तुर्की के Herpesvirus (HVT) व्यापक रूप से एवियन रोगों की एक संख्या के खिलाफ रिकॉमबिनेंट टीके की पीढ़ी के लिए एक वेक्टर मंच के रूप में प्रयोग किया जाता है । यह लेख एक एकीकृत NHEJ-CRISPR/Cas9 और Cre-लोक्स प्रणाली का उपयोग रिकॉमबिनेंट HVT-वैक्टर टीके की पीढ़ी के लिए एक सरल और तेजी से दृष्टिकोण का वर्णन करता है ।
तुर्कियों के Herpesvirus (HVT) एक आदर्श वायरल वेक्टर रिकॉमबिनेंट टीके की एक संख्या के खिलाफ एवियन रोगों, एवियन इंफ्लूएंजा (ऐ), न्यूकैसल रोग (एन डी), और संक्रामक bursal रोग (आईबीडी), बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्र का उपयोग कर के खिलाफ की पीढ़ी के लिए है ( बीएसी) mutagenesis या पारंपरिक पुनर्संयोजन तरीकों । संकुल नियमित रूप से palindromic दोहराया (CRISPR)/Cas9 प्रणाली सफलतापूर्वक कई बड़े डीएनए वायरस जीनोम के हेरफेर सहित जीन संपादन के लिए कई सेटिंग्स में इस्तेमाल किया गया है । हम एक तेजी से और कुशल CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन पाइपलाइन रिकॉमबिनेंट HVT उत्पंन करने के लिए विकसित किया है । इस विधि के संभावित उपयोग को अधिकतम करने के लिए, हम यहां IBDV के VP2 प्रोटीन व्यक्त रिकॉमबिनेंट HVT पैदा करने की कार्यप्रणाली के बारे में विस्तृत जानकारी प्रस्तुत करते हैं । VP2 अभिव्यक्ति कैसेट HVT जीनोम में एक NHEJ (nonhomologous अंत में शामिल होने के)-निर्भर मरंमत मार्ग के माध्यम से डाला जाता है । एक ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) अभिव्यक्ति कैसेट पहले आसान दृश्य के लिए संमिलित करने के लिए संलग्न है और फिर Cre-LoxP प्रणाली के माध्यम से हटा दिया । यह दृष्टिकोण रिकॉमबिनेंट टीकों के तेजी से विकास के लिए HVT जीनोम में अंय वायरल एंटीजन शुरू करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है ।
ब्रांडों के रोग (MD) Herpesvirusके उपपरिवार में जीनस GAHV के सीरोटाइप 1 (Gallid Mardivirus 2 [Alphaherpesvirinae-2]) द्वारा प्रेरित मुर्गियों की एक lymphoproliferative बीमारी है । Mardivirus भी दो गैर रोगजनक serotypes: सीरोटाइप 2 (GaHV-3) और सीरोटाइप 3 (MeHV-1, ऐतिहासिक HVT के रूप में जाना जाता है) जो एमडी के खिलाफ टीके के रूप में इस्तेमाल किया जाता है शामिल हैं । लाइव HVT वैक्सीन (FC-१२६ तनाव) एमडी वैक्सीन की पहली पीढ़ी 1970 के दशक में इस्तेमाल किया है और अभी भी bivalent और polyvalent वैक्सीन योगों में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए एमडी के खिलाफ एक बढ़ाया सुरक्षा प्रदान करते हैं । HVT भी व्यापक रूप से एक टीके के रूप में प्रयोग किया जाता है के लिए एवियन अपनी बहुमुखी प्रतिभा और दोनों ovo और चमड़े के नीचे मछली पालने का प्रशासन और क्षमता के लिए सुरक्षा के कारण रोगों के एक नंबर के खिलाफ सुरक्षा प्रेरित करने के लिए एक आजीवन उन्मुक्ति प्रदान करते हैं । रणनीति रिकॉमबिनेंट HVT टीके उत्पंन करने के लिए या तो वायरस में पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन पर आधारित है संक्रमित कोशिकाओं, अतिव्यापी cosmid DNAs, या बीएसी mutagenesis2। हालांकि, इन तरीकों आम तौर पर समय लेने वाली है और श्रम प्रधान, स्थानांतरण वैक्टर के निर्माण की आवश्यकता होती है, ई कोलाई, पट्टिका शुद्धिकरण में वायरल जीनोम के रखरखाव, और बीएसी अनुक्रम और चयन को हटाने संपादित वायरस3,4से मार्कर ।
CRISPR/एसोसिएटेड (Cas9) हाल के वर्षों में अपनी बहुमुखी प्रतिभा और विशिष्टता के कारण सबसे लोकप्रिय जीन संपादन उपकरण है । CRISPR/Cas9 प्रणाली सफलतापूर्वक आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं और पशु मॉडल के कुशल पीढ़ी में इस्तेमाल किया गया है5,6,7,8,9,10, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कई बड़े डीएनए वायरस जीनोम के हेरफेर में11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. HVT जीनोम21संपादित करने के लिए CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग कर एक सरल और कुशल विधि रिपोर्टिंग के बाद, हम रिकॉमबिनेंट HVT22की तेजी से और कुशल पीढ़ी के लिए एक पाइपलाइन विकसित की है ।
इस विधि के संभावित अनुप्रयोग का विस्तार करने के लिए, हम इस रिपोर्ट में UL45/46 लोकस पर IBDV के VP2 जीन व्यक्त रिकॉमबिनेंट HVT वैक्सीन की पीढ़ी के लिए विस्तृत कार्यप्रणाली का वर्णन करते हैं । दृष्टिकोण को जोड़ती है NHEJ-CRISPR/Cas9 डालने के लिए VP2 जीन के साथ टैग GFP रिपोर्टर जीन और एक Cre-LoxP प्रणाली को हटाने के लिए GFP अभिव्यक्ति कैसेट बाद में । पारंपरिक पुनर्संयोजन और बीएसी recombineering तकनीक की तुलना में, हम प्रदर्शित करते है कि NHEJ-CRISPR/Cas9 एक Cre-लोक्स प्रणाली के साथ एक तेजी से और कुशल दृष्टिकोण रिकॉमबिनेंट HVT वैक्सीन उत्पंन करने के लिए है ।
CRISPR/Cas9 प्रणाली जीन संपादन में एक मूल्यवान उपकरण बन गया है । इस तरह के मुताबिक़ पुनर्संयोजन13 और बीएसी mutagenesis25प्रौद्योगिकी के रूप में रिकॉमबिनेंट HVT वेक्टर विकास, के लिए पारंपरिक प्रौद्योगिकियों, आमतौर पर वेक्टर क्लोनिंग और चयन के कई दौर शामिल है, साथ ही बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग, जिसमें कई महीने लग सकते हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक NHEJ-CRISPR/Cas9 आधारित Cre-लोक्स प्रणाली और एकल सेल छंटाई के साथ संयुक्त रणनीति का उपयोग कर और अधिक एक सुविधाजनक, कुशल है, और रिकॉमबिनेंट वैक्सीन पीढ़ी में तेजी से दृष्टिकोण । इस पाइपलाइन का प्रयोग, रिकॉमबिनेंट वायरस केवल 1-2 सप्ताह24के भीतर प्राप्त किया जा सकता है, और पट्टिका शुद्धि कदम भी एक गोल जुदाई प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष17छंटाई का उपयोग कर कम किया जा सकता है । पूरी प्रक्रिया, gRNA डिजाइन और दाता निर्माण से शुद्ध रिकॉमबिनेंट HVT वायरस प्राप्त करने के लिए, 1 महीने के भीतर प्राप्त किया जा सकता है । सफल रिकॉमबिनेंट HVT पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण कदम वायरल जीनोम को लक्षित करने के लिए उच्च दक्षता gRNA चयन शामिल विदेशी जीन प्रविष्टि के लिए कुशल दरार सुनिश्चित करने के लिए, उच्च अभिकर्मक क्षमता Cas9 के लिए मौका अधिकतम करने के लिए/ gRNAs और वायरस के संपादन के लिए एक ही सेल में मिलने के लिए, और दाता और gRNA plasmids और वायरल संक्रमण के अभिकर्मक के बीच 12 घंटे के अंतराल के लिए अनुमति देने के लिए Cas9 और gRNA वायरस कोशिकाओं में हो जाता है पहले एक उचित स्तर पर व्यक्त की है ।
HVT रिकॉमबिनेंट पीढ़ी के लिए सीमा जंक्शन पीसीआर द्वारा GFP-पॉजिटिव क्लोनों की पहचान की जटिलता है । GFP-VP2 कैसेट या तो अभिविंयास में डाला जा सकता है । यहां बताई गई जंक्शन पीसीआर सिर्फ नब्ज ओरिएंटेशन में डालने वालों की पहचान के लिए ही है । antisense उंमुखीकरण में डालने के मामले में, पीसीआर का उपयोग कर प्राइमर जोड़े काम नहीं होता वर्णित है, और आंतरिक प्राइमरों इस प्रयोजन के लिए बदली जा सकता है । एक और संभावित समस्या यह है कि दाता का निर्माण केवल एक ही वायरस में जीन प्रविष्टि के लिए Cre उपचार द्वारा GFP हटाने के बाद शेष LoxP अनुक्रम के अस्तित्व के कारण इस्तेमाल किया जा सकता है । एक नए दाता एक संस्करण LoxP अनुक्रम के साथ निर्माण के बजाय एक बहु प्रविष्टि उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
NHEJ और HDR (समरूपता-निर्देशित मरंमत) के दो रास्ते है Cas926,27द्वारा बनाई गई डबल-कतरा टूट (DSBs) की मरंमत । NHEJ अधिक कुशल के रूप में यह सेल चक्र28भर में होता है, जबकि HDR कम कुशल है और केवल एस और G2 चरणों6,29,30के दौरान होता है । हम और अधिक कुशल NHEJ मरंमत मार्ग यहां का दोहन करने के लिए लक्षित स्थानों में विदेशी जीन परिचय । हालांकि NHEJ मरंमत indels संगत या क्षतिग्रस्त डीएनए में शामिल होने से एक समरूपता-स्वतंत्र mechanistically लचीली प्रक्रिया31,३२ के बीच के माध्यम से शुरू हो सकता है सट दाता अनुक्रम और जीनोमिक डीएनए, indels केवल sgA के क्लीवेज साइटों पर हो सकता है, और विदेशी जीन-अभिव्यक्ति कैसेट प्रभावित नहीं है । इस दृष्टिकोण का एक और लाभ यह है कि NHEJ समरूपता बांह निर्माण के प्रतिबंध से मुक्त है, क्लोनिंग कदम बहुत सीधा बना । यह विदेशी जीन प्रविष्टि के लिए NHEJ के आवेदन के लिए एक महान क्षमता का संकेत है । विदेशी जीन कैसेट के दोनों सिरों पर एक सार्वभौमिक gRNA लक्ष्य साइट की शुरूआत की प्रक्रिया को और अधिक तेजी के रूप में दाता टेंपलेट विशिष्ट gRNA चयन के लिए कोई ज़रूरत नहीं के साथ सीधे का निर्माण किया जा सकता है । sgA लक्ष्य साइटों, LoxP साइटों, और PacI और SfiI साइटों युक्त दाता प्लाज्मिड की रीढ़ भी अलग रिपोर्टर जीन के बीच व्यापक रूप से साझा किया जा सकता है, विदेशी जीन-अभिव्यक्ति कैसेट, और विभिंन वायरस वैक्टर, इस नए दृष्टिकोण का लाभ दे अनुकूलन.
इस पांडुलिपि में प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए HVT-हार्बर VP2 डालने का प्रयोग किया गया; तथापि, एक ही दृष्टिकोण को HVT जीनोम के विभिंन जीनोमिक स्थानों पर और अधिक वायरल जीन डालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है multivalent रिकॉमबिनेंट HVT वैक्टर टीके के विकास के लिए वांछित इसी अनुक्रम लक्ष्यीकरण gRNA का उपयोग कर । अन्य MDV वैक्सीन उपभेदों, जैसे एसबी-१ और CVI988, अन्य एवियन herpesviruses, जिनमें संक्रामक laryngotracheitis वायरस और बतख आंत्रशोथ वायरस भी शामिल हैं, और अन्य एवियन डीएनए वायरस, जैसे चेचक विषाणु और एडिनोवायरस भी, उसी का उपयोग कर इंजीनियर हो सकते हैं. multivalent रिकॉमबिनेंट वैक्सीन के विकास के लिए दृष्टिकोण । यहां वर्णित CRISPR/Cas9 प्रणाली मंच का उपयोग कर नए multivalent वैक्टर टीके का विकास अत्यधिक पोल्ट्री रोगों के खिलाफ की रक्षा करने के लिए पोल्ट्री उद्योग के लिए बेहद फायदेमंद होगा ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक फोकल इमेजिंग के साथ मदद करने के लिए Pippa Hawes धंयवाद । इस परियोजना को जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद् (BBSRC) अनुदान किउ/E/I/00007034 और BB/L014262/1 द्वारा समर्थित किया गया था ।
M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |