Summary
Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus yaygın bir vektör platform olarak kuş hastalıkların bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için kullanılır. Bu makalede bir entegre NHEJ-CRISPR/Cas9 ve Cre-Lox sistemi kullanılarak rekombinant galiba yüksek değerli hedef yönlendirdik aşı üretimi için basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar.
Abstract
Hindi (galiba yüksek değerli hedef) Herpesvirus ideal bir viral vektör kullanarak bakteriyel yapay kromozomu (kuş hastalıkları, kuş gribi (AI), Newcastle hastalığı (ND) ve enfeksiyon bursal hastalıkları (IBD) gibi bir dizi karşı rekombinant aşı üretimi için olduğunu BAC) mutagenesis veya geleneksel rekombinasyon yöntemleri. Kümelenmiş düzenli olarak palindromik yineler (CRISPR) interspaced / Cas9 sistemi başarıyla kullanılan birçok ayarlarında gen düzenleme için birkaç büyük DNA virüs genleri manipülasyon dahil olmak üzere. Rekombinant galiba yüksek değerli hedef oluşturmak için hızlı ve verimli CRISPR/Cas9-aracılı genom düzenleme boru hattı geliştirdik. Bu yöntem potansiyel kullanımı en üst düzeye çıkarmak için burada IBDV VP2 protein ifade rekombinant galiba yüksek değerli hedef oluşturma yöntemi hakkında ayrıntılı bilgi mevcut. VP2 ifade kaset eklenir galiba yüksek değerli hedef genom üzerinden bir NHEJ (nonhomologous son-katılma) içine-bağımlı onarım yolu. Yeşil floresans protein (GFP) ifade kaseti ilk kolay görüntüleme için INSERT bağlı olduğu ve daha sonra üzerinden Cre-LoxP sistemi kaldırıldı. Bu yaklaşım diğer viral antijenler galiba yüksek değerli hedef genom rekombinant aşı hızla gelişmesi için içine tanıtmak için etkili bir yol sunar.
Introduction
Marek'ın hastalığı (MD) tavuk Alphaherpesvirinaealt cins Mardivirus serotip 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) tarafından indüklenen lenfoproliferatif hastalıktır. Mardivirus de iki nonpathogenic serotipleri içerir: 2 (GaHV-3) serotip ve 3 (MeHV-1, tarihsel olarak galiba yüksek değerli hedef bilinen) serotip MD. karşı aşı olarak kullanılır Canlı galiba yüksek değerli hedef aşı (FC-126 zorlanma) 1970'lerde kullanılan MD aşı ilk nesil ve hala yaygın olarak bivalent ve polivalan aşı formülasyonları MD. karşı gelişmiş bir koruma sağlamak üzere kullanılmaktadır Galiba yüksek değerli hedef, çok yönlülük ve güvenliği için ovo içinde ve subkutan kuluçkahane yönetimi ve yaşam boyu bağışıklık sağlamak için yeteneği nedeniyle kuş hastalıkların bir dizi karşı koruma ikna etmek için aşı vektör olarak da yaygın olarak kullanılır. Rekombinant galiba yüksek değerli hedef aşı üretmek için strateji ya geleneksel Homolog rekombinasyon virüs bulaşan hücreleri, üst üste gelen cosmid DNA'lar veya BAC mutagenesis2temel alır. Ancak, bu yöntemler genellikle zaman alıcı ve emek yoğun, gerektiren transfer vektörel çizimler inşaat, Escherichia coli, plak purifications viral genom bakım ve BAC sıra ve seçimi kaldırma Marker düzenlenen virüs3,4.
CRISPR / (Cas9) ilişkili düzenleme aracı çok yönlülük ve özgüllüğü nedeniyle son yıllarda en popüler gen olduğunu. CRISPR/Cas9 sistemi başarılı bir şekilde verimli üretimi hayvan modelleri5,6,7,8,9,10, ve genetiği değiştirilmiş hücreler olarak kullanılmıştır birkaç büyük DNA virüs genleri11,12,13,14,15,16,17manipülasyon de olduğu gibi 18,19,20. Galiba yüksek değerli hedef genom21düzenlemek için CRISPR/Cas9 sistemini kullanarak basit ve etkili bir yöntem raporlama sonrasında, biz bir boru hattı rekombinant galiba yüksek değerli hedef22hızlı ve verimli oluşturmak için geliştirilmiştir.
Bu yöntemin olası uygulama genişletmek için biz ayrıntılı metodoloji rekombinant IBDV UL45/46 odağı bu raporda, VP2 gen ifade galiba yüksek değerli hedef aşı üretimi için açıklar. Yaklaşım GFP muhabir gen ve GFP ifade kaset daha sonra kaldırmak için bir Cre-LoxP sistemi etiketli VP2 gen eklemek için NHEJ-CRISPR/Cas9 birleştirir. Geleneksel rekombinasyon ve BAC recombineering teknikleri ile karşılaştırıldığında, NHEJ-CRISPR/Cas9 Cre-Lox sistemi ile birlikte rekombinant galiba yüksek değerli hedef aşı üretmek için hızlı ve verimli bir yaklaşım olduğunu ispat.
Protocol
1. Cas9/gRNA ifade ve donör oluşturur hazırlanması
-
Cas9/gRNA ifade plazmid inşaatı
- Bir gRNA dizisi22daha önce açıklandığı gibi galiba yüksek değerli hedef UL45 ve UL46 genler arasında intergenic bölge hedefleme tasarlayın. Galiba yüksek değerli hedef genom herhangi bir potansiyel hedef kapalı serilerinde ekarte etmek galiba yüksek değerli hedef genom karşı Kılavuzu-RNA hedef dizisi hizalayın. Sentez ve UL45/46 bölge ve yayımlanmış veri23 sg-A serisinden pX459-V222daha önce açıklandığı gibi içine hedefleme gRNA sıra klon. U6 Fwd astar24kullanarak sıralama Sanger tarafından klonlanmış gRNA sırada doğrulayın.
-
Donör plazmid inşaatı
- Bir çıkarılabilir GFP muhabir kaset ile öğesini VP2 ifade kaset içeren bir donör plazmid oluşturmak için tasarım oligos donör-F ve donör-R (Şekil 1A ve Şekil 3A) aşağıdaki öğeleri içeren: sg-A hem biter, iki LoxP serileri GFP muhabir kaset klonlama ve eksizyon ile çevrili bir PacI sitesinde hem iki SFII siteleri ve VP2 ifade kaset klonlama için hedef sıra.
- Sıra pGEM-T-kolay bir vektör içine clone ve sonra pGEM-sgA-GFP-VP222belirlenmiş donör plazmid oluşturmak için ortaya çıkan vektör içine GFP ve VP2 gene kaset klon.
Not: Herhangi bir klonlama vektör donör plazmid oluşturmak için kullanılabilir.
-
Plazmid DNA hazırlık
- Donör plazmid ve Cas9/gRNA ifade plazmid DNA'lar üretici yönergelerine göre ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak hazırlayın.
2. CRISPR/Cas9-aracılı Knock içinde: Transfection ve enfeksiyon
- Bir gün önce transfection, transfection/enfeksiyon, tamamlanan % 5 fetal Sığır serum (FBS), % 10 tryptose fosfat et suyu, 100 U/mL penisilin-streptomisin, M199 ortamda 10 - gün eski embriyo kullanarak için civciv embriyo fibroblastlar (CEFs) hazırlamak ve 0,25 µg/mL fungizone. Her şey Orta 2.5 ml 6-şey plaka kuyuya başına tohum 1.3 x 106 hücre.
Not: CEF hücreleri 4 ° C'de 3 d için tutulabilir - CEF hücreleri (hazırlanan adım 2.1) UL45/46-gRNA 0,5 µg, 0,5 µg sg-a ve üreticinin yönergelerine göre uygun transfection reaktif kullanarak pGEM-sgA-GFP-VP2 1 µg transfect. Hücreler bir kuluçka (38.5 ° C'de % 5 CO2) 12 h için kuluçkaya.
- Cas9/gRNA ve donör plazmidleri, 12 h posttransfection M199 kültür orta 1 x 105 pfu/ml ile galiba yüksek değerli hedef virüs stok oranında seyreltin. 130 µL seyreltilmiş şunun transfected hücreleri her kuyunun içine ekleyin ve untransfected hücrelerinin bir şey virüs aynı miktarı içeren bir negatif kontrol olarak ayarlayın. Transfected/enfekte hücreleri 38,5 ° c % 5 CO2ile 3 d için kuluçkaya. Ortak kod fon tarafından onaylanan uygulama (JCoPR) kullanarak tüm işlemleri yerine getirir.
3. hasat ve galiba yüksek değerli hedef rekombinant virüs arıtma
-
Floresans aktif hücre sıralama
- Sıralama de bir gün önce başına 2 x 104 CEF hücreleri ile preseeded iki 96-şey tabak hazırlamak.
- CEFs 3 d postinfection transfected/enfekte trypsinize. Her şey ortamından Aspire edin ve fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile hücre levha durulayın. 1 mL % 0.05 tripsin-38,5 ° C kuluçka yaklaşık 5 min için hücreleri trypsinize için EDTA (0,48 mM) ekleyin.
- Resuspend ve hücreleri FBS 50 µL ile 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 5 min için 200 x g , santrifüj.
- PBS 1 mL % 1'ile hücrelerde resuspend FBS. Bir hemasitometre kullanarak hücre sayıları saymak ve 1 x 106 hücre/ml hücre sayısını ayarlayın.
Not: Hücreleri 1-2 h için buz üzerinde tutulabilir. - Hücreleri, süzgeç kap tüpten sıralama polistiren aktarın. Üreticinin yönerge göre hücre sıralayıcısı kullanarak CEFs ile seribaşı 96-şey tabak içine GFP ifade tek hücreleri sıralamak. 38,5 ° c % 5 CO25 d için sıralanmış hücreleri kuluçkaya.
Not: Bir geçit rekombinant virüs varsa çok fazla tek GFP ifade hücreleri ve orijinal iyi birkaç GFP pozitif plaklar sıralamadan önce gerekli olabilir.
-
Rekombinant virüs passaging
- 6-iyi plakaları ile 1.3 x 106 CEF hücreleri de günlük geçiş önce numaralı seribaşı hazırlayın. 5 d postsorting, 96-şey plakaları bir floresan mikroskop altında kontrol edin. Bir tek GFP pozitif plak içeren wells işaretleyin.
Not: resim 2A temsilcisi GFP pozitif plak için bkz. - Her GFP pozitif tripsin-EDTA 3 dk 50 µL ile iyi trypsinize, resuspend ve CEFs ile 6-şey plaka bir kuyuya hücreleri aktarım kültür ortamının 50 µL ekleyin. Bu rekombinant galiba yüksek değerli hedef ilk nesil olacak.
- Rekombinant virüs 3 d daha sonra ilk nesil hasat, her biri 1 mL orta içeren % 10 fetal buzağı serum (FCS), % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ve % 80'i kültür orta buz gibi bir şişe aşağı donma ve belgili tanımlık virüs sıvı azot depolamak.
Not: Hasat zamanı 2-4 d virüs miktarı ve nükleer silahların yayılmasına karşı kapasitesine bağlı olarak değişir. - 1 x 105 hücreler virüs her ilk nesil toplamak, onları santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Hücreleri DNA ekstraksiyon-20 ° C'de depolayın.
- 6-iyi plakaları ile 1.3 x 106 CEF hücreleri de günlük geçiş önce numaralı seribaşı hazırlayın. 5 d postsorting, 96-şey plakaları bir floresan mikroskop altında kontrol edin. Bir tek GFP pozitif plak içeren wells işaretleyin.
-
Polimeraz zincir tepkimesi tarafından genomik ekleme tespiti
- DNA ekstraksiyon için defrost ve hücre Pelet adım 3.2.4 arabellek squishing 50 µL ile resuspend (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl ve 200 µg/mL İndinavir K) ve örnekleri için 30 dk 65 ° C'de parçalayıcı ve , sonra 95 ° c için 2 dk İndinavir K. devre dışı bırakma
- Bir polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile DNA örneği 1 µL kullanarak 3' kavşak astar (Tablo 1) gerçekleştirin. Her örnek için aşağıdaki 20 µL tepki mix buz üzerinde hazırlamak: 2 x PCR Master Mix (10 µL), 10 µM ters yönde astar (0.5 µL), 10 µM aşağı akım astar (0.5 µL), DNA şablonu (1 µL) ve su (8 µL) nükleaz ücretsiz. Güçlendirme Programı: 95 ° C için 2 dk; 95 ° C 30 s, 30 55 ° C s ve 72 ° C 40 s 35 döngüsü; 7 en az yük 2 µL % 1'özel jel Jel Elektroforez için bir de güçlendirme ürünlerinin 72 ° C.
Not: resim 2A 3' kavşak PCR temsilcisi bir sonucu için bkz.
4. eksizyon ile Cre-lox floresan muhabir gen sistemi
- GFP gen rekombinant virüsü kaldırmak için üreticinin öğretim takip transfection reaktif kullanarak CEF hücreleri ile preseeded 6-şey plaka içine Cre recombinase ifade plazmid 2 µg transfect.
- 12 h posttransfection, bir şişe sıvı azot rekombinant virüs defrost, hafifçe resuspend, 50 µL transfected hücreleri her kuyuya tohum ve bir şey koymak aynı derecede virüs aynı miktarda negatif kontrol. 38,5 ° c % 5 CO2ile 3 d için kuluçkaya.
5. plak arıtma
-
Floresans aktif hücre sıralama
- Sıralama de bir gün önce başına 2 x 104 CEF hücreleri ile tohum iki 96-şey tabak.
- Adım 3.1 72 h postinfection (Kimden adım 4) enfekte hücreleri sıralamak için hazırlamak için'nda açıklanan yordamları izleyin. Tek nonfluorescence hücreleri ile CEFs numaralı seribaşı 96-şey tabak içine sıralayın.
-
Rekombinant virüs ve PCR onay passaging
- 5-10 tek nonfluorescence plaklar 5 d postsorting, onları tripsin-EDTA 38,5 ° c 3 dk 50 µL ile trypsinize ve kültür hücreleri resuspend için orta 50 µL Ekle seçin.
Not: resim 2B temsilcisi GFP negatif plak için bkz. - Hücreleri yarısı ikinci nesil CEFs ile preseeded 6-şey plaka her kuyuya geçmek.
- Her klon 200 x g 5 min için de kalan hücreleri santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve DNA ekstraksiyon için arabellek squishing 50 µL hücrelerle resuspend.
- 3.3.2. adımda açıklandığı gibi aynı PCR reaksiyon koşulu ile 1 µL DNA şablonu kullanarak PCR ile 5' kavşak astar (Tablo 1) gerçekleştirin.
Not: Bkz. Şekil 2B 5' kavşak PCR temsil edici bir sonuç için. - PCR sonuçlarına göre 3-5 olumlu klonları rekombinant galiba yüksek değerli hedef daha fazla geçişleri ve doğrulama için seçin.
- 5-10 tek nonfluorescence plaklar 5 d postsorting, onları tripsin-EDTA 38,5 ° c 3 dk 50 µL ile trypsinize ve kültür hücreleri resuspend için orta 50 µL Ekle seçin.
6. rekombinant galiba yüksek değerli hedef doğrulanması
-
Dolaylı ayirt tahlil
- Galiba yüksek değerli hedef 2. 5 x 105 CEFs ile enfeksiyon önceki gün numaralı seribaşı adım 5.2 24-şey plaka elde edilen rekombinant ikinci nesil CEFs bulaştırmak. Hücre kültür orta 48 h postinfection kaldırın ve 500 µL % 4 paraformaldehyde hücreleri düzeltmek için PBS içinde ekleyin. Plaka, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya, sabitleştirici kaldırmak ve hücre katmanı 3 yıkama x PBS ile.
Not: Hücreleri bu aşamada 4 ° C'de birkaç hafta süreyle saklanabilir. - PBS kaldırın ve 500 µL ekleyin % 0,1 oranında Triton X-100 15 dk. yıkama hücre için hücre permeabilize katman 3 x PBS ile.
- Blok nonspesifik bağlama 1 h için engelleme arabellek (PBS %5 Sığır serum) ekleyerek.
- Birincil antikor anti-VP2 monoklonal antikor HH7 veya galiba yüksek değerli hedef enfekte tavuk serum engelleme tampon 1: 200, sulandırmak, iyi başına 200 µL eklemek ve oda sıcaklığında 1 h. yıkama hücre katman için PBS ile 3 x kuluçkaya.
- İkincil antikor keçi Anti-fare IgG Alexa 568 veya keçi Anti-tavuk IgG Alexa 488 1: 200 engelleme arabelleği, sulandırmak, iyi başına 200 µL eklemek, 1 h için oda sıcaklığında kuluçkaya ve hücreleri 3 yıkama x PBS ile. Protein ifade floresan mikroskop altında kontrol edin.
Not: bir temsilcisi VP2 için sonuç boyama Şekil 4 bakın.
- Galiba yüksek değerli hedef 2. 5 x 105 CEFs ile enfeksiyon önceki gün numaralı seribaşı adım 5.2 24-şey plaka elde edilen rekombinant ikinci nesil CEFs bulaştırmak. Hücre kültür orta 48 h postinfection kaldırın ve 500 µL % 4 paraformaldehyde hücreleri düzeltmek için PBS içinde ekleyin. Plaka, oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya, sabitleştirici kaldırmak ve hücre katmanı 3 yıkama x PBS ile.
-
VP2 gen sıralama
- Yüksek sadakat DNA polimeraz ve astar tüm ekleme algılamak için UL45-F1 ve UL46-R1 (Tablo 1) ile UL45 ve UL46 intergenic bölgesi kapsayan DNA dizisi yükseltmek.
- Aşağıdaki 50 µL tepki karışımı hazırlayın: 10 5 µL x Pfx reaksiyon Mix, 10 µM akıntıya karşı 1,5 µL ve aşağı akım astar mix, 10 mM dNTP Mix 1 µL, 50 mm MgSO41 µL, DNA şablonunun 1 µL ve Pfx DNA polimeraz 0.5 µL ve 50 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin. Güçlendirme Programı: 95 ° C için 2 dk; 95 ° C 15 s, 30 55 ° C s ve 68 ° C 3 dk 35 döngüleri için. Tüm %1 özel jel için jel elektroforez PCR Ürününe yükleyin.
- Bir DNA jel arıtma kiti öğretim takip PCR ürünü arındırmak. 10 µL PCR ürününün (30 ng/µL) knock-in VP2 gen onaylamak için bir sıralama şirkete göndermek.
7. rekombinant virüs kararlılığını
- Her T25 şişesi virüs genişleme önceki gün6 CEF hücrelere tohum 2.6 x 10.
- 5.2. adımdaki en az üç olumlu klonlar çözülme; hücre/virüs bir şişe her T25 şişesi ekleyin. % 50 cytopathic etkisi görülmektedir kadar % 5 CO2 38,5 ° C'de kuluçkaya.
- Kültür Orta 2 mL hücrelerde hasat; CEF hücreleri ile gelecek nesil için preseeded yeni bir T25 şişesi için 50 µL bulaştırmak. Rekombinant virüs en az 15 nesildir passaging devam et. Her nesil virüsler VP2 sıra varlığı için PCR ve dolaylı ayirt tahlil (IFA) Rekombinant virüs kararlılığını değerlendirmek için VP2 ifade için analiz.
Representative Results
Rekombinant galiba yüksek değerli hedef aşı üretimi için kullanılan strateji donör plazmid inşa (Şekil 1A) ve yordamlar galiba yüksek değerli hedef (Şekil 1B rekombinant oluşturmak için nasıl içeren Şekil 1' de özetlenen ). Otuz beş GFP pozitif plaklar vahşi tipi plaklar ile çevrili gen çalıyor içinde Wells floresan mikroskop 3 d posttransfection ve - enfeksiyon altında görülebilir. Tek hücreli (Şekil 2A) sıralama kavşak beklenen boyutu (resim 2A, alt paneli), PCR ürünü gösterir PCR 3' tarafından analiz edildi elde edilen arıtılmış virüs. GFP muhabir Cre recombinase tarafından eksizyon sonra üzerinde onların GFP ifade plaklar % 50'si kaybettim. Tek hücreli sıralama tarafından GFP eksizyon (Şekil 2B) sonra saf plak daha fazla 5' kavşak (Şekil 2B, alt paneli) sağ ölçekli PCR ürünü gösterir PCR tarafından doğrulandı. Şekil 3 PCR ürünleri farklı renkli elemanları ile her iki kavşak sıralama sonuçlarını gösterir. Şekil 4' te, protein ifade VP2 özgü monoklonal antikor ve anti-galiba yüksek değerli hedef tavuk serum ile IFA tarafından doğrulandı. Rekombinant galiba yüksek değerli hedef enfekte hücreleri açıkça VP2 Gen ifadesinin (kırmızı) gösterdi iken beklendiği gibi ebeveyn galiba yüksek değerli hedef ile enfekte hücreleri sadece anti-galiba yüksek değerli hedef serum tarafından (yeşil), boyanabilen.
Resim 1: bir rekombinant aşı galiba yüksek değerli hedef yönlendirdik nesil için strateji. (A) Bu panel plazmid inşaat donör için klonlama strateji şematik gösterimi gösterir. Temel unsuru INSERT, LoxP serileri GFP eksizyon ile çevrili bir muhabir GFP kaset ve VP2 ifade kaset serbest bırakmak için iki Cas9 hedef siteleri (sgA) içerir. (B) Bu panel çakma bir iki adım gene strateji özetini gösterir. GFP ve VP2 ifade kaset ekleme parçası Cas9/sgA bölünme tarafından yayımlanan ve UL45/46 loci yolu ile NHEJ-CRISPR/Cas9, galiba yüksek değerli hedef genom içine eklenmiş. GFP pozitif rekombinant virüs sonra sıralanır ve (FACS) sıralama tek hücreli floresans aktif hücre-tarafından arıtılmış. Daha sonra GFP muhabir Gen tarafından Cre recombinase çıkardım ve rekombinant virüs saflaştırılmış ve karakterize. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Rekombinant galiba yüksek değerli hedef doğrulanması. (A)Bu panel gösterir bir GFP pozitif plak (galiba yüksek değerli hedef-GFP-VP2) Floresan mikroskop (üst panel) ve galiba yüksek değerli hedef-GFP-VP2 3' kavşak için PCR doğrulama astar VP2-F & UL46-R1 ile altında görüntülenir. ()B) Cre recombinase ve PCR doğrulama galiba yüksek değerli hedef-VP2 UL45-F1 ve VP2-R1 primerler ile 5' kavşak için kullanılarak galiba yüksek değerli hedef-GFP-VP2, GFP eksizyon sonra görüntülenir bir plak (galiba yüksek değerli hedef-VP2) Bu panel gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Sıra rekombinant galiba yüksek değerli hedef virüs analizi. (A)bu panelinde farklı renklerde başlıca öğelerinin dizileri vardır galiba yüksek değerli hedef intergenic bölge UL45/46 altı çizili gRNA hedef sıra ile arasında ve içinde VP2 ifade kaset sonuna ile Cas9 bölünme sitesi gösteren bir ok dizileri italik küçük kırmızı oklu Cas9 bölünme sitesi, LoxP sitesi sıra yeşil ve iki SFII siteleri diziyi mavi renkle gösterilen sg-bir hedef sıra. (B) Bu panel karşılık gelen renklerle serilerinde sunulan 5' ve 3' kavşak ve galiba yüksek değerli hedef-VP2 anahtar elemanları ile şematik bir sunum sıralama sonuçlarını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Rekombinant galiba yüksek değerli hedef VP2 karakterizasyonu. Bu panel VP2 enfekte CEFs içinde başarılı ifade onay anti-VP2 monoklonal antikor HH7 dolaylı ayirt tahlil (IFA) (kırmızı) gösterir. Galiba yüksek değerli hedef enfeksiyon galiba yüksek değerli hedef enfeksiyonlu tavuk serumla (yeşil) IFA tarafından onaylanır. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
CRISPR/Cas9 sistem gen düzenleme değerli bir araç haline gelmiştir. Geleneksel teknolojiler rekombinant Homolog rekombinasyon13 ve BAC mutagenesis teknoloji25, gibi galiba yüksek değerli hedef vektör geliştirme için genellikle birkaç tur vektör klonlama ve seçimi, aynı zamanda büyük ölçekli tarama dahil, Hangi birkaç ay sürebilir. Burada Cre-Lox sistemi ve tek hücreli sıralama ile birlikte bir NHEJ CRISPR/Cas9-tabanlı strateji kullanarak açıklanan daha uygun, verimli ve daha hızlı bir yaklaşım rekombinant aşı üretimi iletişim kuralıdır. Bu boru hattı kullanarak, rekombinant virüs sadece 1-2 hafta24saat içinde elde edilebilir ve plak arıtma adımları da floresan aktif hücre17sıralama kullanarak bir tek yönlü ayrılık azaltılabilir. GRNA tasarım ve donör inşaat saflaştırılmış rekombinant galiba yüksek değerli hedef virüs elde etmek için tüm süreç 1 ay içinde elde edilebilir. Başarılı rekombinant galiba yüksek değerli hedef üretimi için kritik adımlar yabancı gen ekleme, yüksek transfection verimliliği için Cas9 olasılığını en üst düzeye çıkarmak için verimli bölünme sağlamak için viral genom hedefleme için yüksek verimli gRNA seçim içerir / gRNAs ve düzenleme için aynı hücreye ve donör ve gRNA plazmidleri transfection ve Cas9 ve gRNA virüs hücrelere ulaşmadan önce makul bir düzeyde ifade edilecek izin vermek için viral enfeksiyon 12 saat aralığını karşılamak için virüs.
Galiba yüksek değerli hedef rekombinant üretimi için GFP pozitif tanımlaması karmaşıklığı tarafından Kavşağı PCR klonlar kısıtlamadır. GFP-VP2 kaset her iki yönde tarafına eklenemedi. PCR burada açıklanan kavşak anlamda yönlendirme INSERT tanımlaması sadece içindir. INSERT antianlamlı yönde durumunda açıklanan astar çiftleri kullanılarak PCR işe yaramaz ve iç astar bu amaç için takas. Başka bir potansiyel donör yapı yalnızca kalan LoxP sırası bir gen ekleme GFP çıkarıldıktan sonra-aynı virüs varlığı nedeniyle Cre tedavi tarafından kullanılabileceğini sorundur. Bir değişken LoxP sırası ile yeni bir donör yapı yerine birden çok ekleme amaç için kullanılabilir.
NHEJ ve HDR (Homoloji yönetmen onarım) Cas926,27tarafından oluşturulan çift iplikçikli sonları (DSBs) onarmak için iki yolları vardır. NHEJ ise HDR daha az verimlidir ve sadece S ve G2 aşama6,29,30sırasında oluşur hücre döngüsü28, gerçekleştiği sırada daha verimli olur. Hedeflenen konumlara yabancı genlerinin tanıtmak için daha verimli NHEJ onarım yolu burada istismar. Her ne kadar NHEJ tamir indels noncompatible veya zarar görmüş DNA uçları ile i ciddi donör sırası ve genomik DNA, indels arasında bir Homoloji bağımsız mechanistically esnek işlem31,32 katılarak tanıştırabilir miyim Sadece sgA bölünme sitelerinde ortaya çıkabilir ve yabancı gen ekspresyonu kaset etkilenmez. Bu yaklaşımın başka bir avantajı NHEJ çok basit adım klonlama yapma Homoloji kol inşaat, kısıtlama ücretsiz olmasıdır. Bu NHEJ uygulaması yabancı gen ekleme için büyük bir potansiyele ister. Her ikisi de bir evrensel gRNA hedef sitesinin giriş yabancı gen kaset yapar donör şablonu hemen gerek belirli gRNA seçim için ile inşa edilebilir daha hızlı işlemi sonlandırır. SgA hedef siteleri, LoxP siteleri ve PacI ve SFII siteleri içeren donör plazmid omurgası da yaygın olarak farklı reporter genler, yabancı gen ekspresyonu kaset ve farklı virüs vektörler, bu yeni yaklaşımın avantajı veren arasında paylaşılabilir özelleştirme.
Galiba yüksek değerli hedef yataklık VP2 Ekle bu el yazması protokolünde tanımlamak için kullanılan; Ancak, aynı yaklaşımı farklı genomik yerlerde istediğiniz karşılık gelen sıra multivalent rekombinant yönlendirdik galiba yüksek değerli hedef aşıların geliştirilmesi için hedefleme gRNA kullanarak galiba yüksek değerli hedef genomunun daha viral genler eklemek için kullanılabilir. SB-1 ve CVI988, bulaşıcı laryngotracheitis virüs ve ördek enterit virüs ve ayrıca diğer kuş DNA gibi virüsler çiçeği virüs ve adenovirüse bakın, dahil olmak üzere diğer kuş herpesviruses gibi diğer MDV aşı suşları da kullanarak tasarlanmış yaklaşım multivalent rekombinant aşı geliştirme için. Burada açıklanan CRISPR/Cas9 sistemi platformu kullanarak yeni multivalent Vektörlü aşıların geliştirilmesi birden fazla kümes hayvanları hastalıklara karşı korumak kümes hayvanları endüstrisi için son derece yararlı olacaktır.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Pippa Hawes confocal görüntüleme ile yardım ettiğin için teşekkür ederim. Bu proje biyoteknoloji tarafından desteklenen ve BBS/E/ı/00007034 ve 1/L014262/BB Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) verir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
| Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
| Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
| HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
| pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
| pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
| PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
| SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
| TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
| Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
| Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
| FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
| Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |
References
- Witter, R. L., Solomon, J. J. Experimental infection of turkeys and chickens with a herpesvirus of turkeys (HVT). Avian Diseases. 16 (1), 34-44 (1972).
- Baigent, S. J., et al. Herpesvirus of turkey reconstituted from bacterial artificial chromosome clones induces protection against Marek's disease. Journal of General Virology. 87, Pt 4 769-776 (2006).
- Messerle, M., Crnkovic, I., Hammerschmidt, W., Ziegler, H., Koszinowski, U. H. Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14759-14763 (1997).
- Zhao, Y., Nair, V. Mutagenesis of the repeat regions of herpesviruses cloned as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. 634, 53-74 (2010).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Research. 24 (1), 122-125 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via. Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).
- Zhang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated chicken Stra8 gene knockout and inhibition of male germ cell differentiation. PLoS One. 12 (2), 0172207 (2017).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathogens. 10 (5), 1004090 (2014).
- Bierle, C. J., Anderholm, K. M., Wang, J. B., McVoy, M. A., Schleiss, M. R. Targeted mutagenesis of guinea pig cytomegalovirus using CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Journal of Virology. 90 (15), 6989-6998 (2016).
- Suenaga, T., Kohyama, M., Hirayasu, K., Arase, H. Engineering large viral DNA genomes using the CRISPR-Cas9 system. Microbiology and Immunology. 58 (9), 513-522 (2014).
- Xu, A., et al. A simple and rapid approach to manipulate pseudorabies virus genome by CRISPR/Cas9 system. Biotechnology Letters. 37 (6), 1265-1272 (2015).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. Journal of Virology. 89 (9), 5176-5179 (2015).
- Yuen, K. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein-Barr virus in human cells. Journal of General Virology. 96, Pt 3 626-636 (2015).
- Liang, X., et al. A CRISPR/Cas9 and Cre/Lox system-based express vaccine development strategy against re-emerging Pseudorabies virus. Scientific Reports. 6, 19176 (2016).
- Zou, Z., et al. Construction of a highly efficient CRISPR/Cas9-mediated duck enteritis virus-based vaccine against H5N1 avian influenza virus and duck Tembusu virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 1478 (2017).
- Peng, Z., et al. Pseudorabies virus can escape from CRISPR-Cas9-mediated inhibition. Virus Research. 223, 197-205 (2016).
- Tang, Y. D., et al. Live attenuated pseudorabies virus developed using the CRISPR/Cas9 system. Virus Research. 225, 33-39 (2016).
- Yao, Y., Bassett, A., Nair, V. Targeted editing of avian herpesvirus vaccine vector using CRISPR/Cas9 nucleases. Journal of Vaccine and Technologies. 1, (2016).
- Tang, N., et al. A simple and rapid approach to develop recombinant avian herpesvirus vectored vaccines using CRISPR/Cas9 system. Vaccine. 36 (5), 716-722 (2018).
- He, X., et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via. CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Research. 44 (9), 85 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Petherbridge, L., et al. Cloning of Gallid herpesvirus 3 (Marek's disease virus serotype-2) genome as infectious bacterial artificial chromosomes for analysis of viral gene functions. Journal of Virological Methods. 158 (1-2), 11-17 (2009).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
