Summary
यहां, हम एक विधि वर्तमान में मानव कम घनत्व न्यूट्रोफिल (LDN), पश्चात पेरिटोनियल लेवेज द्रव से बरामद, बड़े पैमाने पर न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल) और कुशलता से जाल मुक्त ट्यूमर कोशिकाओं है कि बाद में बढ़ने का उत्पादन ।
Abstract
सक्रिय न्यूट्रोफिल रिलीज न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल), जो कब्जा और रोगाणुओं को नष्ट कर सकते हैं । हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि जाल विभिन्न रोग प्रक्रियाओं में शामिल हैं, जैसे स्व-प्रतिरक्षित रोग, घनास्त्रता, और ट्यूमर मेटास्टेसिस. यहां, हम इन विट्रो तकनीक में एक विस्तृत दिखाने के लिए मुक्त ट्यूमर कोशिकाओं है, जो जाल के लिए लगाव के बाद बढ़ने के ट्रैपिंग के दौरान शुद्ध गतिविधि का पता लगाने । सबसे पहले, हम रोगियों जो laparotomies से गुजरा पश्चात पेरिटोनियल लेवेज द्रव से कम घनत्व न्यूट्रोफिल (LDN) एकत्र की । अल्पकालिक संवर्धन LDN के बड़े पैमाने पर शुद्ध गठन है कि हरी फ्लोरोसेंट परमाणु और गुणसूत्र counterstain के साथ visualized था परिणामस्वरूप । मानव गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों MKN45, OCUM-1, और NUGC-4 जाल के साथ की सह-मशीन के बाद, कई ट्यूमर कोशिकाओं जाल से फंस गए थे । बाद में मोह पूरी तरह DNase के साथ जाल के क्षरण से निष्प्रभाव था I. समय-चूक वीडियो से पता चला है कि ट्यूमर के जाल से फंसे कोशिकाओं को मरना नहीं था, लेकिन बजाय एक सतत संस्कृति में जोरदार वृद्धि हुई । इन विधियों जाल और कोशिकाओं और सामग्री के विभिंन प्रकार के बीच चिपकने वाला बातचीत का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
Polymorph परमाणु न्यूट्रोफिल रक्त संचारित में आम तौर पर घनत्व ढाल तैयारी विधि के माध्यम से mononuclear कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं । तथापि, कुछ न्यूट्रोफिल के रूप में जाना जाता कम घनत्व न्यूट्रोफिल (LDN), CD11b के साथ (+), CD15 (+), CD16 (+), और CD14 (-) phenotypes, सह रहे है mononuclear कोशिकाओं के साथ शुद्ध । LDN की सापेक्ष संख्या में कई रोग की स्थिति में बढ़ जाती है जिसमें स्व-प्रतिरक्षित रोग1,2, पूति3और कर्क4,5शामिल हैं । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि LDN6न्यूट्रोफिल के एक phenotypically और कार्यात्मक विशिष्ट वर्ग हैं । यह ध्यान देने योग्य है कि रक्त परिचालित में LDN अधिक न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल) सामान्य घनत्व न्यूट्रोफिल2,7से उत्पादन की संभावना है । जाल न्यूक्लिक एसिड से बना संरचनाओं की तरह वेब हैं, histones,, और दानेदार और cytosolic प्रोटीन, और वे कुशलतापूर्वक entrap और नष्ट कर सकते है8रोगजनकों ।
हाल ही में, जाल न केवल रोगाणुओं पर कब्जा करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन यह भी प्लेटलेट्स और परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं जो थक्का गठन9 और ट्यूमर मेटास्टेसिस10,11में सहायता कर सकते हैं । हालांकि, जाल और प्लेटलेट्स या ट्यूमर कोशिकाओं के बीच चिपकने वाला बातचीत के पीछे आणविक तंत्र अभी भी अस्पष्ट हैं । हाल ही में, एक इन विट्रो में आसंजन परख पता चला कि माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं (K56212) और फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं (A54913) β1 और β3 integrins के माध्यम से जाल को देते हैं । लेखकों न्यूट्रोफिल से अलग शुद्ध स्टॉक का इस्तेमाल किया और phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) द्वारा सक्रिय आसंजन सब्सट्रेट14के रूप में । हालांकि इस परख न्यूट्रोफिल के अभाव में शुद्ध घटकों के साथ वास्तविक बातचीत का पता लगाने की अनुमति देता है, यह यकीनन है कि "सेल मुक्त शुद्ध स्टॉक" उच्च गति केंद्रापसारक द्वारा अलग है आणविक संरचना में उत्पादित जाल को बरकरार रखती है vivo. हाल ही में, हमने पाया है कि पेट की सर्जरी के बाद पेरिटोनियल लेवेज द्रव कई परिपक्व LDN, जो बड़े पैमाने पर जाल उत्पंन और पेरिटोनियल मेटास्टेसिस15के कारण ट्यूमर कोशिकाओं से जुड़ी निहित । इस अध्ययन में, हम सफलतापूर्वक किसी भी शारीरिक हेरफेर के बिना बरकरार जाल के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के आसंजन की जांच की । यहां, हम जाल और मुक्त ट्यूमर कोशिकाओं के बीच चिपकने वाला बातचीत का पता लगाने के लिए एक तकनीक का विवरण दिखाते हैं ।
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Protocol
LDN इस अध्ययन में नामांकित रोगियों से प्राप्त किए गए थे और जीची चिकित्सा विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किए गए थे.
1. उदर गुहा Lavages और नेट का पता लगाने से LDN का अलगाव
- नमूना प्राप्ति
- पेट में घाव बंद होने से पहले उदर गुहा में सीधे बाँझ खारा के १,००० मिलीलीटर को अस्वीकार करें जो जठरांत्र द्रोह के कारण पेट की सर्जरी से गुजरा है ।
नोट: नमूने रोगियों जो एक gastrectomy, colectomy, या esophagectomy उम्र या सेक्स के आधार पर पूर्वाग्रह के बिना गुजर से प्राप्त किया गया । खारा एक कंटेनर में स्थानांतरित किया गया था और एक मिनट के भीतर पूरे पेट में डाल दिया । यह नियमित रूप से रोगियों पर महत्वपूर्ण प्रभाव के बिना एक पश्चात पेरिटोनियल धुलाई के रूप में प्रदर्शन किया है । - उदर गुहा को लेवेज के लिए बड़े पैमाने पर 1 मिनट ।
नोट: यह सिफारिश की है कि संचार द्रव धीरे सर्जन के हाथों से उभारा है ताकि नमूनों वर्दी हैं । - ४ ५० एमएल सिरिंज के साथ लेवेज द्रव की २०० मिलीलीटर की वसूली करें ।
नोट: कई बार तरल पदार्थ लेने के लिए रबर कनेक्टर का उपयोग किया जाता है ।
- पेट में घाव बंद होने से पहले उदर गुहा में सीधे बाँझ खारा के १,००० मिलीलीटर को अस्वीकार करें जो जठरांत्र द्रोह के कारण पेट की सर्जरी से गुजरा है ।
- granulocyte विशिष्ट मॉब, CD66b16का उपयोग कर पेरिटोनियल LDN का शुद्धिकरण करें ।
