Herpesvirus af kalkuner (HVT) er udbredt som en vektor platform for generation af rekombinante vacciner mod en række fjerkræsygdomme. Denne artikel beskriver en enkel og hurtig tilgang for generation af rekombinant HVT-vektoriserede vacciner ved hjælp af en integreret NHEJ-CRISPR/Cas9, og Cre-Lox system.
Herpesvirus af kalkuner (HVT) er en ideelle viral vektor for generation af rekombinante vacciner mod en række aviær sygdomme som aviær influenza (AI), Newcastle disease (ND) og smitsomme bursal disease (IBD), ved hjælp af bakteriel kunstige kromosom ( BAC) mutagenese eller konventionelle rekombination metoder. De grupperede regelmæssigt interspaced palindromiske gentagelser (CRISPR) / Cas9 systemet held har været anvendt i mange indstillinger for gen redigering, herunder manipulation af flere store DNA virus genomer. Vi har udviklet en effektiv og hurtig CRISPR/Cas9-medieret genom redigering rørledningen for at generere rekombinant HVT. For at maksimere den potentielle anvendelse af denne metode, præsenterer vi her detaljerede oplysninger om metoden til at generere rekombinant HVT udtrykker VP2 protein af IBDV. VP2 udtryk kassette er isat i HVT genom via en NHEJ (nonhomologous slutningen-sammenføjning)-afhængige reparation pathway. En grøn fluorescens protein (NGL) udtryk kassette er først knyttet til indsatsen til nem visualisering og derefter fjernet via Cre-LoxP system. Denne tilgang tilbyder en effektiv måde at indføre andre virale antigener i HVT genom for den hurtige udvikling af rekombinante vacciner.
Mareks sygdom (MD) er en Lymfoproliferative sygdom af kyllinger induceret af serotype 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) af slægten Mardivirus i underfamilie af Alphaherpesvirinae. Mardivirus indeholder også to nonpathogenic serotyper: serotype 2 (GaHV-3) og serotype 3 (MeHV-1, historisk kendt som HVT) der anvendes som vacciner mod MD. Levende HVT vaccine (FC-126 stamme) er den første generation af MD vaccine bruges i begyndelsen af 1970 ‘ erne og er stadig bliver brugt bredt i bivalent og polyvalent vaccine formuleringer til en forbedret beskyttelse mod MD. HVT er også almindeligt anvendt som en vaccine vektor til fremkalde beskyttelse mod en række aviær sygdomme på grund af sin alsidighed og sikkerhed for både i ovo og subkutane rugeri administration og evnen til at give en livslang immunitet. Strategi til at generere rekombinant HVT vacciner er baseret på enten konventionel homologe rekombination i virus-inficerede celler, overlappende cosmid DNAs eller BAC mutagenese2. Men disse metoder er generelt tidskrævende og arbejdskrævende, kræver opbygningen af overførsel vektorer, vedligeholdelse af det virale genom i Escherichia coli, plaque purifications, og fjernelse af BAC sekvens og udvalg markør fra redigerede virus3,4.
CRISPR/associerede (Cas9) er den mest populære gen redaktion værktøj i de seneste år på grund af sin alsidighed og specificitet. CRISPR/Cas9-systemet har været med succes brugt i effektiv generation af genetisk modificerede celler og dyremodeller5,6,7,8,9,10, som samt i manipulation af flere store DNA virus genomer11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Efter rapportering af en enkel og effektiv metode bruger CRISPR/Cas9 system til at redigere HVT genom21, udviklede vi en rørledning til hurtig og effektiv generation af rekombinant HVT22.
For at udvide den potentielle anvendelse af denne metode, beskriver vi den detaljerede metodologi for generation af rekombinant HVT vaccine giver udtryk for VP2-gen af IBDV på UL45/46 locus i denne betænkning. Metoden kombinerer NHEJ-CRISPR/Cas9 for at indsætte det VP2 gen markeret med normal god landbrugspraksis reporter gen og Cre-LoxP system til at fjerne normal god landbrugspraksis udtryk kassette senere. Sammenlignet med traditionelle rekombination og BAC recombineering teknikker, viser vi, at NHEJ-CRISPR/Cas9 samt en Cre-Lox system er en hurtig og effektiv tilgang til at generere rekombinant HVT vaccine.
CRISPR/Cas9-system er blevet et værdifuldt værktøj i gen redigering. De traditionelle teknologier til rekombinant HVT vektor udvikling, såsom homologe rekombination13 og BAC mutagenese teknologi25, indebærer normalt flere runder af vektor kloning og udvalg samt omfattende screening, som kan tage flere måneder. Protokollen beskrevet her ved hjælp af en NHEJ-CRISPR/Cas9-baseret strategi kombineret med Cre-Lox system og én celle sortering er mere en praktisk, effektiv og hurtigere tilgang i rekombinant vaccine generation. Ved hjælp af denne rørledning, den rekombinante virus kan opnås inden for kun 1-2 uger24, og plaque rensning trin kan også reduceres til en enkelt-skuds adskillelse ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering17. Hele processen, fra gRNA design og donor konstruktion til at få renset rekombinant HVT virus, kan nås inden for 1 måned. Kritiske trin til vellykket rekombinant HVT generation omfatter højeffektiv gRNA udvalg for at målrette det virale genom for at sikre effektiv kavalergang for udenlandske gen indsættelse, høj Transfektion effektivitet til at maksimere chancen for Cas9 / gRNAs og virus til at mødes i den samme celle til redigering, og 12 timers interval mellem Transfektion af donor og gRNA plasmider og virusinfektion at lade Cas9 og gRNA udtrykkes på et rimeligt niveau, før virussen kommer ind i cellerne.
Begrænsning for HVT rekombinant generation er kompleksiteten af identifikation af normal god landbrugspraksis-positive kloner af krydset PCR. Normal god landbrugspraksis-VP2 kassetter kunne indsættes i enten orientering. Krydset PCR beskrevet her er kun til identifikation af Indsæt i forstand orienteringen. I tilfælde af insertet i antisense orientering, PCR ved hjælp af primer par beskrevet ville ikke arbejde, og de interne primere kunne byttes til dette formål. Et andet potentielt problem er donor konstruktion kan kun bruges til ét gen indsættelse i den samme virus som følge af eksistensen af den resterende LoxP rækkefølge efter normal god landbrugspraksis fjernelse af Cre behandling. En ny donor konstruktion med en variant LoxP sekvens kunne bruges i stedet for en multiple indsættelse formål.
NHEJ og HDR (homologi-instrueret reparation) er de to veje hen til lave den dobbelt-strenget pauser (DSBs) oprettet af Cas926,27. NHEJ er mere effektiv, da den forekommer i hele cellecyklus28, HDR er mindre effektive og kun opstår under S og G2 faser6,29,30. Vi udnyttede den mere effektive NHEJ reparation pathway her for at indføre de fremmede gener i målrettede placeringer. Selv om NHEJ reparation kan indføre indels ved at deltage i noncompatible eller beskadigede DNA enderne gennem en homologi-uafhængig mekanisk fleksible proces31,32 mellem kløvet donor sekvens og genomisk DNA, indels kan kun ske på kavalergang lokaliteter af sgA, og udenlandske genekspression kassette påvirkes ikke. En anden fordel ved denne tilgang er, at NHEJ er fri for begrænsning af homologi arm konstruktion, at kloning trin meget ligetil. Dette bliver bedt om et stort potentiale for anvendelse af NHEJ for udenlandske gen indsættelse. Indførelsen af en universel gRNA målwebstedet på begge ender af udenlandske gen kassette gør processen hurtigere som skabelonen donor kan konstrueres med det samme uden behov for særlige gRNA udvalg. Rygraden i donor plasmid som indeholder sgA target websteder, LoxP steder og PacI og SfiI websteder kan også deles bredt mellem forskellige reporter gener, udenlandske genekspression kassetter og forskellige virus vektorer, giver denne nye tilgang fordel af tilpasning.
HVT-husly VP2 Indsæt blev brugt til at beskrive protokollen i dette håndskrift; men samme tilgang kan bruges til at indsætte mere virale gener på forskellige genomisk placeringer af HVT genom ved hjælp af gRNA rettet mod den ønskede tilsvarende sekvens til udvikling af multivalent rekombinant HVT vektoriserede vacciner. Andre MDV vaccinestamme, som SB-1 og CVI988, andre aviær herpesvirus, herunder infektiøs laryngotracheitis virus og duck enteritis virus og også andre aviær DNA virus, såsom pox virus og adenovirus, kan også være manipuleret ved hjælp af den samme tilgang til multivalent rekombinant vaccine udvikling. Udvikling af nye multivalent vektoriserede vacciner ved hjælp af CRISPR/Cas9 system platform beskrevet her vil være meget gavnlige for fjerkræindustrien til beskyttelse mod flere fjerkræsygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Pippa Hawes for at hjælpe med den Konfokal billeddannelse. Dette projekt blev støttet af bioteknologien og Biological Sciences Research Council (BBSRC) tilskud BBS/E/jeg/00007034 og BB/L014262/1.
M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |