火鸡疱疹病毒 (hvt) 被广泛用作生成针对多种鸟类疾病的重组疫苗的载体平台。本文介绍了一种使用集成的 nhej-crispr/cas9 和 cre-lox 系统生成重组 hvt-vectored 疫苗的简单而快速的方法。
火鸡疱疹病毒 (hvt) 是一种理想的病毒载体, 用于利用细菌人工染色体生成针对禽流感 (ai)、纽卡斯尔病 (nd) 和传染性法氏囊病 (ibd) 等多种禽流感疾病的重组疫苗 (b c) 诱变或常规重组方法。聚集在一定时间内间隔的回文重复 (CRISPR)/Cas9 系统已成功地用于许多环境中的基因编辑, 包括操作几个大型 dna 病毒基因组。我们开发了一个快速高效的 crispr/cas9 介导的基因组编辑管道, 以生成重组 hvt。为了最大限度地发挥这种方法的潜在用途, 我们在这里提供了有关生成表达 ibdv vp2 蛋白的重组 hvt 的方法的详细信息。vp2 表达盒通过nhej (非同源端接) 依赖修复途径插入 hvt 基因组。绿色荧光蛋白 (gfp) 表达盒首先连接到插入物上, 以便于可视化, 然后通过Cre-LoxP 系统取出。这种方法为将其他病毒抗原引入 hvt 基因组提供了一种有效的方法, 用于重组疫苗的快速开发。
marek 病 (md) 是由金银花属病毒血清型 1 (gallid 疱疹病毒 2 [ghv-2]) 引起的鸡淋巴增生性疾病。马迪病毒还包括两种非致病性血清型: 血清型 2 (gahv-3) 和血清型 3 (mehv-1, 历史上被称为 hvt), 用作对抗 md 的疫苗。活 hvt 疫苗 (fc-126 菌株) 是上世纪70年代初使用的第一代 md 疫苗, 目前仍被广泛用于二价和多价疫苗配方, 以增强对 md 的防护。hvt 还被广泛用作疫苗载体, 以诱导预防一些禽流感疾病, 因为它的多功能性和安全性, 无论是在奥沃和皮下孵化场的管理, 并提供终身免疫能力。重组 hvt 疫苗的生成策略是基于病毒感染细胞的常规同源重组、重叠的宇宙中 dna 或 bac 诱变 2.然而, 这些方法通常是耗时和劳动密集型的, 需要构建转移载体, 维持大肠杆菌的病毒基因组,斑块纯化, 以及去除 bac 序列和选择标记, 从编辑的病毒3,4。
crispr 关联 (cas9) 是近年来最流行的基因编辑工具, 因为它具有多功能性和特异性。crispr/cas9 系统已成功地用于转基因细胞和动物模型的高效生成5、6、7、8、9、10.以及在操纵几个大的 dna 病毒基因组11,12,13, 14,15,16,17, 18,19,20。在报告了一种使用 crispr/cas9 系统编辑 hvt 基因组 21的简单而有效的方法后, 我们开发了一种快速高效地生成重组 hvt22的管道。
为了扩大该方法的潜在应用范围, 本文介绍了在 UL45/46 位点生成表达 ibdv vp2 基因的重组 hvt 疫苗的详细方法。该方法结合 nhej-crispr/cas9 插入带有 gfp 记者基因标记的 vp2 基因和 cre-loxp 系统, 以去除 gfp 表达盒。与传统的重组和 bac 重组技术相比, nhej-crispr/cas9 与 cre-lox 系统相结合是一种快速有效的重组 hvt 疫苗生成方法。
crispr/cas9 系统已成为基因编辑的宝贵工具。重组 hvt 矢量开发的传统技术, 如同源重组13和 bac 诱变技术25, 通常涉及几轮载体克隆和选择, 以及大规模筛选,这可能需要几个月的时间。这里描述的协议使用基于 nhej-crisprs”的策略, 结合 cre-lox 系统和单细胞分类, 是重组疫苗生成中更方便、高效和更快的方法。使用该管道, 重组病毒仅可在 1-2周 24内获得, 也可将使用荧光激活细胞分选17的斑块纯化步骤简化为单轮分离.从 grna 设计和供体构建到获得纯化的重组 hvt 病毒的整个过程, 可在1个月内实现。成功重组 hvt 生成的关键步骤包括高效的 grna 选择, 以确定病毒基因组的目标, 以确保有效的分离为外源基因插入, 高转染效率, 以最大限度地提高 cas9/grna 和病毒在同一细胞中相遇进行编辑, 以及捐献者和 grna 质粒的转染与病毒感染之间的12小时间隔, 以允许 cas9 和 grna 在病毒进入细胞之前以合理的水平表达。
hvt 重组生成的局限性在于结合点 pcr 鉴定 gfp 阳性克隆的复杂性。gfp-vp2 盒式磁带可以插入任一方向。这里描述的连接点 pcr 仅为插入的识别在感觉方向。在反义方向插入的情况下, 使用所述引物对的 pcr 将不起作用, 内部引物可以为此目的进行交换。另一个潜在的问题是, 由于 cre 处理的 gfp 去除后存在剩余的氧 p 序列, 供体结构只能用于同一病毒中的一个基因插入。具有变体 loxp 序列的新供体构造可用于多个插入目的。
nhej 和 hdr (同源修复) 是修复 cas926,27 创建的双链断裂 (dsb) 的两种途径。nhej 在整个细胞周期28中效率更高, 而 hdr 效率较低, 仅发生在 s 和 g2 阶段6、29、30。我们利用更有效的 nhej 修复途径在这里将外源基因引入目标位置。尽管 nhej 修复可能会通过同源独立的机械柔性过程31、 32 在被分离的供体序列和基因组 dna 之间加入不兼容或损坏的 dna 端来引入 indels。只能发生在 sga 的裂解部位, 异物基因表达盒不受影响。这种方法的另一个优点是 nhej 不受同源手臂构造的限制, 使克隆步骤非常简单。这为 nhej 在外源基因插入中的应用提供了巨大的潜力。在外源基因盒两端引入一个通用的 grna 靶点, 使得这一过程更快, 因为捐献者模板可以直接构建, 而不需要特定的 grna 选择。含有 sga 靶点、loxp 位点、paci 和 sgA 位点的供体质粒的主干也可以在不同的报告基因、外源基因表达盒和不同的病毒载体之间广泛共享, 使这种新方法具有以下优势:定制。
本文用 hvt-隐藏的 vp2 插入物来描述本手稿中的协议;然而, 同样的方法也可用于在 hvt 基因组的不同基因组位置插入更多的病毒基因, 使用 grna 针对所需的相应序列来开发多价重组 hvt vvt vectored 疫苗。其他 mdv 疫苗株, 如 sb-1 和 CVI988, 其他鸟类疱疹病毒, 包括传染性喉气管炎病毒和鸭肠炎病毒, 以及其他鸟类 dna 病毒, 如病毒和腺病毒, 也可以使用相同的工程多价重组疫苗的开发方法。使用此处描述的 crispr/cas9 系统平台开发新的多价 vectored 疫苗, 将对家禽行业预防多种家禽疾病极为有益。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢皮帕·霍斯帮助进行共聚焦成像。该项目得到生物技术和生物科学研究理事会 (bbsrc) 的支持, 提供 bbssee/00007034 和 bb/l102262/。
M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |