Summary
ההרפס של תרנגולי הודו (גבוהה) משמש כפלטפורמה וקטור לדור של recombinant חיסונים נגד מספר מחלות העופות. מאמר זה מתאר גישה פשוטה ומהירה לדור של recombinant חיסונים HVT-הווקטורי שימוש משולב NHEJ-CRISPR/Cas9 ומערכת Cre-לקס.
Abstract
ההרפס של תרנגולי הודו (גבוהה) הוא וקטור ויראלי אידיאלי לדור של recombinant חיסונים נגד מספר מחלות העופות, כמו שפעת העופות (AI), מחלת ניוקאסל (ND), ומחלות זיהומיות bursal (מחלת המעי הדלקתי), באמצעות חיידקים כרומוזום מלאכותיים ( מוטגנזה מכוונת BAC) או שיטות קונבנציונליות רקומבינציה. באופן קבוע באשכולות interspaced palindromic חזרה (CRISPR) / Cas9 בהצלחה נעשה שימוש בהגדרות רבות לעריכת ג'ין, כולל המניפולציה של מספר גדול וירוס DNA הגנום. פיתחנו מהיר ויעיל CRISPR/Cas9-מתווכת הגנום העריכה צינור כדי להפיק רקומביננטי HVT. כדי למקסם את פוטנציאל השימוש בשיטה זו, אנו מציגים כאן מידע מפורט על המתודולוגיה של יצירת HVT רקומביננטי לבטא את החלבון VP2 של IBDV. בקלטת ביטוי VP2 מוכנס לתוך HVT הגנום באמצעות NHEJ (nonhomologous סוף-הצטרפות)-מסלול התיקון תלויים. קלטת ביטוי חלבון (GFP) זריחה ירוק מחוברת קודם תותב להמחשת קל והוציאו ואז המערכת באמצעות Cre-LoxP. גישה זו מציעה דרך יעילה להציג אנטיגנים נגיפיים אחרים לתוך הגנום HVT עבור ההתפתחות המהירה של חיסונים רקומביננטי.
Introduction
המחלה של מארק (MD) היא מחלה lymphoproliferative של תרנגולות המושרה על ידי serotype 1 (2 ההרפס Gallid [GAHV-2]) של סוג Mardivirus ב תת-משפחה של Alphaherpesvirinae. Mardivirus כולל גם שתי nonpathogenic אשר נגרמו מהזנים אליהם: אדנו 2 (GaHV-3), אדנו 3 (MeHV-1, ידועות בהיסטוריה כמהלך HVT) אשר משמשות חיסונים נגד MD. תרכיב חי HVT (זן FC-126) הוא הדור הראשון של החיסון MD בשימוש בשנות השבעים המוקדמות, הנמצאת עדיין בשימוש נרחב ניסוחים חיסון טרינארית, ערכיות לספק של הגנה משופרת מפני MD. HVT משמש גם נרחב וקטור החיסון לגרום להגנה מפני מספר מחלות העופות בשל צדדיות שלה בטיחות ב ovo , מדגרת תת עורית המינהל וגם יכולת למתן חיסון לכל החיים. האסטרטגיה לייצר חיסונים HVT רקומביננטי מבוסס על רקומבינציה הומולוגית קונבנציונאלי או תאים הנגועים בנגיף, cosmid חופפים DNAs או BAC מוטגנזה מכוונת2. עם זאת, שיטות אלה הן בדרך כלל מהגידולים, המחייב הבנייה של העברת וקטורים, שמירה על הגנום הנגיפי ב- Escherichia coli, רובד purifications, והסרה של רצף BAC והבחירה ועתירת סמן וירוסים הערוך3,4.
CRISPR הקשורים (Cas9) הוא הגן הפופולרי ביותר כלי לעריכת בשנים האחרונות בשל צדדיות שלה ירידה לפרטים. מערכת CRISPR/Cas9 בהצלחה שימשה דור יעיל של תאים מהונדסים, מודלים בעלי חיים5,6,7,8,9,10, ובכן כמו המניפולציה של מספר גדול וירוס DNA הגנום11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. לאחר דיווח שיטה פשוטה ויעילה באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 כדי לערוך את הגנום HVT21, פיתחנו צינור לדור מהיר ויעיל של רקומביננטי HVT22.
על מנת להרחיב את פוטנציאל היישום של שיטה זו, אנו מתארים את המתודולוגיה מפורט לדור של רקומביננטי חיסון HVT לבטא את הגן VP2 של IBDV-מיקומה UL45/46 בדו ח זה. הגישה משלבת NHEJ-CRISPR/Cas9 כדי להוסיף את הגן VP2 מתויג עם GFP מדווח ומערכת Cre-LoxP כדי להסיר את הקלטת ביטוי GFP מאוחר יותר. לעומת רקומבינציה מסורתית וטכניקות recombineering BAC, נדגים כי NHEJ-CRISPR/Cas9 יחד עם מערכת Cre-סלומון היא גישה מהיר ויעיל להפקת החיסון HVT רקומביננטי.
Protocol
1. הכנת Cas9/gRNA ביטוי ובונה התורם
-
בנייה של פלסמידים ביטוי Cas9/gRNA
- עיצוב רצף gRNA מיקוד intergenic אזור בין הגנים UL45 ו- UL46 של HVT כפי שתואר לעיל22. יישר את רצף המטרה מדריך-RNA כנגד הגנום HVT כדי לשלול כל רצפי חופש-יעד פוטנציאליים הגנום HVT. לסנתז, לשכפל את רצף gRNA פילוח אזור UL45/46 ו- sg-A רצף של נתונים שפורסמו23 לתוך pX459-V2 כפי שתואר לעיל22. ודא את רצף gRNA המשוכפל מאת סנגר רצף באמצעות פריימר U6-Fwd24.
-
בנייה של התורם פלסמיד
- כדי ליצור של התורם פלסמיד המכיל את הקלטת VP2 ביטוי מתויג עם קלטת כתב GFP נשלף, עיצוב oligos התורם-F ותורם-R המכיל את הרכיבים הבאים (איור 1א' ואיור 3א): sg-A רצף המטרה-מסתיים, אתר פאצי תמר מוקף עם שני רצפים LoxP שכפול ה-קלטת כתב ה-GFP, כריתה, והן בשני אתרים SfiI עבור השיבוט בקלטת ביטוי VP2.
- לשכפל את הרצף לתוך וקטור pGEM-T-קל ו, אז, שיבוט הקלטות גן ה-GFP, VP2 לתוך הווקטור שנוצר כדי להפיק את פלסמיד התורם כמנהל pGEM-מועצת התלמידים-GFP-VP222.
הערה: כל וקטור השיבוט יכול לשמש כדי לבנות התורם פלסמיד.
-
פלסמיד DNA הכנה
- להכין פלסמיד התורם והן פלסמיד ביטוי Cas9/gRNA DNAs באמצעות ערכת חילוץ DNA מסחרי על פי הוראות היצרן.
2. CRISPR/Cas9-מתווכת טוק-in: תקנים ולדלקת
- יום לפני תרביות תאים, להכין חומוס העובר fibroblasts (CEFs) תרביות תאים/הזיהום, באמצעות עוברי 10 - בן יום M199 בינוני בתוספת 5% סרום שור עוברית (FBS), 10% tryptose פוספט מרק, פניצילין U/mL 100-סטרפטומיצין, ו fungizone 0.25 µg/mL. זרע 1.3 x 106 תאים לכל לחדר כל טוב של צלחת 6-ובכן ב- 2.5 מ של מדיום.
הערה: תאים CEF יכול להישמר עבור 3 d-4 מעלות צלזיוס. - Transfect CEF תאים (שלב מוכן ב 2.1) עם 0.5 µg של UL45/46-gRNA, 0.5 µg של sg 1 µg של pGEM-מועצת התלמידים-GFP-VP2 באמצעות ריאגנט של תרביות תאים המתאימים על פי הוראות היצרן. דגירה התאים במשך 12 שעות בתוך אינקובטור (ב- 38.5 ° C עם 5% CO2).
- 12 שעות posttransfection של Cas9/gRNA, התורם פלסמידים, לדלל את המניה וירוס HVT M199 תרבות בינונית-עונה 1 פרק 105 pfu/מ ל.... הוסף µL 130 של הנגיף מדולל לבאר כל התאים transfected והגדר באר אחת של תאים untransfected כפקד שלילי עם אותה כמות. של וירוס. דגירה את התאים transfected/נגוע עבור בתלת-ממד ב- 38.5 ° C עם 5% CO2. לבצע את כל ההליכים שימוש משותף קוד של המנהג (JCoPR) אושרה על ידי התורמים שחיים.
3. קצירת טיהור של וירוס רקומביננטי HVT
-
תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון
- להכין שתי צלחות 96-ובכן preseeded עם 2 x 104 תאים CEF ליום טוב לפני מיון.
- Trypsinize transfected/נגוע postinfection-d CEFs 3. האחות המדיום מכל קידוח ולשטוף את הגיליון תא בתמיסת באגירה פוספט (PBS). להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA (0.48 מ"מ) כדי trypsinize את התאים בחממה 38.5 מעלות צלזיוס במשך כ 5 דקות.
- Resuspend ולהעביר את התאים לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL עם 50 µL של FBS. צנטריפוגה ב x 200 גרם במשך 5 דקות.
- Resuspend תאי 1 מ"ל של PBS עם 1% FBS. לספור את מספרי הטלפון הנייד באמצעות hemocytometer ולהתאים את מספר התאים עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
הערה: תאים ניתן לשמור על הקרח עבור h 1-2. - העבר את התאים פוליסטירן מיון הצינורית בתוך כובע מסננת שלה. למיין את התאים לבטא GFP 96-ובכן לוחות עם CEFs שימוש בסדרן תא על-פי הוראות היצרן. דגירה את התאים מיון עבור 5 d ב- 38.5 ° C עם 5% CO2.
הערה: ייתכן שיהיה צורך פסקה אחת של וירוס רקומביננטי לפני מיון אם ישנם יותר מדי תאים בודדים GFP-ביטוי ושלטים GFP-חיוביים כמה הבאר המקורי.
-
Passaging של וירוסים רקומביננטי
- הכנת לוחות 6-ובכן עם 1.3 x 10 תאים CEF6 לכל טוב יום לפני המעבר. 5 d postsorting, בדוק את הצלחות 96-ובכן תחת מיקרוסקופ זריחה. סמן הבארות המכיל שלט GFP-חיובית אחת.
הערה: ראה איור 2A עבור שלט GFP-חיוביות נציג. - Trypsinize כל GFP-חיובית עם 50 µL של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות, להוסיף 50 µL של תרבות מדיום, resuspend ולהעביר את התאים לתוך אחד טוב של צלחת 6-טוב עם CEFs. זה יהיה הדור הראשון של רקומביננטי HVT.
- הקציר הדור הראשון של וירוסים רקומביננטי בתלת-ממד אחר כך, להקפיא את בקבוקון אחד של כל 1 מ"ל להקפאת בינוני המכיל 10% עגל עוברית סרום (FCS), 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ו- 80% תרבות בינוני, לאחסן את וירוסים חנקן נוזלי.
הערה: בתקופת הקציר משתנה בין 2-4 d בהתאם לקיבולת כמות והתפשטות של הנגיף. - איסוף תאים5 עונה 1 פרק 10 של כל הדור הראשון של וירוסים, centrifuge אותם, ולמחוק את תגובת שיקוע. אחסן את התאים ב-20 ° C להפקת DNA.
- הכנת לוחות 6-ובכן עם 1.3 x 10 תאים CEF6 לכל טוב יום לפני המעבר. 5 d postsorting, בדוק את הצלחות 96-ובכן תחת מיקרוסקופ זריחה. סמן הבארות המכיל שלט GFP-חיובית אחת.
-
זיהוי של ההכנסה גנומית על ידי תגובת שרשרת פולימראזית
- להפקת DNA, הפשרה, resuspend בגדר תא מ שלב 3.2.4 עם 50 µL של מחיצות מאגר (10 מ מ טריס-HCl [pH 8], 1 מ"מ EDTA, 25 מ מ NaCl, ו- 200 µg/mL Proteinase K) ואת lyse הדגימות ב 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, , אז, ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות להשבית את ק' Proteinase
- ביצוע של תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) עם 3' צומת תחל (טבלה 1) באמצעות µL 1 של דנ א. עבור כל דגימה, הכנת המיקס התגובה 20 µL הבאים על הקרח: 2 x מיקס מאסטר PCR (10 µL), 10 מיקרומטר פריימר נגד הזרם (0.5 µL), 10 מיקרומטר במורד הזרם פריימר (0.5 µL), תבנית ה-DNA (1 µL) ומים ללא נוקלאז (8 µL). התוכנית הגברה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 95 ° C ל 30 s, 55 ° C ל 30 s, ו-72 מעלות 40 s מחזורים 35; 72 ° C עבור 7 דק 2 טען µL של המוצרים הגברה טוב אחד של 1% agarose ג'ל אלקטרופורזה בג'ל.
הערה: ראה איור 2A עבור תוצאה נציג של 3' צומת ה-PCR.
4. כריתה של ג'ין המערכת באמצעות Cre-הסלמון כתב פלורסנט
- כדי להסיר גן ה-GFP וירוס רקומביננטי, transfect 2 µg של Cre recombinase ביטוי פלסמיד המשקולת 6-ובכן, preseeded עם תאים CEF באמצעות תגובה כימית תקנים בעקבות ההוראה של היצרן.
- 12 שעות posttransfection, להפשיר בקבוקון אחד של וירוס רקומביננטי של חנקן נוזלי, resuspend בעדינות, זרע 50 µL לבאר כל התאים transfected והגדר באר אחת של הפקד שלילי עם אותה כמות של וירוס. תקופת דגירה של 3 d ב- 38.5 ° C עם 5% CO2.
5. פלאק טיהור
-
תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון
- זרע שתי צלחות 96-ובכן עם 2 x 104 תאים CEF ליום טוב לפני מיון.
- בצע את ההליכים המתוארים שלב 3.1 postinfection 72 h (משלב 4) כדי להכין את התאים הנגועים למיון. למיין את התאים nonfluorescence יחיד לתוך צלחות 96-ובכן עם CEFs.
-
Passaging של וירוסים רקומביננטי ואישור ה-PCR
- בוחר הפלאק nonfluorescence יחידה 5-10 5 d. postsorting, trypsinize אותם עם 50 µL של טריפסין-EDTA ב 38.5 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ולהוסיף 50 µL של תרבות בינוני עד resuspend את התאים.
הערה: ראה איור 2B עבור שלט נציג GFP-שלילי. - לעבור חצי של התאים לתוך כל טוב של צלחת 6-טוב preseeded עם CEFs כמו הדור השני.
- Centrifuge התאים הנותרים של כל המשובטים ב x 200 גרם במשך 5 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את התאים עם 50 µL של מחיצות מאגר להפקת DNA.
- לבצע PCR עם 5' תחל בצומת (טבלה 1) באמצעות µL 1 של תבנית ה-DNA זהה PCR תגובת למצב כפי שמתואר בשלב 3.3.2.
הערה: ראה איור 2B עבור תוצאה נציג של 5' צומת ה-PCR. - בהתבסס על תוצאות ה-PCR, לבחור שלושה עד חמישה שיבוטים חיובית של HVT רקומביננטי על קטעים נוספים ואימות.
- בוחר הפלאק nonfluorescence יחידה 5-10 5 d. postsorting, trypsinize אותם עם 50 µL של טריפסין-EDTA ב 38.5 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, ולהוסיף 50 µL של תרבות בינוני עד resuspend את התאים.
6. אימות של HVT רקומביננטי
-
Immunofluorescence עקיף assay
- להדביק CEFs עם הדור השני של רקומביננטי ש-HVT המתקבל שלב 5.2 בצלחת 24-ובכן נזרע עם 2.5 x 105 CEFs יום לפני זיהום. להסיר את postinfection 48 שעות של תרבות בינוני תא ולהוסיף 500 µL של 4% paraformaldehyde ב- PBS לתקן את התאים. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, לאחר מכן, הסרת מקבע את ולשטוף את שכבת תאים 3 x עם PBS.
הערה: התאים ניתן לאחסן ב 4 ° C בשלב זה למשך מספר שבועות. - להסיר את PBS ולהוסיף 500 µL של 0.1% טריטון X-100 כדי permeabilize את התאים עבור 15 דקות לשטוף התא שכבה 3 x עם PBS.
- בלוק כריכת ספציפי על-ידי הוספת חסימת מאגר (5%, שור סרום ב- PBS) לשעה.
- לדלל את נוגדנים חד שבטיים אנטי-VP2 נוגדן ראשוני HH7 או HVT-נגוע סרום עוף-1:200 במאגר חסימה, להוסיף µL 200 לאדם טוב, דגירה בטמפרטורת החדר במשך ה 1 לשטוף התא שכבה 3 x עם PBS.
- לדלל נוגדנים משניים עז אנטי-העכבר IgG אלקסה 568 או עז עוף אנטי איג אלקסה 488-1:200 במאגר חסימה, להוסיף µL 200 לאדם טוב, דגירה בטמפרטורת החדר מאובטח, לשטוף את התאים 3 x עם PBS. בדוק את הביטוי חלבון תחת המיקרוסקופ זריחה.
הערה: ראה איור 4 עבור VP2 נציג צביעת תוצאה.
- להדביק CEFs עם הדור השני של רקומביננטי ש-HVT המתקבל שלב 5.2 בצלחת 24-ובכן נזרע עם 2.5 x 105 CEFs יום לפני זיהום. להסיר את postinfection 48 שעות של תרבות בינוני תא ולהוסיף 500 µL של 4% paraformaldehyde ב- PBS לתקן את התאים. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, לאחר מכן, הסרת מקבע את ולשטוף את שכבת תאים 3 x עם PBS.
-
רצף של הגן VP2
- להגביר את רצף ה-DNA המתפרסות על-פני האזור intergenic UL45 ו- UL46 עם אמינות גבוהה DNA פולימראז ו תחל UL45-F1 ו UL46-R1 (טבלה 1) כדי לאתר את כל ההכנסה.
- מכינים את תערובת התגובה 50 µL הבאים: 5 µL של 10 x Pfx תערובת התגובה, µL 1.5 של 10 מיקרומטר במעלה הזרם מיקס פריימר במורד הזרם, µL 1 של 10 מ מ dNTP מיקס, µL 1 של 50 מ מ MgSO4, µL 1 של תבנית ה-DNA ואת 0.5 µL של Pfx DNA פולימראז , ולהוסיף מים נטולי נוקלאז 50 µL. התוכנית הגברה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 95 ° C 15 s, 55 ° C ל 30 s, ו- 68 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות 35 מחזורים. לטעון את כל המוצר PCR agarose 1% ג'ל אלקטרופורזה בג'ל.
- לטהר את המוצר PCR בעקבות ההוראה של ערכת טיהור DNA ג'ל. לשלוח µL 10 של המוצר PCR (30 ng/µL) חברת רצף כדי לאשר את טוק-אין של הגן VP2.
7. יציבות של וירוס רקומביננטי
- זרע 2.6 x 106 תאים CEF לתוך הבקבוק T25 כל יום לפני הרחבת וירוס.
- להפשיר לפחות שלושה שיבוטים חיוביים משלב 5.2; להוסיף בקבוקון אחד של תאים/וירוסים לתוך הבקבוק T25 בכל. דגירה ב 38.5 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 עד 50% אפקט ציטופתי נצפית.
- לקצור תאי 2 מ של תרבות בינוני; להדביק µL 50 אל בקבוק T25 החדש preseeded עם תאים CEF לדור הבא. לשמור passaging וירוס רקומביננטי לפחות 15 דורות. לנתח כל דור של וירוסים PCR לנוכחות של הרצף VP2 ועל ידי עקיפה immunofluorescence assay (IFA) לביטוי VP2 להעריך את היציבות של וירוסים רקומביננטי.
Representative Results
האסטרטגיה המשמש את הדור של החיסון HVT רקומביננטי המותווה איור 1, הכולל כמה פלסמיד התורם הוא נבנה (איור 1א') ופרוצדורות כדי להפיק את רקומביננטי HVT (איור 1B ). יכול להיות שנצפו חמש עד שלושים הפלאק GFP-חיוביים מוקפים פראי-סוג הפלאק בבארות ג'ין דופק בתחת קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ בתלת-ממד posttransfection וזיהום. הווירוס מטוהרים שהושג לאחר תא בודד מיון (איור 2א) נותחה על ידי 3' צומת PCR, שמציגה את מוצר ה-PCR של הגודל הצפוי (איור 2א, החלונית התחתונה). לאחר הכריתה של הכתב GFP מאת Cre recombinase, מעל 50% של הפלאק איבד שלהם ביטוי GFP. הפלקיו מטוהרים לאחר הכריתה GFP (איור 2B) על-ידי תא בודד מיון נוסף אושר ע י 5' צומת PCR, אשר מראה את המוצר PCR בגודל המתאים (איור 2B, החלונית התחתונה). איור 3 מראה את התוצאות רצף של צומת בשני מוצרים PCR עם אלמנטים צבעוניים שונים. איור 4, הביטוי חלבון אושר ע י IFA עם נוגדנים חד שבטיים VP2 ספציפיים, סרום אנטי-HVT עוף. כצפוי, תאים נגועים HVT הורים יכולים רק להיות מוכתמת סרום אנטי-HVT (ירוק), ואילו תאים הנגועים HVT רקומביננטי הבליטו את הביטוי של גנים VP2 (אדום).
איור 1: אסטרטגיה לדור של חלבון גבוהה-הווקטורי חיסון. (א) לוח זה מציג ייצוג סכמטי של האסטרטגיה השכפול עבור התורם פלסמיד הבנייה. רכיבי מפתח כוללים שני אתרי היעד Cas9 (התלמידים) ולשחרור הכנס קלטת GFP העיתונאית תמר מוקף עם רצפי LoxP הכריתה של GFP, בקלטת ביטוי VP2. (B) לוח זה מציג סקירה של ג'ין אסטרטגיה טוק-אין שני שלבים. השבר הוספה של ה-GFP, הקלטות ביטוי VP2 שפורסמו על ידי פצילות Cas9/מועצת התלמידים, מוכנס לתוך הגנום HVT-UL45/46 לוקוסים ויה NHEJ-CRISPR/Cas9. וירוס רקומביננטי GFP-חיובית לאחר מכן ממוינים, מטוהרת על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית תא בודד מיון (FACS). לאחר מכן, גן ה-GFP הכתב הוא טוחנות מאת Cre recombinase, וירוס רקומביננטי זה מטוהרים ולא מאופיין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : אימות של HVT רקומביננטי. (א) לוח זה מציג את שלט ה-GFP-חיוביות (HVT-GFP-VP2) דמיינו תחת המיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (החלונית העליונה) ואימות של ה-PCR של HVT-GFP-VP2 עם תחל VP2-F & UL46-R1 עבור הצומת 3'. (B) לוח זה מציג שלט (HVT-VP2) דמיינו לאחר הכריתה GFP של HVT-GFP-VP2, באמצעות Cre recombinase ואימות PCR HVT-VP2 עם תחל UL45-F1 ו- VP2-R1 עבור הצומת 5'. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : רצף ניתוח של הנגיף HVT רקומביננטי. (א) רצפי המרכיבים העיקריים בצבעים שונים בחלונית זו הם HVT באזור intergenic בין UL45/46 עם הרצף היעד gRNA בקו תחתון, חץ מציג האתר פצילות Cas9, בקלטת ביטוי VP2 עם תום רצף ב וקטנות נטוי, הרצף sg-A היעד באדום עם החץ מציג האתר פצילות Cas9 הרצף באתר LoxP בירוק, שני סיקוונסים אתרי SfiI בכחול. (B) לוח זה מראה את התוצאות רצף של צמתים של 5' ו 3' וכן מצגת סכמטי של HVT-VP2 עם רכיבי מפתח עם הצבעים המתאימים המוצגים רצפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : אפיון recombinant HVT-VP2. לוח זה מציג האישור של הביטוי המוצלח של VP2 ב CEFs נגוע על-ידי עקיפה immunofluorescence assay (IFA) עם נוגדנים חד שבטיים אנטי-VP2 HH7 (אדום). זיהום HVT אושר על ידי IFA עם עוף נגוע HVT סרום (ירוק). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
מערכת CRISPR/Cas9 הפך כלי חשוב בעריכת ג'ין. הטכנולוגיות מסורתי עבור רקומביננטי HVT וקטור הפיתוח והבנייה רקומבינציה הומולוגית13 ו BAC מוטגנזה מכוונת טכנולוגיה25, בדרך כלל כרוכים כמה סבבים של וקטור שיבוט, בחירה, כמו גם ההקרנה בקנה מידה גדול, אשר עשויה להימשך מספר חודשים. פרוטוקול המתואר כאן באמצעות אסטרטגיית NHEJ-CRISPR/Cas9 מבוססי בשילוב עם מערכת Cre-לקס ומיון תא בודד הוא יותר בגישה נוח, יעיל ומהיר בדור תרכיב רקומביננטי. באמצעות צינור זה, ניתן להשיג את הוירוס רקומביננטי בתוך 1-2 שבועות רק24, גם יכול להיות מופחת פלאק טיהור צעדים כדי פרידה בסיבוב יחיד באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון17. ניתן להשיג את כל התהליך, gRNA בנייה ועיצוב התורם להשגת הווירוס HVT מטוהרים רקומביננטי, תוך חודש. השלבים הקריטיים לדור HVT רקומביננטי מוצלחת כוללים הבחירה gRNA יעילות גבוהה עבור מיקוד הגנום הנגיפי כדי להבטיח המחשוף יעיל עבור ההוספה גנים זרים, יעילות גבוהה תרביות תאים כדי למקסם את הסיכוי לקבלת Cas9 / gRNAs, הווירוס להיפגש באותו התא לצורך עריכה, 24 שעות ביממה המרווח בין תרביות של תאים של פלסמידים התורם ואת gRNA ואת זיהום נגיפי כדי לאפשר Cas9 gRNA לבוא לידי ביטוי, ברמה סבירה לפני הווירוס לתוך התאים.
המגבלה עבור הדור רקומביננטי HVT היא שהמורכבות של הזיהוי של ה-GFP-חיוביות שיבוטים על-ידי צומת ה-PCR. יכול להיות מוכנס הקלטות GFP-VP2 בכיוון אחד. צומת שה-PCR המתוארים כאן היא רק לצורך זיהוי להוסיף חוש הכיוון. במקרה של הוספת בכיוון antisense, PCR באמצעות זוגות פריימר תיאר לא יעבדו, תחל פנימי יכול להיות מוחלפים למטרה זו. עוד בעיה היא כי הבונה התורם יכול לשמש רק עבור הכניסה אחד הגנים בוירוס זהה בשל קיומה של הרצף LoxP שנותרו לאחר הסרת GFP על ידי טיפול Cre. מבנה חדש תורם בווריאציה רצף LoxP יכול לשמש במקום למטרה ההכנסה מרובים.
NHEJ HDR (תיקון מכוון הומולוגיה) שני מסלולים כדי לתקן את השברים גדילי כפול (DSBs) נוצר על ידי26,Cas927בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. NHEJ יעיל יותר כאשר היא מתרחשת במהלך מחזור התא28, ואילו HDR יעילה פחות, מתרחשת רק במהלך S ו G2 שלבים6,29,30. אנו לנצל יותר יעיל NHEJ תיקון מסלול כאן כדי להחדיר גנים זרים אל המיקומים יישוב. למרות NHEJ תיקון יכול להכיר indels על ידי הצטרפות קצוות הדנ א noncompatible או פגום דרך בגודל שאינו תלוי-הומולוגיה תהליך גמיש mechanistically31,32 בין התורם cleaved רצף הדנ א, indels יכולה להתרחש רק האתרים המחשוף של התלמידים, הקלטת ביטוי גנים זרים אינו מושפע. יתרון נוסף של גישה זו היא NHEJ ללא ההגבלה הומולוגיה זרוע הבנייה, ביצוע השיבוט צעד מאוד פשוטה. זה יבקש פוטנציאל גדול עבור היישום של NHEJ להכנסה גנים זרים. המבוא של אתר יעד gRNA אוניברסלי בשני הקצוות של גורם קלטת גנים זרים תהליך מהירה יותר כמו התבנית התורם יכול להיבנות מיד ללא צורך הבחירה gRNA ספציפי. עמוד השדרה של התורם פלסמיד המכיל אתרי היעד מועצת התלמידים, LoxP אתרים ואתרי פאצי, SfiI יכול גם להיות משותף נרחב בין הכתב שונה גנים, גנים זרים קלטות וקטורים וירוסים שונים, מתן גישה חדשה זו היתרון של התאמה אישית.
תותב VP2 מחסה HVT השתמשו כדי לתאר את הפרוטוקול בכתב יד זה; עם זאת, אותה גישה יכול לשמש כדי להוסיף יותר ויראלי גנים במקומות שונים גנומית של הגנום HVT באמצעות gRNA את פילוח הרצף המתאימים הרצוי לפיתוח חיסונים HVT הווקטורי רקומביננטי multivalent. זנים חיסון MDV אחרים, כגון SB-1 ו- CVI988, herpesviruses העופות האחרים, כולל וירוסים זיהומיות laryngotracheitis וירוס דלקת מעיים ברווז, ואני גם העופות DNA וירוסים אחרים, כגון אבעבועות וירוסים ו- adenoviruses, גם ניתן לתכנן באמצעות אותו גישת לפיתוח תרכיב רקומביננטי multivalent. פיתוח חיסונים חדשים multivalent הווקטורי באמצעות פלטפורמת מערכת CRISPR/Cas9 המתוארים כאן יהיה מאוד מועיל עבור תעשיית העופות בהגנה מפני מספר מחלות עופות.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה פיפה האווס עוזר עם ההדמיה קונפוקלי. פרויקט זה נתמך על ידי הביוטכנולוגיה ומענקים המועצה למחקר מדעי ביולוגיים (BBSRC) BBS/E/אני/00007034 ו- BB/L014262/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
| Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
| Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
| HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
| pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
| pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
| PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
| SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
| TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
| Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
| Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
| FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
| Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |
References
- Witter, R. L., Solomon, J. J. Experimental infection of turkeys and chickens with a herpesvirus of turkeys (HVT). Avian Diseases. 16 (1), 34-44 (1972).
- Baigent, S. J., et al. Herpesvirus of turkey reconstituted from bacterial artificial chromosome clones induces protection against Marek's disease. Journal of General Virology. 87, Pt 4 769-776 (2006).
- Messerle, M., Crnkovic, I., Hammerschmidt, W., Ziegler, H., Koszinowski, U. H. Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14759-14763 (1997).
- Zhao, Y., Nair, V. Mutagenesis of the repeat regions of herpesviruses cloned as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. 634, 53-74 (2010).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Research. 24 (1), 122-125 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via. Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).
- Zhang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated chicken Stra8 gene knockout and inhibition of male germ cell differentiation. PLoS One. 12 (2), 0172207 (2017).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathogens. 10 (5), 1004090 (2014).
- Bierle, C. J., Anderholm, K. M., Wang, J. B., McVoy, M. A., Schleiss, M. R. Targeted mutagenesis of guinea pig cytomegalovirus using CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Journal of Virology. 90 (15), 6989-6998 (2016).
- Suenaga, T., Kohyama, M., Hirayasu, K., Arase, H. Engineering large viral DNA genomes using the CRISPR-Cas9 system. Microbiology and Immunology. 58 (9), 513-522 (2014).
- Xu, A., et al. A simple and rapid approach to manipulate pseudorabies virus genome by CRISPR/Cas9 system. Biotechnology Letters. 37 (6), 1265-1272 (2015).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. Journal of Virology. 89 (9), 5176-5179 (2015).
- Yuen, K. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein-Barr virus in human cells. Journal of General Virology. 96, Pt 3 626-636 (2015).
- Liang, X., et al. A CRISPR/Cas9 and Cre/Lox system-based express vaccine development strategy against re-emerging Pseudorabies virus. Scientific Reports. 6, 19176 (2016).
- Zou, Z., et al. Construction of a highly efficient CRISPR/Cas9-mediated duck enteritis virus-based vaccine against H5N1 avian influenza virus and duck Tembusu virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 1478 (2017).
- Peng, Z., et al. Pseudorabies virus can escape from CRISPR-Cas9-mediated inhibition. Virus Research. 223, 197-205 (2016).
- Tang, Y. D., et al. Live attenuated pseudorabies virus developed using the CRISPR/Cas9 system. Virus Research. 225, 33-39 (2016).
- Yao, Y., Bassett, A., Nair, V. Targeted editing of avian herpesvirus vaccine vector using CRISPR/Cas9 nucleases. Journal of Vaccine and Technologies. 1, (2016).
- Tang, N., et al. A simple and rapid approach to develop recombinant avian herpesvirus vectored vaccines using CRISPR/Cas9 system. Vaccine. 36 (5), 716-722 (2018).
- He, X., et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via. CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Research. 44 (9), 85 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Petherbridge, L., et al. Cloning of Gallid herpesvirus 3 (Marek's disease virus serotype-2) genome as infectious bacterial artificial chromosomes for analysis of viral gene functions. Journal of Virological Methods. 158 (1-2), 11-17 (2009).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