ध्यान दें: क्योंकि घनत्व ढाल केंद्रापसारक के बाद मध्यवर्ती परत कई mononuclear कोशिकाओं, polymorph न्यूट्रोफिल का सकारात्मक चयन CD66b मॉब का उपयोग किया गया है ।- एक ५० एमएल ट्यूब करने के लिए पेरिटोनियल लेवेज द्रव स्थानांतरण ।
नोट: इस चरण में, एक १०० µm नायलॉन फिल्टर के माध्यम से तरल पदार्थ पास अशुद्धियों को दूर करने के लिए । - २७० x जी पर 7 मिनट के लिए आर टी में पेरिटोनियल द्रव केंद्रापसारक ।
- ०.०२% EDTA के साथ पंजाब के 5 मिलीलीटर में छर्रों resuspend ।
- ध्यान से एक 3 मिलीलीटर घनत्व ढाल समाधान पर सेल निलंबन के 5 मिलीलीटर ओवरले ।
- 15 मिनट के लिए RT पर किसी भी टूटता बिना १,७०० x g पर केंद्रापसारक ।
- हार्वेस्ट एक पिपेट का उपयोग कर मध्यवर्ती परतों (आंकड़ा 1a) युक्त समाधान की ~ 2-3 मिलीलीटर और यह ०.०२% EDTA के साथ पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ मिश्रण ।
- 7 मिनट के लिए RT पर ४०० x g पर पेरिटोनियल द्रव केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
- ०.०२% EDTA के साथ पंजाब के एक और 10 मिलीलीटर जोड़ें, और 7 मिनट के लिए आरटी में २७० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें ।
- कोशिका गोली भंग (1 x 107) में ६० µ एल चुंबकीय कोशिका जुदाई किट के लिए बफर.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए छर्रों और गर्मी के लिए एफसी ब्लॉक के 20 µ एल जोड़ें ।
- microbeads के साथ विरोधी CD66b संयुग्मित के 20 µ एल जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए मशीन ।
- धो और फिर से ५०० में छर्रों निलंबित एमएसीएस बफर के µ एल ।
- एक उपयुक्त चुंबकीय विभाजक के चुंबकीय क्षेत्र में एक चुंबकीय स्तंभ के लिए सेल निलंबन लागू करें और बफर के 15 मिलीलीटर के साथ कॉलम धोने द्वारा CD66b (-) कोशिकाओं युक्त प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
- चुंबकीय विभाजक से कॉलम निकालें और तुरंत गोताख़ोर के स्तंभ में दृढ़ता से धक्का द्वारा चुंबकीय लेबल CD66b (+) कोशिकाओं को फ्लश ।
नोट: CD66b (+) सेल जनसंख्या के रूप में FACS विश्लेषण द्वारा निर्धारित न्यूट्रोफिल के ज्यादातर होते है कि > CD66 के 95% (+) अंश CD11b, CD15, और CD16 के लिए सकारात्मक हैं, लेकिन CD14 के लिए नकारात्मक है ।
- एक ५० एमएल ट्यूब करने के लिए पेरिटोनियल लेवेज द्रव स्थानांतरण ।
- पीढ़ी के जाल
- आरटी में 7 मिनट के लिए २७० x जी पर केंद्रापसारक के बाद, फिर से अलग LDN (5 x 106) RPMI1640 के 1 मिलीलीटर में 10% FCS के साथ निलंबित ।
- संस्कृति LDN पर एक 6 अच्छी तरह से पाली-एल lysine लेपित प्लेट (व्यास में 6 सेमी) के लिए 2 ज में ३७ ˚ C 5% CO2में ।
- 5 µ एम के अंतिम एकाग्रता में ग्रीन फ्लोरोसेंट counterstain (एक झिल्ली-अभेद्य रंग नाभिक और गुणसूत्रों दाग) जोड़ें ।
- तुरंत जाल की आकृति विज्ञान का निरीक्षण (extracellular डीएनए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत LDN से निष्कासित घटकों).
