Summary
火鸡疱疹病毒 (hvt) 被广泛用作生成针对多种鸟类疾病的重组疫苗的载体平台。本文介绍了一种使用集成的 nhej-crispr/cas9 和 cre-lox 系统生成重组 hvt-vectored 疫苗的简单而快速的方法。
Abstract
火鸡疱疹病毒 (hvt) 是一种理想的病毒载体, 用于利用细菌人工染色体生成针对禽流感 (ai)、纽卡斯尔病 (nd) 和传染性法氏囊病 (ibd) 等多种禽流感疾病的重组疫苗 (b c) 诱变或常规重组方法。聚集在一定时间内间隔的回文重复 (CRISPR)/Cas9 系统已成功地用于许多环境中的基因编辑, 包括操作几个大型 dna 病毒基因组。我们开发了一个快速高效的 crispr/cas9 介导的基因组编辑管道, 以生成重组 hvt。为了最大限度地发挥这种方法的潜在用途, 我们在这里提供了有关生成表达 ibdv vp2 蛋白的重组 hvt 的方法的详细信息。vp2 表达盒通过nhej (非同源端接) 依赖修复途径插入 hvt 基因组。绿色荧光蛋白 (gfp) 表达盒首先连接到插入物上, 以便于可视化, 然后通过Cre-LoxP 系统取出。这种方法为将其他病毒抗原引入 hvt 基因组提供了一种有效的方法, 用于重组疫苗的快速开发。
Introduction
marek 病 (md) 是由金银花属病毒血清型 1 (gallid 疱疹病毒 2 [ghv-2]) 引起的鸡淋巴增生性疾病。马迪病毒还包括两种非致病性血清型: 血清型 2 (gahv-3) 和血清型 3 (mehv-1, 历史上被称为 hvt), 用作对抗 md 的疫苗。活 hvt 疫苗 (fc-126 菌株) 是上世纪70年代初使用的第一代 md 疫苗, 目前仍被广泛用于二价和多价疫苗配方, 以增强对 md 的防护。hvt 还被广泛用作疫苗载体, 以诱导预防一些禽流感疾病, 因为它的多功能性和安全性, 无论是在奥沃和皮下孵化场的管理, 并提供终身免疫能力。重组 hvt 疫苗的生成策略是基于病毒感染细胞的常规同源重组、重叠的宇宙中 dna 或 bac 诱变 2.然而, 这些方法通常是耗时和劳动密集型的, 需要构建转移载体, 维持大肠杆菌的病毒基因组,斑块纯化, 以及去除 bac 序列和选择标记, 从编辑的病毒3,4。
crispr 关联 (cas9) 是近年来最流行的基因编辑工具, 因为它具有多功能性和特异性。crispr/cas9 系统已成功地用于转基因细胞和动物模型的高效生成5、6、7、8、9、10.以及在操纵几个大的 dna 病毒基因组11,12,13, 14,15,16,17, 18,19,20。在报告了一种使用 crispr/cas9 系统编辑 hvt 基因组 21的简单而有效的方法后, 我们开发了一种快速高效地生成重组 hvt22的管道。
为了扩大该方法的潜在应用范围, 本文介绍了在 UL45/46 位点生成表达 ibdv vp2 基因的重组 hvt 疫苗的详细方法。该方法结合 nhej-crispr/cas9 插入带有 gfp 记者基因标记的 vp2 基因和 cre-loxp 系统, 以去除 gfp 表达盒。与传统的重组和 bac 重组技术相比, nhej-crispr/cas9 与 cre-lox 系统相结合是一种快速有效的重组 hvt 疫苗生成方法。
Protocol
1. cas9/grna 表达和供体结构的制备
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Cas9/gRNA 表达质粒的构建
- 设计一个 grna 序列, 针对 ul45 和 ul46 hvt 基因之间的基因间区域, 如前面所述。将导 rna 目标序列与 hvt 基因组对齐, 以排除 hvt 基因组中任何潜在的非目标序列。合成和克隆 grna 序列针对 ul45a 区域和 sg-a 序列从已发布的数据23到 px459-v2 如上文所述的22。使用 u6-fwd引物 24通过 sanger 测序验证克隆的 grna 序列。
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供体质粒的构建
- 要生成一个捐助方质粒, 其中包含带有可移动 gfp 记者盒式标记的 vp2 表达盒, 设计少供人-f 和 donor-r 包含以下元素 (图 1a和图3 a):目标序列两端, 一个太平洋区域两侧有两个氧视讯序列用于 gfp 记者盒式克隆和切除, 以及两个 sfii 站点用于克隆 vp2 表达盒。
- 将序列克隆到一个 pgem-t 易事载体中, 然后将 gfp 和 vp2 基因盒克隆到生成的载体中, 生成被指定为 pgem-sg-gfp-vp222的供体质粒。
注: 任何克隆载体都可用于构建供体质粒。
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质粒 dna 制备
- 根据制造商的说明, 使用商业 dna 提取试剂盒制备供体质粒和 Cas9/gRNA 表达质粒 dna。
2. crispr/cas9 介导的敲击: 转染和感染
- 在转染前一天, 用 m199 培养基中10天的旧胚胎, 辅以5% 的胎牛血清 (fbs)、10% 的胰蛋白酶磷酸盐液、100 u/picilstreptomin, 为转染感染准备鸡胚胎成纤维细胞 (cef), 以及0.25 微克/升真菌酮。种子 1.3 x 106细胞, 每口井到一个6孔板在2.5 毫升的介质。
注: cef 电池可在4°c 下保存3d。 - 转染 cef 细胞 (在步骤2.1 中制备), 使用制造商的说明使用适当的转染试剂, 使用0.5 微克的 ul456年-grna、0.5μg 的 sg-a 和1μg 的 pGEM-sgA-GFP-。将细胞孵育12小时在孵化器中 (在 38.5°c, 5% co2) 中孵育。
- 12小时转染后 cas9/grna 和供体质粒, 用 m199 培养基稀释 hvt 病毒库, 使其达到 1 x 10 5 pfu/ml.将稀释后的病毒在每个井中加入 130μl, 并将一口未转染的细胞放入井中, 作为具有相同病毒数量的负对照。在38.5°c 条件下, 用 5% co2 培养经转化的细胞 3 d.使用资助者批准的《联合业务守则》 (jcopr) 执行所有程序。
3. hvt 重组病毒的收集与纯化
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荧光激活细胞分选
- 在分拣前一天准备两个96孔板, 每口井有 2 x10 4个 cef 单元格。
- 胰蛋白酶化经过感染的 cef 3 d 后感染。从每口井中吸干培养基, 用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 冲洗细胞片。加入1毫升0.05% 的胰蛋白酶 edta (0.48 mm), 对38.5°c 孵化器中的细胞进行约5分钟的胰蛋白酶化。
- 重新移植并将细胞转移到具有 50μl fbs 的 1.5 ml 微离心管中。离心 5分钟, 200 x g 。
- 用 1% fbs 在 pbs 的 1 ml 中重新移植细胞。使用血细胞计计数细胞数量, 并将细胞数量调整为 1 x 106 细胞。
注: 细胞可在冰上保持1-2小时。 - 通过聚苯乙烯的滤网盖将细胞转移到聚苯乙烯分选管中。根据制造商的说明, 使用细胞分选器将表达 gfp 的单个细胞分为用 cef 播种的96孔板。用5% 的 co2 在38.5°c 下将分类细胞培养 5 d.
注: 如果原井中单个 gfp 表达细胞过多, 且 gfp 阳性斑块很少, 则在分类前可能需要通过重组病毒的一段。
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重组病毒的传递
- 准备6孔板种子 1.3 x 10 6 cef 细胞每井的前一天通过.5 d 后分拣, 在荧光显微镜下检查96孔板。标记包含单个 gfp 阳性斑块的井。
注: 有关具有代表性的 gfp 阳性斑块, 请参见图 2a 。 - 用50μl 的胰蛋白酶 edta 对每个 gfp 阳性井进行深入化 3分钟, 加入50μl 培养基, 重新悬浮并将细胞转移到具有 cef 的6孔板的井中。这将是第一代重组 hvt。
- 3 d 后采集第一代重组病毒, 在含有10% 胎儿小牛血清 (fcs)、10% 亚甲基亚硫酸盐 (dmso) 和80% 培养基的1毫升冷冻培养基中, 分别冷冻一个小瓶, 并将病毒储存在液氮中。
注: 收获时间从 2-4 d 不等, 取决于病毒的数量和扩散能力。 - 收集每一代病毒的 1 x10 5个细胞, 离心, 并丢弃上清液。将细胞存放在-20°c 进行 dna 提取。
- 准备6孔板种子 1.3 x 10 6 cef 细胞每井的前一天通过.5 d 后分拣, 在荧光显微镜下检查96孔板。标记包含单个 gfp 阳性斑块的井。
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聚合酶链反应检测基因组插入
- 对于 dna 提取来说用50μl 的压扁缓冲液 (10mm Tris-HCl [ph 8]、1mm edta、25 mm 氯化碳和200μgm 氯化碳蛋白酶 k) 从步骤3.2.4 中解冻并重新悬浮细胞颗粒, 并在65°c 下裂解样品, 时间为 30分钟, 然后, 然后, 在95°c 下 2分钟, 以灭活蛋白酶 k。
- 使用1μl 的 dna 样本, 与 3 ' 交点引物 (表 1) 进行聚合酶链反应 (pcr)。对于每个样品, 在冰上制备以下20μl 反应混合物: 2x pcr 主混合物 (10μl)、10μm 上游底漆 (0.5μl)、10μm 下游引物 (0.5μl)、dna 模板 (1μl) 和无核水 (8μl)。放大程序为: 95°c, 2分钟;95°c 为 30秒, 55°c 为 30秒, 72°c 为 30秒, 为35次循环;72°c 7分钟, 将放大产物的2μl 加载到1% 琼脂糖凝胶的一口井中进行凝胶电泳。
注: 有关 3 ' 结 pcr 的代表性结果, 请参见图 2a 。
4. 荧光报告基因的 cre-lox 系统切除
- 为了从重组病毒中去除 transfect 基因, 请按照制造商的指示, 使用转染试剂, 将2微克的 cre 重组酶表达质粒转染到 cef 细胞预置的6孔板中。
- 12小时转染后, 从液氮中解冻一小瓶重组病毒, 轻轻再悬浮, 将50μl 种子放入每口转染细胞中, 并用相同数量的病毒设置一个和负控制。在38.5°c 下与5% 的 co2 一起孵化 3 d.
5. 斑块纯化
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荧光激活细胞分选
- 在分类前的第二天, 为两个 96孔板播种 2 x 10 4个 cef 细胞。
- 按照步骤 3.1 72h 感染后 (从步骤 4) 中描述的过程, 为被感染的细胞进行分类做好准备。将单个非荧光细胞分类为96孔板, 用 cef 播种。
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重组病毒的传递及 pcr 鉴定
- 选择5-10 单片非荧光斑块5d 后分选, 在38.5°c 下用50μl 的胰蛋白酶-edta 对其进行色氨酸化, 每次 3分钟, 并加入50μl 培养基重新悬浮细胞。
注: 有关具有代表性的 gfp 阴性斑块, 请参见图 2b 。 - 将一半的细胞进入6井板的每口井, 并将 cef 作为第二代预置。
- 以 200 x g 离心每个克隆的剩余细胞 5分钟, 丢弃上清液, 并用50μl 的压扁缓冲液重新悬浮细胞进行 dna 提取。
- 使用 dna 模板, 使用1μl 的 dna 模板, 与 5 ' 交点引物进行 pcr (表 1), 该模板的 pcr 与步骤3.3.2 中所述的相同。
注: 有关 5 ' 结 pcr 的代表性结果, 请参见图 2b 。 - 根据 pcr 结果, 选择 3 ~ 5个重组 hvt 阳性克隆进行进一步的段落和验证。
- 选择5-10 单片非荧光斑块5d 后分选, 在38.5°c 下用50μl 的胰蛋白酶-edta 对其进行色氨酸化, 每次 3分钟, 并加入50μl 培养基重新悬浮细胞。
6. 重组 hvt 的核查
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间接免疫荧光法
- 在感染前一天用 2.5 x 10 cef 播种的24井板中, 用步骤5.2 中获得的第二代重组 hvt 感染 cef。在感染后48小时内取出细胞培养培养基, 在 pbs 中加入500μl 的4% 聚甲醛来固定细胞。在室温下将板材加氢 30分钟, 然后取出固定物, 用 pbs 清洗细胞层3x。
注: 在此步骤中, 电池可能会在4°c 下存储数周。 - 取出 pbs, 加入 500μl 0.1% triton x-100, 使细胞渗透 15分钟. 用 pbs 清洗细胞层3x。
- 通过添加阻止缓冲液 (pbs 中的5% 牛血清) 阻止不特异性结合1小时。
- 在阻止缓冲液中稀释抗 vp2 单克隆抗体 hh7 或 hvt 感染的鸡血清, 在阻断缓冲液中加入 200μl, 并在室温下孵育 1小时. 用 pbs 清洗细胞层3x。
- 稀释二级抗体山羊抗小鼠 igg 亚历克莎568或山羊抗鸡 igg 亚历克莎488在1:200 在封堵缓冲液中, 加入200μl 每井, 在室温下孵育 1小时, 并用 pbs 清洗细胞3x。在荧光显微镜下检查蛋白质的表达。
注: 有关具有代表性的 vp2 染色结果, 请参见图 4 。
- 在感染前一天用 2.5 x 10 cef 播种的24井板中, 用步骤5.2 中获得的第二代重组 hvt 感染 cef。在感染后48小时内取出细胞培养培养基, 在 pbs 中加入500μl 的4% 聚甲醛来固定细胞。在室温下将板材加氢 30分钟, 然后取出固定物, 用 pbs 清洗细胞层3x。
-
vp2 基因的测序
- 用高保真 dna 聚合酶和引物 ul45-f1 和 ul46-r1 (表 1) 放大跨越 ul45 和 ul46 的基因间区域的 dna 序列, 以检测整个插入过程。
- 制备以下50μl 的 10倍 pfx 反应混合物, 1.5μl 的上下游引物混合物, 10μm 的10μm 上游和下游引物混合物的 1μl, 10x dntp 的 1μl, 50 mmmmso 4 的 1μl, dna 模板的 1μl, 以及 pfx dna 聚合酶的 0.5μl, 并将无核酸酶的水添加到50μl。放大程序为: 95°c, 2分钟;95°c 为 15秒, 55°c 为 30秒, 68°c 为 3分钟, 循环35分钟。将所有 pcr 产物加载到1% 琼脂糖凝胶中进行凝胶电泳。
- 按照 dna 凝胶纯化试剂盒的指示纯化 pcr 产品。将 pcr 产品的 10μl (30ngμl) 发送给测序公司, 以确认 vp2 基因的敲入。
7. 重组病毒的稳定性
- 种子 2.6 x 106 6 cef细胞进入每个 t25 瓶的前一天, 病毒扩张。
- 从步骤5.2 中解冻至少三个阳性克隆;在每个 t25 瓶中加入一小瓶细胞病毒。在38.5°c 下, 用5% 的 co2 进行培养 , 直到观察到50% 的细胞病理效应。
- 在培养基2毫升中采集细胞;感染50μl 到一个新的 t25 烧瓶预置 cef 细胞的下一代。持续传递重组病毒至少15代。通过 pcr 分析每一代病毒是否存在 vp2 序列, 并通过 vp2 表达的间接免疫荧光分析 (ifa) 来评估重组病毒的稳定性。
Representative Results
图 1概述了用于生成重组 hvt 疫苗的策略, 其中包括供体质粒的构建方式 (图 1a)和生成重组 hvt 疫苗的过程 (图 1b) 。).在荧光显微镜下, 在转染和感染后的基因敲入井中可以观察到5到 30个 gfp 阳性斑块。通过 3 ' 结点 pcr 对单细胞分选后获得的纯化病毒 (图 2a) 进行了分析, 该 pcr 显示了预期大小的 pcr 产物 (图 2a, 底部面板)。在 cre 重组酶对 gfp 记者进行切除后, 超过50% 的斑块失去了 gfp 表达。通过单细胞分选纯化的 gfp 切除后的斑块 (图 2b) 通过 5 ' 结 pcr 进一步证实, 该 pcr 表达物显示了合适大小的 pcr 产物 (图 2b, 底部面板)。图 3显示了具有不同颜色元素的两个结点 pcr 产品的测序结果。在图 4中, ifa 用 vp2 特异性单克隆抗体和抗 hvt 鸡血清证实了蛋白质的表达。正如预期的那样, 感染父母 hvt 的细胞只能被抗 hvt 血清 (绿色) 染色, 而重组 hvt 感染细胞清楚地显示 vp2 基因 (红色) 的表达。
图 1:重组 hvt-vectored 疫苗的生成策略.(a) 该面板显示供体质粒构建克隆策略的示意图。关键要素包括两个用于释放插入物的 cas9 靶点 (sga)、用于切割 gfp 的带有 loxp 序列的记者 gfp 盒式磁带和 vp2 表达盒式磁带。(b) 这个面板概述了两步基因敲入策略。gfp 和 vp2 表达盒的插入片段由 cas9/sga 裂解释放, 并通过nhej-crisprcy9 插入 ul45/46 loci hvt 基因组。然后用单细胞荧光活化细胞分选 (facs) 对 gfp 阳性重组病毒进行分类和纯化。随后, 用 cre 重组酶切除 gfp 记者基因, 对重组病毒进行纯化和鉴定。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 重组 hvt 的验证.(a) 该面板显示了在荧光显微镜 (顶板) 下显示的 gfp 阳性斑块 (hvt-gfp-vp2), 以及对 hvt-gfp-vp2 的 pcr 验证, 并对其进行 pp-fp-vp2 的 pcr 验证, 并对 3 ' 结点进行引物 vp2-f & ul46-r1。(b) 该面板显示了 hvt-gfp-vp2 gfp 切除后的斑块 (hvt-vp2), 使用 cre 重组酶和 pcr 验证 hvt-vp2 与引物-f1-理想, vp2-r1 为 5 ' 交接。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 重组 hvt 病毒的序列分析.(a) 该面板中不同颜色的关键元素序列是 ul45p-4 46 之间的 hvt 基因间区域, grna 目标序列下划线, 以及显示 cas9 裂解位点的箭头, vp2 表达式盒式磁带, 其末端序列在斜体小写, sg-a 目标序列在红色与箭头显示 cas9 裂解站点, loxp 站点序列在绿色, 并且二个 sg-A 站点序列在蓝色。(b) 该面板显示 5 ' 和 3 ' 路口的测序结果, 以及 hvt-vp2 的示意图, 其中包含以序列形式显示相应颜色的关键元素。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 重组 hvt-vp2 的表征.该面板显示了用抗 vp2 单克隆抗体 hh7 (红色) 间接免疫荧光法 (ifa) 证实 vp2 在感染 cef 中的成功表达。ifa 用感染 hvt 的鸡血清 (绿色) 证实了 hvt 感染。刻度栏 = 20μm. 请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
crispr/cas9 系统已成为基因编辑的宝贵工具。重组 hvt 矢量开发的传统技术, 如同源重组13和 bac 诱变技术25, 通常涉及几轮载体克隆和选择, 以及大规模筛选,这可能需要几个月的时间。这里描述的协议使用基于 nhej-crisprs"的策略, 结合 cre-lox 系统和单细胞分类, 是重组疫苗生成中更方便、高效和更快的方法。使用该管道, 重组病毒仅可在 1-2周 24内获得, 也可将使用荧光激活细胞分选17的斑块纯化步骤简化为单轮分离.从 grna 设计和供体构建到获得纯化的重组 hvt 病毒的整个过程, 可在1个月内实现。成功重组 hvt 生成的关键步骤包括高效的 grna 选择, 以确定病毒基因组的目标, 以确保有效的分离为外源基因插入, 高转染效率, 以最大限度地提高 cas9/grna 和病毒在同一细胞中相遇进行编辑, 以及捐献者和 grna 质粒的转染与病毒感染之间的12小时间隔, 以允许 cas9 和 grna 在病毒进入细胞之前以合理的水平表达。
hvt 重组生成的局限性在于结合点 pcr 鉴定 gfp 阳性克隆的复杂性。gfp-vp2 盒式磁带可以插入任一方向。这里描述的连接点 pcr 仅为插入的识别在感觉方向。在反义方向插入的情况下, 使用所述引物对的 pcr 将不起作用, 内部引物可以为此目的进行交换。另一个潜在的问题是, 由于 cre 处理的 gfp 去除后存在剩余的氧 p 序列, 供体结构只能用于同一病毒中的一个基因插入。具有变体 loxp 序列的新供体构造可用于多个插入目的。
nhej 和 hdr (同源修复) 是修复 cas926,27 创建的双链断裂 (dsb) 的两种途径。nhej 在整个细胞周期28中效率更高, 而 hdr 效率较低, 仅发生在 s 和 g2 阶段6、29、30。我们利用更有效的 nhej 修复途径在这里将外源基因引入目标位置。尽管 nhej 修复可能会通过同源独立的机械柔性过程31、 32 在被分离的供体序列和基因组 dna 之间加入不兼容或损坏的 dna 端来引入 indels。只能发生在 sga 的裂解部位, 异物基因表达盒不受影响。这种方法的另一个优点是 nhej 不受同源手臂构造的限制, 使克隆步骤非常简单。这为 nhej 在外源基因插入中的应用提供了巨大的潜力。在外源基因盒两端引入一个通用的 grna 靶点, 使得这一过程更快, 因为捐献者模板可以直接构建, 而不需要特定的 grna 选择。含有 sga 靶点、loxp 位点、paci 和 sgA 位点的供体质粒的主干也可以在不同的报告基因、外源基因表达盒和不同的病毒载体之间广泛共享, 使这种新方法具有以下优势:定制。
本文用 hvt-隐藏的 vp2 插入物来描述本手稿中的协议;然而, 同样的方法也可用于在 hvt 基因组的不同基因组位置插入更多的病毒基因, 使用 grna 针对所需的相应序列来开发多价重组 hvt vvt vectored 疫苗。其他 mdv 疫苗株, 如 sb-1 和 CVI988, 其他鸟类疱疹病毒, 包括传染性喉气管炎病毒和鸭肠炎病毒, 以及其他鸟类 dna 病毒, 如病毒和腺病毒, 也可以使用相同的工程多价重组疫苗的开发方法。使用此处描述的 crispr/cas9 系统平台开发新的多价 vectored 疫苗, 将对家禽行业预防多种家禽疾病极为有益。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢皮帕·霍斯帮助进行共聚焦成像。该项目得到生物技术和生物科学研究理事会 (bbsrc) 的支持, 提供 bbssee/00007034 和 bb/l102262/。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
| Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
| Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
| HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
| pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
| pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
| PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
| SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
| TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
| Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
| Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
| FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
| Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |
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