稿でのプロトコルを記述する使用された HVT かくまって VP2 挿入ただし、多価の組換えベクター HVT ワクチンの開発のため必要な対応するシーケンスをターゲット gRNA を使用して HVT ゲノムの異なるゲノム位置よりウイルス遺伝子に挿入する同じ方法を使用できます。SB 1、CVI988、また他鳥 DNA ウイルス、痘ウイルスやアデノ ウイルスなどと鴨腸炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルスを含む他の鳥ヘルペスなど、他の MDV ワクチン株は、同じを使用して設計することができます。多価の組換えワクチン開発へのアプローチ。ここで説明した CRISPR/Cas9 システムのプラットフォームを使用して新しい多価ベクター ワクチンの開発は複数の家禽の病気から守るために養鶏産業にとって非常に有益になります。
The authors have nothing to disclose.
著者は、共焦点レーザー顕微鏡を助けるため Pippa ホーズをありがとうございます。このプロジェクトは、バイオ テクノロジーによって支えられた・生物科学研究会議 (BBSRC) 掲示板/E/私/00007034 BB/L014262/1。
M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |