Herpesvirus av kalkuner (HVT) er mye brukt som en vektor plattform for generering av rekombinant vaksiner mot en rekke avian sykdommer. Denne artikkelen beskriver en enkel og rask tilnærming for generering av rekombinant HVT-vectored vaksiner med en integrert NHEJ-CRISPR/Cas9 og grobunn-Lox system.
Herpesvirus av kalkuner (HVT) er en ideell viral vektor for generering av rekombinant vaksiner mot en rekke avian sykdommer, som fugleinfluensa (AI), Newcastle sykdom (ND) og bursal infeksjonssykdommer (IBD), ved hjelp av bakteriell kunstig kromosom ( BAC) mutagenese eller konvensjonelle rekombinasjon metoder. De klynget regelmessig interspaced palindromic gjentar (CRISPR) / Cas9 systemet har blitt brukt i mange innstillinger for genet redigering, inkludert manipulering av flere store DNA virus genomer. Vi har utviklet en rask og effektiv CRISPR/Cas9-mediert genomet redigering rørledning for å generere rekombinant HVT. For å maksimere den potensielle bruken av denne metoden, presenterer vi her detaljert informasjon om metoder for å generere rekombinant HVT uttrykke VP2 protein av IBDV. VP2 uttrykk kassetten settes inn i den HVT genom via en NHEJ (nonhomologous slutten-bli med)-avhengige reparasjon veien. En grønn fluorescens protein (GFP) uttrykk kassett er først knyttet til innsatsen for enkel visualisering og deretter fjernet via grobunn-LoxP systemet. Denne tilnærmingen gir en effektiv måte å introdusere andre viral antigener i HVT genomet for rask utvikling av rekombinant vaksiner.
Mareks sykdom (MD) er en lymphoproliferative sykdom av kyllinger indusert av serotype 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) i slekten Mardivirus på og av Alphaherpesvirinae. Mardivirus omfatter også to attenueres serotyper: serotype 2 (GaHV-3) og serotype 3 (MeHV-1, historisk kjent som HVT) som brukes som vaksiner mot MD. Live HVT vaksine (FC-126 belastning) er den første generasjonen av MD vaccine anvendt i 1970 og fremdeles brukes mye i bivalent og polyvalent vaksine formuleringer for å gi en forbedret beskyttelse mot MD. HVT er også mye brukt som en vaksine vektor for å indusere beskyttelse mot en rekke avian sykdommer på grunn av sin allsidighet og trygghet for både i ovo subkutan klekkeriet administrasjon og evne til å gi en livslang immunitet. Strategien for å generere rekombinant HVT vaksiner er basert på enten konvensjonelle homologe rekombinasjon i virus-infiserte celler, overlappende cosmid DNAs eller BAC mutagenese2. Disse metodene er imidlertid vanligvis tidkrevende og arbeidskrevende, krever bygging av overføring vektorer, vedlikehold av viral genomet i Escherichia coli plakk renselser, og fjerning av BAC sekvensen og utvalg markøren fra redigerte virus3,4.
CRISPR/assosiert (Cas9) er den mest populære genet redigeringsverktøy de siste årene på grunn av sin allsidighet og spesifisitet. CRISPR/Cas9 systemet har blitt brukt i effektiv generasjon av genmodifiserte celler og dyremodeller5,6,7,8,9,10, som vel som manipulering av flere store DNA virus genomer11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Etter rapportering en enkel og effektiv metode som bruker CRISPR/Cas9 systemet for å redigere HVT genomet21, utviklet vi en rørledning for rask og effektiv generasjon av rekombinant HVT22.
For å utvide den potensielle anvendelsen av denne metoden, beskriver vi detaljerte metodikken for generering av rekombinant HVT vaksine uttrykke VP2 genet av IBDV på UL45/46 locus i denne rapporten. Tilnærmingen kombinerer NHEJ-CRISPR/Cas9 sett VP2 genet merket med GFP reporter gene og en grobunn-LoxP system for å fjerne GFP uttrykk kassetten senere. Sammenlignet med tradisjonelle rekombinasjon og BAC recombineering teknikker, viser vi at NHEJ-CRISPR/Cas9 sammen med en grobunn-Lox system er en rask og effektiv tilnærming til å generere rekombinant HVT vaksine.
CRISPR/Cas9 systemet har blitt et verdifullt verktøy i genet redigering. De tradisjonelle teknologiene for rekombinant HVT vektor utvikling, som homologe rekombinasjon13 og BAC mutagenese teknologi25, innebære vanligvis flere runder med vektor kloning og utvalg, samt store screening, som kan ta flere måneder. Protokollen beskrevet her bruker en NHEJ-CRISPR/Cas9-basert strategi grobunn-Lox systemet og encellede sortering er mer en praktisk, effektiv og raskere tilnærming rekombinant vaksine generasjon. Bruker denne rørledningen, rekombinant viruset kan fås i bare 1-2 uker24, og plakk rensing trinnene kan også bli redusert til en enkelt-runde separasjon med fluorescens-aktivert cellen sortering17. Hele prosessen, fra gRNA design og donor byggingen å skaffe renset rekombinant HVT viruset, kan oppnås innen 1 måned. Kritisk trinnene for generasjon vellykket rekombinant HVT omfatter høyeffektive gRNA valg for målretting er viral genomet for å sikre effektiv cleavage for utenlandske genet innsetting, høy hva effektivitet å maksimere sjansen for Cas9 / gRNAs og virus å møte i samme celle for redigering, og 12-timers intervallet mellom transfection av giver og gRNA plasmider og virusinfeksjon slik at Cas9 og gRNA skal uttrykkes på et rimelig nivå før viruset kommer inn i cellene.
Begrensningen for HVT rekombinant generasjon er det innviklet beskaffenhet av identifikasjon av GFP-positive kloner av krysset PCR. GFP-VP2-kassetter kan settes i hver retning. Krysset PCR beskrevet her er bare for identifikasjon av sette i mening retning. Ved innsatsen i antisense retning, PCR bruker primer parene beskrives ikke ville fungere, og interne primerne kan byttes for dette formålet. Et annet potensielt problem er at den donor konstruere kan bare brukes for genet innsetting i samme viruset på grunn av eksistensen av den gjenværende LoxP etter GFP fjerning av grobunn behandling. En ny donor konstruksjon med en variant LoxP sekvens kan brukes i stedet for flere innsetting formål.
NHEJ og HDR (homologi-rettet reparasjon) er to veier å reparere double-strandet pausene (DSBs) opprettet av Cas926,27. NHEJ er mer effektivt som det skjer i cellen syklus28, mens HDR er mindre effektiv og bare oppstår under S og G2 faser6,29,30. Vi utnyttes til mer effektiv NHEJ reparasjon veien her for å innføre utenlandske genene i de målrettede stedene. Selv om NHEJ reparere kan introdusere indeler melder noncompatible eller skadet DNA endene gjennom en homologi-uavhengig mechanistically fleksible prosessen31,32 mellom kløyvde donor sekvensen og genomisk DNA, indeler kan bare forekomme ved spalting sgA og utenlandske genuttrykk kassetten påvirkes ikke. En annen fordel med denne tilnærmingen er at NHEJ er uten begrensning homologi arm konstruksjon, gjør kloning gå veldig grei. Dette ber om et stort potensial for bruk av NHEJ for utenlandske genet innsetting. Innføringen av en universell gRNA målområdet på begge ender av utenlandske genet kassett gjør prosessen raskere som malen giver kan være konstruert straks uten behov for spesielle gRNA valg. Ryggraden i donor plasmider inneholder sgA målområder, LoxP områder og PacI og SfiI områder kan også være delt mye mellom ulike reporter gener, utenlandske genuttrykk kassetter og annet virus vektorer, gir denne nye tilnærmingen fordelen av tilpasning.
Sett inn HVT-skjuler VP2 ble brukt til å beskrive protokollen i dette manuskriptet; samme tilnærming kan imidlertid brukes til å sette inn mer viral gener i genomisk steder i HVT genomet med gRNA målretting ønsket tilsvarende sekvensen for utvikling av multivalent rekombinant HVT vectored vaksiner. Andre MDV vaksine stammer, som SB-1 og CVI988, andre avian herpesviruses, inkludert smittsomme laryngotracheitis virus og duck enteritt virus, og også andre avian DNA virus, som vannkopper virus og adenoviruses, kan også integreres med samme tilnærming for multivalent rekombinant vaksineutvikling. Utviklingen av nye multivalent vectored vaksiner med CRISPR/Cas9 system plattform beskrevet her vil være svært gunstig for fjørfe industrien å beskytte mot flere fjørfe sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Pippa Hawes for å hjelpe med AC confocal avbilding. Dette prosjektet ble støttet av bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC) gir BBS/E/jeg/00007034 og BB/L014262/1.
M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |