Summary
نقدم هنا، أسلوب الذي تنتج الفخاخ الضخمة خارج الخلية العَدلات (شبكات) العَدلات منخفض الكثافة البشرية (LDN)، تعافي من سائل الغسل البريتوني بعد العملية الجراحية، وفخ كفاءة الخلايا السرطانية الحرة التي تنمو في وقت لاحق.
Abstract
تفعيل العَدلات الإصدار العَدلات خارج الخلية الفخاخ (شبكات)، الذي يمكن التقاط وتدمر الميكروبات. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن شبكات متورطة في عمليات الأمراض المختلفة، مثل الانبثاث المرض وتجلط الدم والأورام الذاتية. وهنا نعرض تقنية مفصلة في المختبر للكشف عن النشاط الصافي أثناء محاصرة الخلايا السرطانية الحرة، التي تنمو بعد الإلحاق لشبكات. أولاً، جمعنا العَدلات منخفض الكثافة (LDN) من سائل الغسل البريتوني بعد العملية الجراحية من المرضى الذين خضعوا لاباروتوميس. استزراع القصيرة الأجل من LDN أسفرت عن تشكيل صافي الضخمة التي كانت تصور مع الأخضر الفلوريسنت النووية وكروموسوم كونتيرستين. بعد الحضانة المشتركة لخطوط الخلايا البشرية سرطان المعدة MKN45 "و" أوكوم-1 "و" نوجك-4 مع الشباك، حوصر العديد من الخلايا السرطانية بالشباك. في وقت لاحق، المرفقات ألغى تماما بتدهور شبكات مع "الوقت الفاصل بين أولاً الدناز" الفيديو كشفت أن الخلايا السرطانية قد وقعت في شرك الشباك لم يمت ولكن بدلاً من ذلك نما بقوة في ثقافة مستمرة. يمكن تطبيق هذه الأساليب للكشف عن التفاعلات لاصقة بين الشباك وأنواع مختلفة من الخلايا والمواد.
Introduction
عادة يتم فصل polymorph العَدلات النووية في تعميم الدم من الخلايا وحيدات النوى من خلال أسلوب إعداد التدرج الكثافة. بيد أن بعض العَدلات المعروف العَدلات منخفض الكثافة (LDN)، مع تعمل CD11b(+)، CD15(+)، CD16(+)، و CD14(-)، المنقي يشترك مع الخلايا وحيدات النوى. العدد النسبي ل LDN زيادة كبيرة في مختلف الحالات المرضية بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية1،2، الانتان3و4،السرطان5. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن LDN فئة متميزة فينوتيبيكالي ووظيفيا من العَدلات6. تجدر الإشارة إلى أن LDN في تعميم الدم أكثر احتمالاً لإنتاج العَدلات الفخاخ خارج الخلية (شبكات) من الكثافة الطبيعية العَدلات2،7. شبكات الهياكل الشبيهة بالويب تتألف من الأحماض النووية، هيستونيس، البروتياز، والبروتينات الحبيبية وسيتوسوليك، وأنهم يمكن أن كفاءة الأجهزة وتدمير8من مسببات الأمراض.
في الآونة الأخيرة، أظهرت شبكات لالتقاط ليس فقط الجراثيم، ولكن أيضا الصفائح الدموية وتعميم الخلايا السرطانية التي يمكن أن تساعد في خثرة تشكيل9 والورم الانبثاث10،11. ومع ذلك، أن الآليات الجزيئية وراء لاصقة التفاعلات بين شبكات والصفائح الدموية أو الخلايا السرطانية لا تزال غير واضحة. في الآونة الأخيرة، كشفت مقايسة التصاق في المختبر أن خلايا سرطان الدم النقوي (K56212) وخلايا سرطان الرئة (A54913) إرفاق إلى شبكات عبر integrins β1 و β3. الكتاب يستخدم صافي رصيد المعزولة من العَدلات وتنشيطه بواسطة phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) ك الركيزة التصاق14. على الرغم من أن هذا الفحص يتيح الكشف عن التفاعل الحقيقي مع مكونات صافي في غياب العَدلات، والقول ما إذا كان "الخلية الحرة الأوراق المالية الصافية" معزول بواسطة الطرد المركزي عالية السرعة يحتفظ بنية الجزيئية متطابقة لشبكات إنتاج في فيفو. في الآونة الأخيرة، وجدنا أن السائل البريتوني الغسل بعد عملية جراحية في البطن الواردة LDN ناضجة كثيرة، وإنشاء شبكات واسعة النطاق، وتعلق على الخلايا السرطانية تسبب الانبثاث البريتوني15. في هذه الدراسة، درسنا بنجاح التصاق الخلايا السرطانية لشبكات سليمة دون أي تلاعب المادية. وهنا نعرض تفاصيل تقنية للكشف عن التفاعلات لاصقة بين شبكات وخلايا الورم مجاناً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أقرت "المؤسسية استعراض مجلس جيتشي الطبية جامعة" LDN وتم الحصول عليها من المرضى المسجلين في هذه الدراسة.
1-عزل LDN من لافاجيس التجويف البطني والكشف عن صافي
- الحصول على عينة
- ضخ 1,000 مل من المحلول الملحي معقمة طبيعية مباشرة في تجويف البطن قبل إغلاق الجرح في المرضى الذين خضعوا لعملية جراحية في البطن بسبب الأورام الخبيثة في الجهاز الهضمي.
ملاحظة: تم الحصول على عينات من المرضى الذين خضعوا جاستريكتومي أو كوليكتومي، أو اسوفاجيكتومي دون تحيز على أساس السن أو الجنس. نقل في حاوية المحلول الملحي وسكب في البطن كله خلال دقيقة واحدة. هذا يتم بشكل روتيني كغسيل البريتوني بعد العمل الجراحي دون آثار كبيرة على المرضى. - الغسل التجويف البطني على نطاق واسع على الأقل 1 دقيقة.
ملاحظة: من المستحسن أن السوائل التي غرست ببطء آثار أيديهم الجراح حيث تكون العينات موحدة. - استعادة 200 مل سائل الغسل مع أربعة 50 مل المحاقن.
ملاحظة: في بعض الأحيان يستخدم موصل مطاط لتناول السوائل.
- ضخ 1,000 مل من المحلول الملحي معقمة طبيعية مباشرة في تجويف البطن قبل إغلاق الجرح في المرضى الذين خضعوا لعملية جراحية في البطن بسبب الأورام الخبيثة في الجهاز الهضمي.
- إجراء تنقية البريتوني LDN استخدام المحببات ماب محددة، CD66b16.
ملاحظة: نظراً لأن الطبقة المتوسطة بعد الكثافة المتدرجة الطرد المركزي يحتوي على العديد من الخلايا وحيدات النوى، أنجز اختيار إيجابي من العَدلات polymorph استخدام ماب CD66b.- نقل السوائل الغسل البريتوني لأنبوب 50 مل.
ملاحظة: في هذه الخطوة، تمرير السوائل من خلال مرشح نايلون 100 ميكرون لإزالة الشوائب. - الطرد المركزي في السائل البريتوني في 270 س ز لمدة 7 دقائق في الرايت
- ريسوسبيند الكريات في 5 مل من برنامج تلفزيوني مع يدتا 0.02 في المائة.
- تراكب 5 مل تعليق خلية في حل متدرج كثافة 3 مل بعناية.
- الطرد المركزي في 1,700 س ز لمدة 15 دقيقة في RT دون أي فواصل.
- الحصاد في ~ 2-3 مل محلول يحتوي على الطبقات المتوسطة (الشكل 1A) باستخدام ماصة ومزجها مع 10 مل من برنامج تلفزيوني مع يدتا 0.02 في المائة.
- الطرد المركزي في السائل البريتوني في 400 غرام x لمدة 7 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية.
- إضافة آخر 10 مل من برنامج تلفزيوني مع يدتا 0.02 في المائة، وأجهزة الطرد المركزي في 270 س ز لمدة 7 دقائق في الرايت تجاهل المادة طافية.
- حل بيليه الخلية (1 × 107) في 60 ميليلتر من المخزن المؤقت لعدة فصل الخلية المغناطيسية.
- إضافة 20 ميليلتر من كتلة Fc للكريات واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إضافة 20 ميليلتر لمكافحة--CD66b مترافق مع ميكروبيدس واحتضانها 10 دقائق إضافية عند 4 درجة مئوية.
- أغسل وإعادة تعليق الكريات في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش.
- تطبيق تعليق خلية عمود مغناطيسية في المجال المغناطيسي لفاصل مغناطيسي مناسب وجمع من خلال تدفق المحتوية على CD66b(-) الخلايا عن طريق الغسيل العمود مع 15 مل من المخزن المؤقت.
- إزالة العمود من الفاصل المغناطيسي وفورا طرد الخلايا CD66b(+) مغناطيسيا المسمى بشدة دفع المكبس إلى العمود.
ملاحظة: السكان خلية CD66b(+) تتألف في معظمها من العَدلات كما يحدده تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية التي تشير إلى أن > 95% الكسر CD66(+) إيجابية بالنسبة CD11b و CD15 CD16، ولكن السلبية ل CD14.
- نقل السوائل الغسل البريتوني لأنبوب 50 مل.
- جيل شبكات
- بعد الطرد المركزي في 270 س ز لمدة 7 دقائق في الرايت، تعليق إعادة LDN معزولة (5 × 106) في 1 مل RPMI1640 مع 10 ٪ السفح.
- الثقافة LDN على لوحة 6-جيدا بولي-L-يسين مغلفة (6 سم في القطر) ح 2 في ˚C 37 في أول أكسيد الكربون 5%2.
- إضافة كونتيرستين الفلورية الخضراء (صبغة غشاء كتيمة وصمة عار في النواة والكروموسومات) بتركيز نهائي من 5 ميكرومتر.
- فورا مراقبة مورفولوجية شبكات (خارج الخلية DNA مكونات طردوا من LDN تحت مجهر الأسفار).
2-تلطيخ الخلايا السرطانية مع الصبغ الأحمر نيون خلية رابط
- إعداد السرطان البشرية خطوط الخلايا MKN45، نوجك، وأوكوم-1.
- أغسل 1 × 107 الخلايا مع برنامج تلفزيوني + يدتا 0.02% أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 270 س ز لمدة 7 دقائق في الرايت
- أضف 1 مل من محلول لصبغ تلطيخ للكريات، و "الماصة؛" بلطف.
- حل 4 ميليلتر من الصبغ "الأحمر نيون خلية رابط" في 1 مل من محلول لتلطيخ وخلط مع تعليق خلية من الخطوة 2، 2.
- احتضان الكريات لمدة 4 دقائق في الرايت
- إضافة 4 مل دميم (10% FBS) التوقف عن رد فعل المصبوغة.
- الطرد المركزي 270 س ز لمدة 7 دقائق وتجاهل المادة طافية.
- كرر الخطوات من 2.6 و 2.7 ضعف.
- تحقق مع مجهر الأسفار (الإثارة = 551 شمال البحر الأبيض المتوسط، التي تنبعث منها = 567 nm) أن الخلايا السرطانية هي الملون الأحمر.
3-تحليل ورم الخلية الانضمام إلى شبكات
- إعادة تعليق الخلايا الحمراء الفلورسنت الورم الملون (1 × 106) في 1 مل من 1640 RPMI تستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.1%.
- إضافة خلايا السرطان لثقافة LDN التي أنتجت الشباك كما هو موضح في الخطوة 1، 3.
- احتضان لمدة 5 دقائق في ˚C 37، الذي يتيح للخلايا السرطانية الاتصال الشبكات.
ملاحظة: حضانة طويلة يدفع التصاق الخلايا الورم LDN أو اللوحات. - إزالة المتوسطة وتغسل برفق الآبار بإضافة 2 مل من بريوارميد وسائل الإعلام (BSA 0.1% + RPMI 1640) ويحوم الطبق.
- كرر الإجراء الغسيل في الخطوة 3.4 مرتين.
ملاحظة: منذ شبكات ضعيفة نعلق على اللوحة، وينبغي أن يتم الغسل بلطف قدر الإمكان لتجنب إزالة شبكات أنفسهم. - إضافة صبغة الفلورسنت الخضراء لتلطيخ النواة والكروموسومات بتركيز نهائي 5 ميكروغرام/مل لتصور الشباك.
- مراقبة الشباك وتعلق ورم الخلايا باستخدام عوامل التصفية المناسبة (الإثارة الخضراء، = 504 شمال البحر الأبيض المتوسط، التي تنبعث منها = 523 نانومتر؛ والأحمر، والإثارة = 551 شمال البحر الأبيض المتوسط، التي تنبعث منها = 567 شمال البحر الأبيض المتوسط).
- دمج الأرقام لإظهار الخلايا السرطانية التي محاصرون بالشباك.
ملاحظة: في بعض التجارب، والحمض النووي تدهور إنزيم أضيفت إلى ثقافة LDN (تركيز النهائي من 100 يو/مليلتر) 5 دقائق قبل الحضانة المشتركة لمدة 5 دقائق.
4-الوقت الفاصل تحليل أشرطة الفيديو للخلايا السرطانية المحاصرين
- جولة الثقافة LDN البريتوني في 35 مم صحن مغطاة بطبقة بولي-L-يسين كما هو موضح في الخطوة 1، 3.
- إضافة صبغة الفلورسنت الخضراء لتلطيخ النواة والكروموسومات لتصور الشباك كما هو موضح في الخطوة 1، 3.
- بعد 1 دقيقة من الحضانة، قم بإزالة الوسائط وإضافة 2 مل من جيش صرب البوسنة 0.1% + 1640 ربمي.
- قم بإزالة الوسائط وإضافة الخلايا أونستينيد 1 × 106 MKN45 علقت في 0.1% جيش صرب البوسنة + 1640 ربمي. احتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
- إزالة أي خلايا الورم فاتحة بلطف الغسيل كما هو موضح في الخطوة 3، 4 وإضافة دميم مع 10% FCS وتستكمل مع 100 يو/مليلتر البنسلين و 100 ميكروغرام/مل والستربتوميسين.
- جبل الطبق الثقافة في نظام مراقبة لعرض كل خلية وحدد الحقل المناسب في أي ورم الخلايا محاصرون بالشباك.
- تواصل الثقافة شارك إضافية أيام 2 والتقاط صور مستمرة من الميدان كل دقيقة 6 تحت الضوء الطبيعي، والأسفار، الذي يكشف عن الخلايا MKN45 وشبكات، على التوالي.
- ركب الصور في كل تيميبوينت وبناء الوقت الفاصل بين أشرطة الفيديو باستخدام برنامج "عارض الصور".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في ثقافة 2 ساعة، LDN CD66b(+) المستمدة من الغسل البريتوني السوائل أظهرت سلسلة هياكل ملطخة بصبغة الفلورسنت الأخضر للنووي وكروموسوم (الشكل 1B)، بينما CD66b(-) الخلايا وحيدات النوى لم (الشكل 1). بيد عند الثقافات LDN كانت pretreated مع 100 الدناز U/mL، بنية مميزة قد دمرت (الشكل 1)، مما يشير إلى أنها كانت تتألف من الحمض النووي خارج الخلية طردوا من العَدلات. عندما كانت مثقف LDN على ألواح البلاستيك دون طلاء، العديد من مجموعات الصافية العائمة في لوحظت وسائل الإعلام، مع شبكات القليلة في الجزء السفلي (الشكل 1E).
المقبل، لدراسة التصاق خطوط الخلايا الورم إلى شبكات، الخلايا MKN45 المسمى بصبغة الفلورسنت الأحمر إضافة إلى الشباك والمحتضنة شارك لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل لطيف، تعلق الكثير من MKN45 تم العثور على الخلايا (الشكل 2 ألف و 2 (ج)). على النقيض من ذلك، تعلق بعض MKN45 الخلايا عند LDN كانت pretreated مع الدناز أنا (الشكل 2 و 2 ج). الرقم المدمجة أظهر بوضوح أن غالبية الخلايا MKN45 المرفقة كانت مترجمة شارك مع شبكات، ينظر إليها على أنها شكلت في الجزء السفلي من اللوحة (الشكل 2D) هياكل. ولوحظت أنماط التصاق مماثلة مع أوكوم-1 ونوجك-4 (الشكل 2E و 2F).
منذ شبكات أظهرت أن السامة للخلايا للبكتيريا، نحن ثم فحص ما إذا كانت الخلايا السرطانية قد وقعت في شرك الشباك يموت أو البقاء على قيد الحياة في ثقافة التعاون مستمر باستخدام الفيديو في الوقت الفاصل بين. من المثير للاهتمام، بينما شبكات اختفى تدريجيا خلال عدة ساعات، الخلايا MKN45 المحاصرين بالشباك وبدأت تنتشر بقوة بعد ذلك (1 فيديو).
رقم 1: تشكيل الصافي بعد الثقافة LDN البريتوني. (أ) بعد كثافة استخدام الطرد المركزي التدرج من سائل الغسل بعد العملية الجراحية، تظهر الخلايا المستردة من الطبقة المتوسطة. (ب) ثم، CD66b(+) LDN فصل عن الخلايا وحيدات النوى CD66b(-) ومثقف على ألواح بولي-L-يسين 6-جيدا المغلفة، تليها إضافة صبغة المصبوغة النووية والمراقبة المباشرة مع الفحص المجهري الأسفار. (ج) كانت مثقف نفس العدد من الخلايا وحيدات النوى CD66b(-) نفس الظروف. (د) LDN أحادي الطبقة كان المحتضنة مع الدناز أنا لمدة 5 دقائق قبل تلطيخ النووية. (ه) كانت مثقف CD66b(+) LDN على ألواح البلاستيك دون طلاء. أشرطة بيضاء تمثل 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التصاق ورم الخلايا إلى الشباك. (أ) كانت مثقف LDN البريتوني في بولي-L-يسين المغلفة جيدا 6 لوحات ح 2، الذي أنتج شبكات واسعة النطاق. ثم أضيفت MKN45 الأحمر المسمى فلوريسسين. بعد حضانة بعد 5 دقائق، تم إزالة الخلايا فاتحة بواسطة الغسيل لطيف، ولوحظت الخلايا السرطانية المتبقية تحت مجهر الأسفار. (ب) قبل إضافة MKN45، أحادي الطبقة LDN كان pretreated مع الدناز أنا للحد الأدنى 5 (ج) في التجارب (أ) و (ب)، عدد الخلايا MKN45 المرفقة أحصى في حقول عشوائية 3 تحت المجهر الأسفار و يعني ± أعرب عن التنمية المستدامة. (د) بعد الغسيل لطيف، الأخضر صبغة الفلورسنت للنووي وتمت إضافة كروموسوم إلى ثقافة المشاركة. في حقول الممثل، أخذت الصور المرفقة الهياكل MKN45 وصافي استخدام المرشحات الضوئية المناسبة للطول الموجي، وتم دمج هذين الرقمين. وأجريت التجارب نفسها التي يؤديها في (د) أيضا أوكوم-1 (ه) ونوجك-4 (و). أشرطة بيضاء تمثل 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1: السلوك بعد التصاق الخلايا السرطانية المحاصرين. كانت مثقف LDN في بولي-L-يسين المغلفة ألواح 6-جيدا لمدة ساعتين، وأكد تشكيل صافي صبغة الفلورسنت الخضراء للنووي وكروموسوم. تم إضافة أونستينيد MKN45 الخلايا وشارك المحتضنة لمدة 5 دقائق، ثم خلايا فاتحة تم إزالتها بالغسيل لطيف واستمرت لتكون مثقف شارك في 10% FCS + دميم. باستخدام نظام مراقبة عرض كل خلية، تم تفتيش المناطق حيث حوصر الخلايا السرطانية بشبكات ل. والتقطت صور فوتوغرافية للحقل ثم كل 6 دقائق تحت الضوء الطبيعي، والأسفار، مما مكن الأرقام واضحة من الخلايا السرطانية وشبكات، على التوالي. وأخيراً، تم فرضه الصور مع برنامج "عارض الصور"، والفاصل الزمني فيديو تم إنشاؤها بسرعة 3600 x أعلى مما في الوقت الحقيقي. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وأفادت الدراسات السابقة أن تعمم الخلايا السرطانية يمكن المحاصرين بركائز الصافية في فيفو10،11. أظهرت خلايا سرطان الثدي المنتشر لحفز العَدلات والحث على تشكيل شبكات، التي تساعد في نمو الخلايا السرطانية في الجهاز الهدف17. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن الثقافات القصيرة الأجل من LDN من سائل الغسل بعد العملية الجراحية أنتج شبكات واسعة النطاق التي يمكن إيقاع كفاءة الخلايا السرطانية دون مواصلة تحفيز15. هذه الملاحظات تشير إلى دور محتمل لإشراك شبكات الميكانيكية في عملية المنتشر. ومع ذلك، الآليات الجزيئية المفصلة التي تتوسط لاصقة التفاعلات بين شبكات وخلايا الورم لا يزال غير واضح. الدراسات التي أجريت مؤخرا قد تورط مشاركة إنتغرين في هذه العملية عن طريق استخدام الأسهم الصافية المعزولة من العَدلات مفعّلة بمثابة الركيزة التصاق12،13. ومع ذلك، مكونات شبكات تنقية ومركزة من المفترض أن يكون الهياكل الجزيئية مختلفة إلى حد كبير من شبكات الأصلي. وبالمقارنة، يستخدم أسلوب لدينا شبكات سليمة دون التلاعب المادية، وميزة قوية عند فحص آليات تفصيلية لتفاعلات لاصقة بالشباك. مع هذه التقنية البسيطة، يمكن اكتشاف الباحثين مرفق محدد من العديد من الخلايا السرطانية بالشباك بسرعة (في غضون 5 دقائق).
الميزة الأكثر أهمية البروتوكول هو استخدام لوحة بولي-L-يسين المغلفة لإصلاح هياكل الصافي على الجزء السفلي من اللوحة. عندما تستخدم ألواح البلاستيك سليمة لثقافة LDN، تم الكشف عن شبكات قليلة فقط في الجزء السفلي. وعلاوة على ذلك، لوحظت العديد من الكتل الخضراء-إيجابية بحرية عائمة في وسائط الإعلام، والثقافة عندما ينبغي أن كانت بعيدة عن اللوحة (الشكل 1). كما درسنا تشكيل الصافي على ألواح مغطاة بطبقة الكولاجين وفيبرونيكتين laminin، مما مكن الكشف عن هياكل ويب تشبه في الطبقة السفلي. بيد أن الشباك نعلق على ركائز أقل شدة من إلى بولي-L-يسين على ما يبدو وأنها كانت منفصلة بسهولة بإجراء الغسيل. ولذلك، هذه الخيارات الأخرى غير كافية لفحوصات الالتصاق. في الواقع، إذا كان علينا استخدام لوحات دون طلاء بولي-L-يسين، شبكات وأية خلايا الورم المرفقة يمكن أن تصبح إزالتها بسهولة من اللوحة بمجرد إضافة الوسائط إلى الآبار.
الخطوة الحاسمة في مقايسة الالتصاق هي فترة الحضانة لثقافة التعاون مع الخلايا السرطانية. خمس دقائق غير كافية للخلايا السرطانية لربط إلى الشباك. في ظل الظروف التجريبية، عند إضافة الحل التي تحتوي على الخلايا السرطانية للوحة 6، حسنا، جعل جميع الخلايا السرطانية الاتصال المادي مع بنيات صافية شكلت في الجزء السفلي من اللوحة. ومع ذلك، شاركت استزراع لما ينتج أطول فترة (مثلاً، أطول من 10 دقائق) ربط الخلايا السرطانية إلى LDN أو ركائز بولي-L-يسين. ولذلك ينبغي فترة حضانة قصيرة للكشف عن ملزمة محددة إلى الشباك. يناور للغسيل لطيف نقطة أساسية أخرى. ونحن على يقين من بطء إضافة الوسائط المعالجون من الجدار الجانبي لكل جيدا، بلطف سوينغ اللوحة وإزالة المادة طافية مع المضخة. منذ شبكات عصا اللوحة ضعيفة، ينبغي أن تجري هذه العملية بطريقة حذرة خاصة.
ويبرز هذا الأسلوب حقيقة أن هناك حاجة إليه جزيئية مختلفة للخلايا السرطانية ربط شبكات في غضون دقائق، مما هو موضح في مقايسة التصاق مع حضانة ~ 30 إلى 60 دقيقة إلى صافي الأرصدة12،13. حظر تجارب باستخدام هذا الأسلوب يمكن توضيح الآليات الجزيئية المفصلة فيها اعتراض شبكات حقيقية مختلف المواد. بيد أن وجود قيود على هذا الأسلوب أن عملية الغسيل يمكن أن تختلف عندما تحدث التفاعلات لاصقة بين الشباك وورم الخلايا في الجسم الحي. كثافة الخلايا السرطانية في الإعداد السريرية، أقل بكثير من تلك المستخدمة في هذا البروتوكول، التي قد قيد آخر.
الوقت الفاصل بين تحليل أشرطة الفيديو مفيد للغاية لرصد نتائج الأحداث الخلوية المختلفة على مدى فترة من الأيام. باستخدام نظام عرض كامل الخلية، نظهر أن شبكات يتم تدريجيا قد أفسدتها، يفترض أن الدناز الواردة في المصل، بينما MKN45 المحاصرين بسبب بدء شبكات تنتشر بعد ذلك بقوة. وأظهر شريط الفيديو هذا فقط تقسيم الخلايا السرطانية التي تعلق على الشباك، مع لا مقارنة ليعلق على اللوحة MKN45. العَدلات الملوثة وإضافة صبغة المصبوغة النووية قد أثرت أيضا نمو الخلايا السرطانية. ولذلك، يمكن أن لا نوجه استنتاج واضح فيما يتعلق بالآثار الصافية من الشباك على نمو الخلايا السرطانية. ومع ذلك، تشير إلى هذا التحليل أن الخلايا السرطانية لم يقتل بالشباك، ويمكن في الواقع البقاء على قيد الحياة بعد فخ شبكات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
ونشكر السيدة ج. شينوهارا وندا أولاً للأعمال الفنية والكتابية. أيضا، ونحن نشكر الدكتور شيرو ماتسوموتو وهرتا هيدينوري كوراشينا كينتارو كازويا تاكاهاشي لتعاونها من أجل اكتساب عينة في غرفة العمليات. وأيد هذا العمل معونات "البحث العلمي" من وزارة التعليم والعلوم، الرياضة، والثقافة اليابانية والجمعية اليابانية "النهوض بالعلم" (10606 ك 17).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
