Summary
هربس من الديك الرومي (هفت) يستخدم على نطاق واسع كمنصة متجه لتوليد المؤتلف لقاحات ضد عدد من الأمراض إنفلونزا الطيور. توضح هذه المقالة نهج بسيط وسريع لجيل اللقاحات المؤتلف فيكتوريد هفت تستخدم نظاما متكاملا نهيج-كريسبر/Cas9 ولوكس Cre.
Abstract
هربس من الديك الرومي (هفت) متجه فيروسية مثالية لتوليد المؤتلف لقاحات ضد عدد من الأمراض إنفلونزا الطيور، مثل فيروس إنفلونزا الطيور (AI) ومرض نيوكاسل (ND)، والأمراض المعدية بورسال (بنك التنمية بين الأمريكتين)، استخدام (البكتيرية الصبغي الاصطناعي الطفرات BAC) أو أساليب جزئ التقليدية. بانتظام مجمع إينتيرسباسيد في تكرار المتناوب (كريسبر)/نظام Cas9 قد استخدمت بنجاح في العديد من الإعدادات للتحرير الجينات، بما في ذلك التلاعب جينوم فيروس الحمض النووي كبيرة عدة. وقد وضعنا سريعة وفعالة كريسبر/Cas9-بوساطة جينوم تحرير أنبوب لتوليد المؤتلف هفت. لتحقيق أقصى قدر من الاستخدام المحتمل لهذا الأسلوب، نقدم هنا معلومات مفصلة حول المنهجية توليد هفت المؤتلف معربا عن البروتين VP2 من إيبدف. يتم إدراج كاسيت التعبير VP2 إلى هفت الجينوم عن طريق نج (نونهومولوجوس نهاية-الالتحاق بالعمل)-مسار إصلاح معتمدة. كاسيت تعبير بروتين (بروتينات فلورية خضراء) فلورية خضراء ترتبط insert للتصور سهلة أولاً وثم إزالتها عن طريق لجنة المساواة العرقية-لوكسب النظام. هذا النهج يوفر طريقة فعالة لإدخال أخرى مولدات المضادات الفيروسية في الجينوم هفت للتطور السريع للقاحات المؤتلف.
Introduction
ماريك بالمرض (MD) مرض ليمفاوية الدجاج الناجمة عن النمط المصلي المسيطر 1 (جاليد هربس 2 [جاهف-2]) من جنس مارديفيروس في الفصيلية من الفاهيربيسفيريناي. مارديفيروس يشمل أيضا اللقاح nonpathogenic هما: النمط المصلي المسيطر 2 (جاب-3) والنمط المصلي المسيطر 3 (ميف 1، المعروفة تاريخيا هفت) التي تستعمل لقاحات ضد دكتوراه في الطب. هفت اللقاحات الحية (سلالة FC-126) هو الجيل الأول من ماريلاند اللقاحات المستخدمة في أوائل السبعينات ولا يزال يستخدم على نطاق واسع في تركيبات اللقاح الثنائي التكافؤ والشاملين لتوفير حماية محسنة ضد دكتوراه في الطب. هفت يستخدم أيضا على نطاق واسع كناقل لقاح للحث على حماية ضد عدد من الأمراض إنفلونزا الطيور نظراً لبراعة والسلامة سواء في ovo والتفريخ تحت الجلد الإدارة والقدرة على توفير حصانة مدى الحياة. استراتيجية لتوليد المؤتلف هفت اللقاحات تستند أما جزئ المتجانسة التقليدية في الخلايا المصابة بالفيروس، كوزميد تداخل السلطات الوطنية المعينة، أو الطفرات باك2. ومع ذلك، هذه الأساليب بشكل عام تستغرق وقتاً طويلاً وكثيفة العمالة، التي تتطلب بناء ناقلات نقل، والحفاظ على الجينوم الفيروسي في تنقية البلاك الإشريكيّة القولونية ، وإزالة تسلسل باك والتحديد ماركر من الفيروسات تم تحريرها3،4.
كريسبر/المرتبطة (Cas9) هو الجين الأكثر شعبية أداة التحرير في السنوات الأخيرة نظراً لبراعة وخصوصية. نظام كريسبر/Cas9 وقد استخدمت بنجاح في كفاءة توليد الخلايا المحورة وراثيا ونماذج حيوانية5،،من67،،من89،10، كما كذلك في التلاعب في عدة كبيرة فيروس الحمض النووي الجينوم11،،من1213،14،15،16،17، 18،،من1920. بعد الإبلاغ عن أسلوب بسيط وفعال باستخدام نظام كريسبر/Cas9 لتحرير الجينوم هفت21، قمنا بتطوير خط أنابيب لتوليد المؤتلف هفت22سريعة وفعالة.
من أجل توسيع نطاق إمكانية تطبيق هذا الأسلوب، يصف لنا منهجية مفصلة لتوليد المؤتلف لقاح هفت التعبير عن الجين VP2 من إيبدف في محور UL45/46 في هذا التقرير. النهج يجمع بين نج-كريسبر/Cas9 لإدراج الجين VP2 المفتاحية الجينات مراسل التجارة والنقل ونظام لجنة المساواة العرقية-لوكسب لإزالة كاسيت تعبير بروتينات فلورية خضراء في وقت لاحق. بالمقارنة مع جزئ التقليدية والتقنيات ريكومبينيرينج باك، علينا أن نبرهن أن نهيج-كريسبر/Cas9 جنبا إلى جنب مع نظام لوكس Cre نهج سريعة وفعالة لتوليد المؤتلف هفت اللقاح.
Protocol
1-إعداد التعبير Cas9/جرنة والجهات المانحة بنيات
-
بناء والبلازميدات التعبير Cas9/جرنة
- تصميم تسلسل جرنة تستهدف المنطقة إينتيرجينيك بين الجينات UL45 و UL46 هفت كما هو موضح سابقا22. قم بمحاذاة التسلسل الهدف دليل-الجيش الملكي النيبالي ضد الجينوم هفت لاستبعاد أي تسلسل إيقاف المستهدفة المحتملة في الجينوم هفت. توليف واستنساخ التسلسل جرنة استهداف منطقة UL45/46 وتسلسل سان جرمان-أ من البيانات المنشورة23 في pX459-V2 كما هو موضح سابقا22. التحقق من التسلسل جرنة المستنسخة سانغر التسلسل باستخدام إعادة توجيه U6 التمهيدي24.
-
البناء من الجهات المانحة بلازميد
- لتوليد بلازميد مانحة يتضمن الكاسيت التعبير VP2 المفتاحية كاسيت مراسل بروتينات فلورية خضراء قابلة للإزالة، تصميم أوليجوس و الجهات المانحة والجهات المانحة-R التي تحتوي على العناصر التالية (الشكل 1أ و الشكل 3أ): سان جرمان-A الهدف تسلسل في الغايات وموقع باتشي يحف تسلسلين لوكسب لاستنساخ بروتينات فلورية خضراء مراسل كاسيت والختان، وموقعين صفي لاستنساخ الكاسيت التعبير VP2.
- استنساخ التسلسل إلى ناقل بجيم-T-سهلة، واستنساخ الأشرطة الجينات بروتينات فلورية خضراء و VP2 ثم إلى المتجه الناتج توليد بلازميد المانحة سمي بجيم-sgA-التجارة والنقل-VP222.
ملاحظة: يمكن استخدام أي ناقل الاستنساخ لتشييد بلازميد المانحين.
-
إعداد الحمض النووي بلازميد
- إعداد بلازميد المانحين و Cas9/جرنة التعبير بلازميد السلطات الوطنية المعينة باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي تجاري وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
2-كريسبر/Cas9-بوساطة تدق في: تعداء والعدوى
- اليوم السابق تعداء، إعداد الفرخ الجنين الليفية (سيفس) تعداء/العدوى، باستخدام أجنة 10-القديمة اليوم في المتوسط M199 تستكمل مع 5% مصل بقرى الجنين (FBS)، 10% تريبتوسي الفوسفات مرق البنسلين يو/مليلتر 100-ستربتوميسين، و فونجيزوني 0.25 ميكروغرام/مل. بذور 1.3 × 106 خلايا الواحدة وكذلك في كل من لوحة 6-جيدا في 2.5 مل متوسطة جيدا.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ الخلايا CEF د 3 في 4 درجات مئوية. - ترانسفيكت خلايا مركز دراسات الحدود (أعد الخطوة 2.1) مع 0.5 ميكروغرام من UL45/46-جرنة و 0.5 ميكروغرام من سان جرمان-أ 1 ميكروغرام من بجيم-sgA-التجارة والنقل-VP2 استخدام كاشف تعداء مناسبة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. احتضان الخلايا ح 12 في حاضنة (عند 38.5 درجة مئوية مع 5% CO2).
- بوسترانسفيكشن ح 12 من البلازميدات Cas9/جرنة، والجهات المانحة، تخفف من مخزون فيروس هفت مع M199 الثقافة المتوسطة إلى 1 × 105 بفو/مل. إضافة 130 ميليلتر من الفيروس المخفف في كل بئر transfected الخلايا ومجموعة واحدة من الخلايا أونترانسفيكتيد جيدا كعنصر سلبي بنفس الكمية من الفيروس. احتضان الخلايا transfected المصابة د 3 في 38.5 درجة مئوية مع شركة 5%2. القيام بكافة إجراءات استخدام "مدونة الممارسات المشتركة" (جكوبر) وافقت الممولين.
3-تجميع وتنقية الفيروس هفت المؤتلف
-
الأسفار تنشيط الخلية الفرز
- إعداد لوحات 96-جيدا اثنين preseeded مع 2 × 104 خلايا مركز دراسات الحدود يوميا جيدا قبل الفرز.
- تريبسينيزي ترانسفيكتيد/إصابة 3 سيفس بوستينفيكشن د. نضح المتوسطة من كل بئر وشطف الورقة خلية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). أضف 1 مل من 0.05% التربسين-يدتا (0.48 ملم) تريبسينيزي الخلايا في الحاضنة 38.5 درجة مئوية لمدة 5 دقائق تقريبا.
- ريسوسبيند ونقل الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع 50 ميليلتر من FBS. أجهزة الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق.
- ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني مع 1% FBS. عد الأرقام الخلية باستخدام هيموسيتوميتير وضبط عدد الخلايا إلى 1 × 106 خلايا/مل.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالخلايا على الجليد ح 1-2. - نقل الخلايا إلى بوليستيرين فرز أنابيب من خلال برنامجه لمصفاة. فرز الخلايا المفردة معربا عن التجارة والنقل في لوحات 96-جيدا المصنف مع سيفس استخدام فارز الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتضان خلايا تم فرزها د 5 عند 38.5 درجة مئوية مع شركة 5%2.
ملاحظة: قد تكون هناك حاجة مرور واحد من الفيروس المؤتلف قبل الفرز إذا كان هناك عدد كبير جداً من الخلايا بروتينات فلورية خضراء-التعبير واحد ولويحات بروتينات فلورية خضراء-الإيجابية القليلة في البئر الأصلي.
-
باساجينج الفيروسات المؤتلف
- إعداد لوحات 6-جيدا المصنف مع 1.3 × 106 CEF الخلايا يوميا جيدا قبل المرور. د 5 بوستسورتينج، تحقق من لوحات 96-البئر تحت مجهر الأسفار. وضع علامة على الآبار التي تحتوي على لوحة بروتينات فلورية خضراء-إيجابية واحدة.
ملاحظة: انظر الشكل 2A للوحة تمثيلية الحاملات للتجارة والنقل. - تريبسينيزي كل بروتينات فلورية خضراء إيجابية جيدا مع 50 ميليلتر يدتا التربسين لمدة 3 دقائق وإضافة 50 ميليلتر من مستنبت وريسوسبيند ونقل الخلايا إلى بئر واحدة من صفيحة 6-جيدا مع سيفس. وسيكون هذا الجيل الأول من المؤتلف هفت.
- الجيل الأول من الفيروسات المؤتلف 3 د بعد الحصاد وتجميد أسفل قنينة واحدة لكل 1 مل من تجميد مصل العجل الجنين 10% تحتوي على المتوسط (FCS)، 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، والمتوسطة الثقافة 80%، وتخزين الفيروسات في نيتروجين سائل.
ملاحظة: يختلف وقت الحصاد من 2-4 د اعتماداً قدرة المبلغ وانتشار الفيروس. - جمع 1 × 105 خلايا لكل الجيل الأول من الفيروسات والطرد المركزي لهم، وتجاهل المادة طافية. تخزين الخلايا في-20 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي.
- إعداد لوحات 6-جيدا المصنف مع 1.3 × 106 CEF الخلايا يوميا جيدا قبل المرور. د 5 بوستسورتينج، تحقق من لوحات 96-البئر تحت مجهر الأسفار. وضع علامة على الآبار التي تحتوي على لوحة بروتينات فلورية خضراء-إيجابية واحدة.
-
الكشف عن الإدراج الجينوم بتفاعل البوليميراز المتسلسل
- لاستخراج الحمض النووي، إذابة الثلج وريسوسبيند بيليه الخلية من الخطوة 3.2.4 مع 50 ميليلتر من سكويشينج المخزن المؤقت (10 مم تريس-HCl [pH 8]، 1 مم يدتا، 25 مم كلوريد الصوديوم، و 200 ميكروغرام/مل ك البروتيناز) والعينات من 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و ، ثم، في 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لإلغاء تنشيط "ك. بروتيناز"
- القيام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع تقاطع الإشعال 3 ' (الجدول 1) استخدام 1 ميليلتر من عينات الحمض النووي. لكل عينة، يعد هذا المزيج رد فعل ميليلتر 20 التالية على الجليد: 2 x ميكس ماجستير بكر (10 ميليلتر)، 10 ميكرون المنبع التمهيدي (0.5 ميليلتر)، 10 ميكرون المصب التمهيدي (0.5 ميليلتر) وقالب الحمض النووي (1 ميليلتر) والمياه خالية من نوكلاس (8 ميليلتر). برنامج التضخيم: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ق، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية مقابل 40 s لدورات 35؛ 72 درجة مئوية للحد الأدنى 7 2 تحميل ميليلتر من منتجات التضخيم لبئر واحدة من 1% [اغروس] هلام لجل التفريد.
ملاحظة: انظر الشكل 2ألف لممثل نتيجة تقاطع 3 ' PCR.
4-الختان الجينات مراسل الفلورسنت عبر لجنة المساواة العرقية-لوكس نظام
- لإزالة بروتينات فلورية خضراء الجينات من الفيروس المؤتلف، ترانسفيكت 2 ميكروغرام من لجنة المساواة العرقية recombinase التعبير بلازميد في لوحة 6-جيدا preseeded مع الخلايا CEF، باستخدام كاشف تعداء اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- بوسترانسفيكشن ح 12، تذويب قنينة واحدة من الفيروس المؤتلف من النتروجين السائل وريسوسبيند برفق والبذور 50 ميليلتر في كل بئر transfected الخلايا وتعيين بئر واحدة كمراقبة سلبية مع نفس المقدار من الفيروس. احتضانها د 3 في عند 38.5 درجة مئوية مع شركة 5%2.
5-اللوحة تنقية
-
الأسفار تنشيط الخلية الفرز
- البذور هما لوحات 96-جيدا مع 2 × 104 خلايا مركز دراسات الحدود يوميا جيدا قبل الفرز.
- اتبع الإجراءات المذكورة في الخطوة 3، 1 بوستينفيكشن ح 72 (من الخطوة 4) لإعداد الخلايا المصابة للفرز. فرز الخلايا نونفلوريسسينسي واحد في لوحات 96-جيدا المصنف مع سيفس.
-
باساجينج الفيروسات المؤتلف وتأكيد بكر
- اختر 5-10 نونفلوريسسينسي واحد لويحات 5 د بوستسورتينج، تريبسينيزي لهم مع 50 ميليلتر التربسين-يدتا عند 38.5 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، وإضافة 50 ميليلتر من الثقافة المتوسطة ريسوسبيند الخلايا.
ملاحظة: انظر الشكل 2ب للوحة سالب بروتينات فلورية خضراء ممثل. - تمرير نصف عدد الخلايا في كل من لوحة 6-جيدا preseeded مع سيفس كالجيل الثاني جيدا.
- الطرد المركزي الخلايا المتبقية من كل استنساخ في 200 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية ريسوسبيند الخلايا مع 50 ميليلتر من سكويشينج المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي.
- إجراء PCR مع 5 ' تقاطع الإشعال (الجدول 1) استخدام 1 ميليلتر من قالب الحمض النووي مع نفس بكر رد فعل الشرط كما هو موضح في الخطوة 3.3.2.
ملاحظة: انظر الشكل 2ب لممثل نتيجة 5 ' تقاطع PCR. - استناداً إلى نتائج PCR، اختر ثلاثة إلى خمسة استنساخ إيجابية هفت المؤتلف لفقرات أخرى، والتحقق.
- اختر 5-10 نونفلوريسسينسي واحد لويحات 5 د بوستسورتينج، تريبسينيزي لهم مع 50 ميليلتر التربسين-يدتا عند 38.5 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، وإضافة 50 ميليلتر من الثقافة المتوسطة ريسوسبيند الخلايا.
6-تحقق هفت المؤتلف
-
والرزن الفلورة غير المباشرة
- إصابة سيفس مع الجيل الثاني من المؤتلف هفت التي تم الحصول عليها من الخطوة 5.2 في لوحة 24-جيدا المصنف مع 2.5 × 105 سيفس اليوم قبل الإصابة. إزالة بوستينفيكشن ح 48 مستنبت الخلية وإضافة 500 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني إصلاح الخلايا. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ثم إزالة مثبت ويغسل طبقة الخلية 3 x مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا عند 4 درجة مئوية في هذه الخطوة لعدة أسابيع. - إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميليلتر من 0.1% طبقة X-100 تريتون بيرميبيليزي الخلايا ل 15 دقيقة يغسل الخلية x 3 مع برنامج تلفزيوني.
- كتلة غير محددة ملزمة بإضافة حظر المخزن المؤقت (5% مصل بقرى في برنامج تلفزيوني) ح 1.
- تمييع VP2 مكافحة الأولية جسم [مونوكلونل] جسم HH7 أو هفت إصابة الدجاج المصل في 1: 200 في المخزن المؤقت لحظر وإضافة 200 ميليلتر كل بئر، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لطبقة 1 حاء يغسل الخلية x 3 مع برنامج تلفزيوني.
- تضعف جسم الثانوي الماعز الماوس المضادة مفتش أليكسا 568 أو الماعز المضادة الدجاج أليكسا مفتش 488 في 1: 200 في المخزن المؤقت لحظر وإضافة 200 ميليلتر كل بئر واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1 وتغسل الخلايا 3 x مع برنامج تلفزيوني. تحقق التعبير البروتين تحت المجهر الأسفار.
ملاحظة: انظر الشكل 4 ل VP2 ممثل تلطيخ النتيجة.
- إصابة سيفس مع الجيل الثاني من المؤتلف هفت التي تم الحصول عليها من الخطوة 5.2 في لوحة 24-جيدا المصنف مع 2.5 × 105 سيفس اليوم قبل الإصابة. إزالة بوستينفيكشن ح 48 مستنبت الخلية وإضافة 500 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني إصلاح الخلايا. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، ثم إزالة مثبت ويغسل طبقة الخلية 3 x مع برنامج تلفزيوني.
-
تسلسل الجين VP2
- تضخيم تسلسل الحمض النووي التي تغطي منطقة إينتيرجينيك UL45 و UL46 مع عالية الدقة دنا بوليميريز والإشعال UL45-F1 و UL46-R1 (الجدول 1) الكشف عن الإدراج كله.
- إعداد مزيج رد 50 ميليلتر التالية: 5 ميليلتر من 10 x Pfx المزيج الرد، 1.5 ميليلتر من 10 ميكرون المنبع والمصب التمهيدي مزيج، 1 ميليلتر من مزيج دنتب 10 ملم، 1 ميليلتر من 50 مم MgSO4، 1 ميليلتر من قالب الحمض النووي و 0.5 ميليلتر من بوليميراز الدنا Pfx ، وإضافة المياه خالية من نوكلاس إلى 50 ميليلتر. برنامج التضخيم: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لدورات 35. تحميل كل من المنتج PCR إلى 1% [اغروس] هلام لجل التفريد.
- تنقية المنتج بكر بناء على تعليمات من مجموعة مواد تنقية جل الحمض النووي. إرسال 10 ميليلتر من المنتج بكر (30 نانوغرام/ميليلتر) إلى شركة تسلسل لتأكيد تدق في الجينات VP2.
7-استقرار الفيروس المؤتلف
- بذور 2.6 x 106 خلايا CEF في قارورة T25 كل اليوم قبل التوسع في الفيروس.
- ذوبان الجليد استنساخ إيجابية على الأقل ثلاثة من الخطوة 5-2؛ إضافة قنينة واحدة من الخلايا/الفيروسات في كل قارورة T25. احتضان عند 38.5 درجة مئوية مع 5% CO2 حتى يتم ملاحظة تأثير سيتوباثيك 50%.
- حصاد الخلايا في 2 مل من الثقافة المتوسطة؛ إصابة 50 ميليلتر لقارورة T25 جديدة preseeded مع خلايا CEF للجيل القادم. الحفاظ على باساجينج الفيروس المؤتلف للأجيال 15 على الأقل. تحليل كل جيل من الفيروسات PCR لوجود تسلسل VP2 والمقايسة الفلورة غير المباشرة (إيفا) للتعبير VP2 لتقييم استقرار الفيروسات المؤتلف.
Representative Results
الاستراتيجية المستخدمة لتوليد اللقاح هفت المؤتلف ويرد في الشكل 1، والذي يتضمن كيف هو بلازميد المانحة شيدت (الشكل 1أ) وإجراءات لتوليد المؤتلف هفت (الشكل 1ب ). ويمكن ملاحظة خمس وثلاثين لويحات الحاملات لبروتينات فلورية خضراء محاطة لويحات البرية من نوع في الجينات يطرق في الآبار تحت مجهر الأسفار د 3 بوسترانسفيكشن-والعدوى. تنقية الفيروس التي تم الحصول عليها بعد فرز الخلايا المفردة (الشكل 2أ) تم تحليلها بواسطة 3 ' تقاطع بكر، مما يدل على منتج PCR بالحجم المتوقع (الشكل 2أ، اللوحة السفلية). بعد الختان المراسل بروتينات فلورية خضراء من ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية، ما يزيد على 50% لويحات فقدت التعبير عنها في التجارة والنقل. كذلك أكد على اللوحة المنقي بعد الختان التجارة والنقل (الشكل 2ب) بفرز الخلايا المفردة 5 ' تقاطع بكر، مما يدل على منتج PCR الحجم المناسب (الشكل 2بمن اللوحة السفلية). ويبين الشكل 3 نتائج تعاقب كل تقاطع منتجات PCR مع مختلف العناصر الملونة. في الرقم 4، أكدت إيفا تعبير البروتين VP2 محددة [مونوكلونل] جسم وهفت مكافحة الدجاج المصل. كما هو متوقع، الخلايا المصابة مع هفت الأبوية يمكن فقط أن تكون الملون بالأمصال المضادة-هفت (الأخضر)، بينما الخلايا المصابة هفت المؤتلف أظهر بوضوح التعبير عن الجينات VP2 (أحمر).
الشكل 1: استراتيجية لتوليد المؤتلف لقاح فيكتوريد هفت. (أ) هذا الفريق يظهر تمثيل تخطيطي الاستراتيجية الاستنساخ للمانحين بلازميد البناء. وتشمل العناصر الأساسية اثنين من المواقع المستهدفة Cas9 (sgA) للإفراج عن إدراج وكاسيت بروتينات فلورية خضراء مراسل الذي كان واقفاً مع تسلسل لوكسب للختان للتجارة والنقل، وكاسيت التعبير VP2. (ب) هذا الفريق يعرض لمحة عامة عن الجينات استراتيجية تدق في خطوتين. إدراج جزء في التجارة والنقل وشرائط التعبير VP2 صدر عن الانقسام Cas9/sgA وإدراجها في الجينوم هفت في UL45/46 المكاني عبر نج-كريسبر/Cas9. الفيروس المؤتلف الحاملات للتجارة والنقل ثم فرزها وتنقيتها من خلية واحدة fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). في وقت لاحق، هو اقتطعت الجينات مراسل بروتينات فلورية خضراء recombinase لجنة المساواة العرقية وتنقية الفيروس المؤتلف وتتميز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تحقق هفت المؤتلف. (أ) يظهر هذا الفريق بروتينات فلورية خضراء-إيجابية البلاك (هفت-التجارة والنقل-VP2) تصور تحت المجهر الفلورية (اللوحة العلوية) والتحقق بكر من هفت-التجارة والنقل-VP2 مع كبسولة تفجير و VP2 & UL46-R1 لتقاطع 3 '. (ب) يظهر هذا الفريق لوحة (هفت-VP2) تصور بعد الختان بروتينات فلورية خضراء هفت-التجارة والنقل-VP2، باستخدام recombinase لجنة المساواة العرقية والتحقق PCR هفت-VP2 مع الإشعال UL45-F1 و VP2-R1 لتقاطع 5 '. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تسلسل تحليل الفيروس هفت المؤتلف. (أ) تسلسل العناصر الرئيسية بألوان مختلفة في هذا الفريق هي منطقة هفت إينتيرجينيك بين UL45/46 مع تسلسل الهدف جرنة أكد وسهم عرض الموقع الانقسام Cas9، كاسيت التعبير VP2 مع النهاية تسلسل في الأحرف مائل، تسلسل هدف سان جرمان-أ باللون الأحمر مع السهم عرض الموقع الانقسام Cas9 وتسلسل الموقع لوكسب باللون الأخضر تسلسلين مواقع صفي باللون الأزرق. (ب) يبين هذا الفريق نتائج التسلسل الوصلات 5 'و 3' وعرض الملخص تخطيطي هفت-VP2 مع العناصر الرئيسية مع الألوان المطابقة في تسلسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : وصف المؤتلف هفت-VP2. هذا يظهر الفريق تأكيد التعبير الناجح عن VP2 في سيفس المصابة بمقايسة الفلورة غير المباشرة (إيفا) مع مكافحة VP2 [مونوكلونل] جسم HH7 (أحمر). ويؤكد الإصابة هفت إيفا مع دجاج مصاب هفت المصل (الأخضر). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وقد أصبح النظام كريسبر/Cas9 أداة قيمة في تحرير الجينات. وعادة ما تنطوي التكنولوجيات التقليدية المؤتلف هفت ناقل التنمية، مثل جزئ مثلى13 و BAC الطفرات التكنولوجيا25، عدة جولات من ناقل الاستنساخ والتحديد، فضلا عن فحص واسعة النطاق، الذي قد يستغرق عدة أشهر. البروتوكول هو موضح هنا باستخدام استراتيجية نج كريسبر/Cas9-على أساس جنبا إلى جنب مع نظام لوكس Cre وفرز الخلايا المفردة أكثر نهج ملاءمة وكفاءة وأسرع في توليد اللقاح الماشوب. استخدام خط الأنابيب هذا، يمكن الحصول على الفيروس المؤتلف في 1-2 أسابيع فقط24، ويمكن أيضا أن يخفض خطوات تنقية اللوحة إلى فصل واحد-جولة باستخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز17. العملية برمتها، من تشييد جرنة التصميم والمانحين للحصول على الفيروس هفت المؤتلف المنقي، يمكن أن يتحقق في غضون شهر 1. وتشمل الخطوات الحاسمة لنجاح الجيل هفت المؤتلف التحديد جرنة ذات الكفاءة العالية لاستهداف الجينوم الفيروسي لضمان كفاءة الانقسام للإدراج الجينات الأجنبية، كفاءة عالية تعداء إلى أقصى حد الفرصة ل Cas9/ جرناس والفيروس للوفاء في نفس الخلية للتحرير، وفترة 12 ساعة بين تعداء البلازميدات المانحين وجرنة والعدوى الفيروسية للسماح Cas9 وجرنة للتعبير عنها عند مستوى معقول قبل أن يحصل هذا الفيروس في الخلايا.
الحد لتوليد المؤتلف هفت استنساخ تعقيد تحديد بروتينات فلورية خضراء-الإيجابية بتقاطع PCR. يمكن إدراج أشرطة VP2 التجارة والنقل في أي اتجاه. ملتقى PCR الموصوفة هنا فقط للتعرف على الإدراج في اتجاه الشعور. في حالة الإدراج في اتجاه العقاقير، لن تعمل PCR باستخدام أزواج التمهيدي ووصف، وقد تبادلت الإشعال الداخلية لهذا الغرض. مشكلة محتملة أخرى أن يمكن فقط استخدامها في بناء المانحة للإدراج أحد الجينات في نفس الفيروس بسبب الوجود تسلسل لوكسب المتبقية بعد إزالة بروتينات فلورية خضراء بمعاملة لجنة المساواة العرقية. يمكن استخدام تركيبة الجهات مانحة جديدة مع متغير التسلسل لوكسب بدلاً من ذلك لغرض إدراج متعددة.
نج وتقرير التنمية البشرية (إصلاح موجه التماثل) على مسارين لإصلاح فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل (دسبس) التي تم إنشاؤها بواسطة Cas926،27. نج أكثر كفاءة كما يحدث في جميع أنحاء دورة الخلية28، في حين أن تقرير التنمية البشرية أقل كفاءة ويحدث فقط خلال S و G2 المراحل6،،من2930. يمكننا استغلال نج أكثر كفاءة إصلاح المسار هنا لإدخال الجينات الأجنبية في المواقع المستهدفة. على الرغم من أن إصلاح نج قد يعرض إينديلس بالانضمام إلى نهايات الحمض النووي نونكومباتيبلي أو التالفة من خلال31،ميتشانيستيكالي مرنة عملية مستقلة عن التماثل32 بين المانحين ملصوق تسلسل والحمض النووي، إينديلس يمكن أن يحدث فقط في مواقع الانقسام منخفض الوزن، وكاسيت التعبير الجيني الأجنبية لا يتأثر. وهناك ميزة أخرى لهذا النهج أن نج مجاني من تقييد التماثل ذراع البناء، مما يجعل استنساخ خطوة بسيطة جداً. وهذا يدفعنا بإمكانات كبيرة لتطبيق نج للإدراج الجينات الأجنبية. وينتهي إدخال الموقع الهدف جرنة العالمي على حد سواء ليجعل كاسيت الجينات الأجنبية عملية أكثر سرعة كما يمكن تشييد القالب المانحة فورا مع عدم وجود حاجة لاختيار جرنة محددة. العمود الفقري بلازميد الجهات المانحة التي تحتوي على المواقع المستهدفة sgA ومواقع لوكسب ومواقع باشي وصفي يمكن أيضا أن تكون مشتركة على نطاق واسع بين الجينات مراسل مختلفة، والأشرطة الأجنبية في التعبير الجيني، ونواقل الفيروسات المختلفة، إعطاء هذا النهج الجديد في الاستفادة من التخصيص.
إدراج VP2 إيواء هفت كان يستخدم لوصف البروتوكول في هذه المخطوطة؛ ومع ذلك، يمكن استخدام نفس النهج لإدراج أكثر من المورثات الفيروسية في مواقع مختلفة الجينوم الجينوم هفت استخدام جرنة استهداف تسلسل المقابلة المرجوة لتطوير لقاحات هفت فيكتوريد المؤتلف متعددي. أخرى سلالات لقاح MDV، مثل بينالي الشارقة-1 و CVI988، هيربيسفيروسيس الطيور الأخرى، بما في ذلك الفيروسات المعدية لارينجوتراتشيتيس وبطة فيروس التهاب الأمعاء، وأيضا أخرى إنفلونزا الطيور فيروسات الحمض النووي، مثل فيروسات جدري وغديه، يمكن أن يكون هندسيا أيضا استخدام نفس نهج لتطوير اللقاح الماشوب متعددي. تطوير لقاحات فيكتوريد متعددي جديدة باستخدام منصة نظام كريسبر/Cas9 الموصوفة هنا سوف يكون مفيداً للغاية لصناعة الدواجن لحماية ضد أمراض الدواجن متعددة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون هاويس بيبا للمساعدة في التصوير [كنفوكل]. أيد هذا المشروع التكنولوجيا الأحيائية، ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (BBSRC) المنح BBS/E/أنا/00007034 و BB/L014262/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
| Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
| Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
| HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
| pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
| pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
| PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
| SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
| TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
| Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
| Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
| FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
| Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |
References
- Witter, R. L., Solomon, J. J. Experimental infection of turkeys and chickens with a herpesvirus of turkeys (HVT). Avian Diseases. 16 (1), 34-44 (1972).
- Baigent, S. J., et al. Herpesvirus of turkey reconstituted from bacterial artificial chromosome clones induces protection against Marek's disease. Journal of General Virology. 87, Pt 4 769-776 (2006).
- Messerle, M., Crnkovic, I., Hammerschmidt, W., Ziegler, H., Koszinowski, U. H. Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14759-14763 (1997).
- Zhao, Y., Nair, V. Mutagenesis of the repeat regions of herpesviruses cloned as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. 634, 53-74 (2010).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Research. 24 (1), 122-125 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via. Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).
- Zhang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated chicken Stra8 gene knockout and inhibition of male germ cell differentiation. PLoS One. 12 (2), 0172207 (2017).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathogens. 10 (5), 1004090 (2014).
- Bierle, C. J., Anderholm, K. M., Wang, J. B., McVoy, M. A., Schleiss, M. R. Targeted mutagenesis of guinea pig cytomegalovirus using CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Journal of Virology. 90 (15), 6989-6998 (2016).
- Suenaga, T., Kohyama, M., Hirayasu, K., Arase, H. Engineering large viral DNA genomes using the CRISPR-Cas9 system. Microbiology and Immunology. 58 (9), 513-522 (2014).
- Xu, A., et al. A simple and rapid approach to manipulate pseudorabies virus genome by CRISPR/Cas9 system. Biotechnology Letters. 37 (6), 1265-1272 (2015).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. Journal of Virology. 89 (9), 5176-5179 (2015).
- Yuen, K. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein-Barr virus in human cells. Journal of General Virology. 96, Pt 3 626-636 (2015).
- Liang, X., et al. A CRISPR/Cas9 and Cre/Lox system-based express vaccine development strategy against re-emerging Pseudorabies virus. Scientific Reports. 6, 19176 (2016).
- Zou, Z., et al. Construction of a highly efficient CRISPR/Cas9-mediated duck enteritis virus-based vaccine against H5N1 avian influenza virus and duck Tembusu virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 1478 (2017).
- Peng, Z., et al. Pseudorabies virus can escape from CRISPR-Cas9-mediated inhibition. Virus Research. 223, 197-205 (2016).
- Tang, Y. D., et al. Live attenuated pseudorabies virus developed using the CRISPR/Cas9 system. Virus Research. 225, 33-39 (2016).
- Yao, Y., Bassett, A., Nair, V. Targeted editing of avian herpesvirus vaccine vector using CRISPR/Cas9 nucleases. Journal of Vaccine and Technologies. 1, (2016).
- Tang, N., et al. A simple and rapid approach to develop recombinant avian herpesvirus vectored vaccines using CRISPR/Cas9 system. Vaccine. 36 (5), 716-722 (2018).
- He, X., et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via. CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Research. 44 (9), 85 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Petherbridge, L., et al. Cloning of Gallid herpesvirus 3 (Marek's disease virus serotype-2) genome as infectious bacterial artificial chromosomes for analysis of viral gene functions. Journal of Virological Methods. 158 (1-2), 11-17 (2009).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