2. लाल फ्लोरोसेंट सेल linker डाई के साथ ट्यूमर कोशिकाओं का धुंधला
- मानव कैंसर सेल लाइनों MKN45, NUGC, और OCUM-1 तैयार करते हैं ।
- धो 1 9 पंजाब के साथ 107 कोशिकाओं + एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ०.०२% EDTA और आर टी पर 7 मिनट के लिए २७० x g पर केंद्रापसारक ।
- छर्रों के लिए दाग डाई के लिए समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और धीरे पिपेट ।
- धुंधला और २.२ कदम से सेल निलंबन के साथ मिश्रण के लिए समाधान के 1 मिलीलीटर में लाल फ्लोरोसेंट सेल linker डाई के 4 µ एल भंग ।
- आरटी में 4 मिनट के लिए छर्रों मशीन ।
- DMEM के 4 मिलीलीटर जोड़ें (10% FBS) के लिए दाग प्रतिक्रिया बंद करो ।
- 7 मिनट के लिए २७० x g केंद्रापसारक और supernatant त्यागें ।
- दोहराएं चरण २.६ और २.७ दो बार ।
- एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ जांच करें (उत्तेजना = ५५१ एनएम, उत्सर्जन = ५६७ एनएम) कि ट्यूमर कोशिकाओं लाल दाग रहे हैं ।
3. नेट के लिए ट्यूमर सेल आसंजन का विश्लेषण
- पुनः निलंबित लाल फ्लोरोसेंट दाग ट्यूमर कोशिकाओं (1 x 106) RPMI १६४० के 1 मिलीलीटर में ०.१% BSA के साथ पूरक ।
- चरण १.३ में वर्णित के रूप में जाल का उत्पादन किया है कि LDN संस्कृति के लिए ट्यूमर कोशिकाओं जोड़ें ।
- ३७ ˚ सी है, जो ट्यूमर कोशिकाओं को जाल से संपर्क करने में सक्षम बनाता है पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
नोट: लंबी गर्मी LDN या प्लेटों के लिए ट्यूमर सेल आसंजन लाती है । - मध्यम निकालें और धीरे से गर्म मीडिया (०.१% BSA + RPMI १६४०) के 2 मिलीलीटर जोड़कर कुओं धो और पकवान घूमता ।
- चरण ३.४ में धुलाई प्रक्रिया दोहराएं दो बार ।
नोट: के बाद से जाल कमजोर प्लेट को देते हैं, धोने के रूप में किया जाना चाहिए धीरे से खुद को जाल से बचने के लिए संभव के रूप में । - जाल के दृश्य के लिए 5 µ जी/एमएल की एक अंतिम एकाग्रता में नाभिक और गुणसूत्रों धुंधला के लिए हरी फ्लोरोसेंट डाई जोड़ें ।
- का पालन करें जाल और संलग्न ट्यूमर कोशिकाओं उपयुक्त फ़िल्टर का उपयोग (हरा, उत्तेजना = ५०४ एनएम, उत्सर्जन = ५२३ एनएम; लाल, उत्तेजना = ५५१ एनएम, उत्सर्जित = ५६७ एनएम) ।
- जाल से फंस रहे हैं कि ट्यूमर कोशिकाओं को दिखाने के लिए आंकड़े विलय.
नोट: कुछ प्रयोगों में, डीएनए क्षरण एंजाइम LDN संस्कृति के लिए जोड़ा गया था (अंतिम एकाग्रता १०० U/एमएल) 5 मिनट के लिए सह-मशीन 5 मिनट के लिए ।
4. फंस ट्यूमर कोशिकाओं के समय चूक वीडियो विश्लेषण
- संस्कृति पेरिटोनियल LDN में ३५ mm गोल डिश के साथ लेपित पाली-L-lysine चरण १.३ में वर्णित के रूप में ।
- नाभिक और गुणसूत्रों दाग के रूप में १.३ कदम में वर्णित जाल कल्पना के लिए हरी फ्लोरोसेंट डाई जोड़ें ।
- मशीन के 1 मिनट के बाद, मीडिया को हटाने और ०.१% BSA + RPMI १६४० के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
- मीडिया निकालें और दाग 1 x 106 MKN45 कोशिकाओं ०.१% BSA + RPMI १६४० में निलंबित जोड़ें । आरटी पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
- कदम ३.४ में वर्णित के रूप में धीरे धोने से किसी भी संलग्न ट्यूमर कोशिकाओं को निकालें और 10% FCS १०० u/एमएल पेनिसिलिन और १०० µ g/एमएल streptomycin के साथ पूरक के साथ DMEM जोड़ें ।
- एक पूरी दृश्य सेल अवलोकन प्रणाली में संस्कृति पकवान माउंट और उपयुक्त क्षेत्र है जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं जाल से फंस रहे हैं का चयन करें ।
- एक अतिरिक्त 2 दिनों के लिए सह संस्कृति के लिए जारी रखें और क्षेत्र की लगातार तस्वीरें ले सामांय प्रकाश और प्रतिदीप्ति, जो MKN45 कोशिकाओं और जाल, क्रमशः का पता लगाता है के तहत हर 6 मिनट ।
- प्रत्येक timepoint पर छवियों मिलाना और छवि दर्शक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर समय चूक वीडियो का निर्माण ।
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Representative Results
2 घंटे की संस्कृति में, CD66b (+) LDN पेरिटोनियल लेवेज द्रव से व्युत्पंन स्ट्रिंग हरी-परमाणु और गुणसूत्र (आंकड़ा 1b) के लिए फ्लोरोसेंट डाई के साथ दाग संरचनाओं दिखाया, जबकि CD66b (-) mononuclear कोशिकाओं (चित्रा 1C) नहीं किया । हालांकि, जब LDN संस्कृतियों १०० यू/एमएल DNase मैं, विशेषता संरचना (1 डी) नष्ट कर दिया गया था, यह दर्शाता है कि वे extracellular डीएनए न्यूट्रोफिल से निष्कासित की रचना की थी के साथ इलाज किया गया । जब LDN कोटिंग के बिना प्लास्टिक प्लेटों पर कल्चरित थे, कई नेट मीडिया में तैर क्लस्टर नीचे पर कुछ जाल के साथ देखा गया था (चित्रा 1E).
अगला, जाल के लिए ट्यूमर सेल लाइनों के आसंजन की जांच करने के लिए, MKN45 कोशिकाओं लाल फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल जाल और सह करने के लिए जोड़ा गया 5 मिनट के लिए मशीन । कोमल धुलाई के बाद कई MKN45 कोशिकाएं जुड़ी हुई मिलीं (फिगर 2a और 2c). इसके विपरीत, कुछ MKN45 कोशिकाओं संलग्न जब LDN DNase मैं (चित्रा 2 बी और 2c) के साथ इलाज किया गया । विलय आंकड़ा स्पष्ट रूप से पता चला है कि संलग्न MKN45 कोशिकाओं के बहुमत सह जाल के साथ स्थानीय थे, प्लेट (चित्रा 2d) के तल पर गठित संरचनाओं के रूप में देखा । इसी तरह के आसंजन पैटर्न OCUM-1 और NUGC-4 (चित्रा 2E और 2F) के साथ मनाया गया ।
के बाद से जाल को जीवाणुओं को साइटोटोक्सिक दिखाया गया है, हम तो जांच की है कि ट्यूमर जाल से फंस कोशिकाओं या मर एक सतत सह में जीवित समय चूक वीडियो का उपयोग कर संस्कृति । मजे की बात है, जबकि कई घंटे के भीतर ही जाल धीरे से गायब हो गया, MKN45 जाल से फंस कोशिकाओं को सख्ती से बाद में पैदा करना शुरू कर दिया (वीडियो 1) ।
चित्रा 1: पेरिटोनियल LDN की संस्कृति के बाद शुद्ध गठन । (एक) पश्चात लेवेज द्रव के घनत्व ढाल केंद्रापसारक के बाद, मध्यवर्ती परत से बरामद कोशिकाओं को दिखाया जाता है । (ख) फिर, CD66b (+) LDN CD66b से अलग किया गया (-) mononuclear कोशिकाओं और पाली-L-lysine लेपित 6-well प्लेट्स, परमाणु धुंधला डाई इसके अलावा और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ तत्काल अवलोकन द्वारा पीछा किया । (ग) CD66b की समान संख्या (-) mononuclear कोशिकाओं को समान शर्तों के अंतर्गत प्रसंस्कृत किया गया. (घ) LDN monolayer परमाणु धुंधला होने से पहले 5 मिनट के लिए मैं DNase के साथ मशीन था । (ङ) CD66b (+) LDN कोटिंग के बिना प्लास्टिक प्लेटों पर कल्चर्ड थे. सफेद सलाखों १०० µm प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन15से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: ट्यूमर कोशिकाओं के जाल में आसंजन । (क) पेरिटोनियल LDN पाली-एल-lysine लेपित 6-2 एच, जो बड़े पैमाने पर जाल का उत्पादन के लिए अच्छी तरह से प्लेटों पर कल्चरित थे । लाल fluorescein-बला MKN45 गयी । एक 5 मिनट की मशीन के बाद, unattacheded कोशिकाओं कोमल धोने से हटा दिया गया है, और शेष ट्यूमर कोशिकाओं को एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मनाया गया । (ख) MKN45 के अलावा, LDN monolayer 5 मिनट के लिए DNase I के साथ पूर्व में किया गया था । (ग) प्रयोगों (ए) और (ख)में, संलग्न MKN45 कोशिकाओं की संख्या को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत 3 यादृच्छिक क्षेत्रों में गिना गया और मतलब ± एसडी व्यक्त किया गया । (घ) कोमल धोने के बाद, परमाणु और गुणसूत्र के लिए हरी फ्लोरोसेंट डाई सह संस्कृति में जोड़ा गया था । प्रतिनिधि क्षेत्रों में, संलग्न MKN45 और शुद्ध संरचनाओं की तस्वीरें उपयुक्त ऑप्टिकल तरंग दैर्ध्य फिल्टर का उपयोग कर लिया गया था, और दो आंकड़े विलय कर दिया गया । इसी प्रयोग में (घ) OCUM-१ (ङ) और NUGC-४ (च)के लिए भी प्रदर्शन किए गए. सफेद सलाखों १०० µm प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा पिछले प्रकाशन15से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
1 वीडियो: फंस ट्यूमर कोशिकाओं के बाद आसंजन व्यवहार । LDN पाली-L-lysine लेपित 6-2 घंटे के लिए अच्छी तरह से प्लेटों पर कल्चरित थे, और शुद्ध गठन परमाणु और गुणसूत्र के लिए ग्रीन फ्लोरोसेंट डाई द्वारा की पुष्टि की थी । फिर, दाग MKN45 कोशिकाओं को जोड़ा और 5 मिनट के लिए सह-मशीन थे, और unstained कोशिकाओं कोमल धोने से हटा दिया गया था और 10% FCS + DMEM में सह-संस्कृति होना जारी रखा । एक पूरे दृश्य सेल अवलोकन प्रणाली का उपयोग करना, क्षेत्रों जहां ट्यूमर कोशिकाओं को जाल से फंस गए थे के लिए खोज रहे थे । क्षेत्र की तस्वीरें तो सामांय प्रकाश और प्रतिदीप्ति, जो क्रमशः ट्यूमर कोशिकाओं और जाल के स्पष्ट आंकड़े सक्षम के तहत हर 6 मिनट लिया गया । अंत में, छवियों छवि दर्शक सॉफ्टवेयर के साथ आरोपित थे, और एक समय चूक वीडियो वास्तविक समय से एक 3600x उच्च गति पर बनाया गया था । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
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Discussion
पिछले अध्ययनों से सूचित किया है कि परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं vivo10,11में नेट सब्सट्रेट द्वारा फंस जा सकता है । मेटास्टेटिक स्तन कैंसर कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया गया है न्यूट्रोफिल और जाल के गठन प्रेरित है, जो लक्ष्य अंग17में ट्यूमर सेल विकास में सहायता करता है । इसके अलावा, हमने पाया है कि LDN पश्चात लेवेज द्रव से अल्पकालिक संस्कृतियों बड़े पैमाने पर जाल है कि कुशलतापूर्वक आगे उत्तेजना15बिना ट्यूमर कोशिकाओं entrap सकता का उत्पादन किया । इन टिप्पणियों मेटास्टेटिक प्रक्रिया में जाल की यांत्रिक भागीदारी के लिए एक संभावित भूमिका का सुझाव देते हैं । हालांकि, विस्तृत आणविक तंत्र कि मध्यस्थता जाल और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच चिपकने वाला बातचीत अभी भी अस्पष्ट है. हाल के अध्ययनों से इस प्रक्रिया में integrin की भागीदारी को सक्रिय न्यूट्रोफिल से पृथक किया गया है जो आसंजन सब्सट्रेट12,13के रूप में कार्य करते हैं । हालांकि, शुद्ध और केंद्रित जाल घटकों को मूल जाल से काफी हद तक अलग आणविक संरचनाओं के लिए माना जाता है । इसकी तुलना में, हमारे विधि शारीरिक हेरफेर के बिना बरकरार जाल का उपयोग करता है, जो एक मजबूत लाभ जब जाल के साथ चिपकने वाला बातचीत के विस्तृत तंत्र की जांच है । इस सरल तकनीक के साथ, शोधकर्ताओं ने जल्दी जाल के लिए कई ट्यूमर कोशिकाओं के विशिष्ट लगाव का पता लगा सकते हैं (5 मिनट के भीतर).
प्रोटोकॉल की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता प्लेट के तल पर नेट संरचनाओं को ठीक करने के लिए एक पाली-एल-lysine लेपित प्लेट का उपयोग है । जब LDN कल्चर के लिए बरकरार प्लास्टिक प्लेटों का इस्तेमाल किया गया तो नीचे कुछ ही जाल का पता लगाया गया । इसके अलावा, कई हरे-सकारात्मक समूहों को संस्कृति मीडिया में आज़ादी के रूप में तैरते हुए देखा गया, जब उन्हें प्लेट (1 d) से अलग किया गया हो । हम भी कोलेजन, fibronectin के साथ लेपित प्लेटों पर शुद्ध गठन की जांच की, और laminin, जो नीचे की परत में वेब संरचनाओं की तरह का पता लगाने के सक्षम होना चाहिए । हालांकि, जाल के लिए पाली-L-lysine की तुलना में कम कसकर सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न दिखाई दिया, और वे आसानी से धोने की प्रक्रिया से अलग थे. इसलिए, इन अंय विकल्प आसंजन परख के लिए अपर्याप्त हैं । वास्तव में, यदि हम पाली-एल-lysine कोटिंग्स, जाल और किसी भी संलग्न ट्यूमर कोशिकाओं के बिना प्लेट का उपयोग आसानी से बस कुओं को मीडिया से जोड़कर थाली से हटा दिया जा सकता है ।
आसंजन परख में महत्वपूर्ण कदम सह के मशीन की अवधि ट्यूमर कोशिकाओं के साथ संस्कृति है । पांच मिनट के लिए पर्याप्त है ट्यूमर कोशिकाओं को जाल से बांध । प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, 6-अच्छी तरह से प्लेट के लिए ट्यूमर कोशिकाओं से युक्त समाधान जोड़ने, सभी ट्यूमर कोशिकाओं प्लेट के तल पर गठित शुद्ध संरचनाओं के साथ शारीरिक संपर्क बनाते हैं । हालांकि, एक लंबी अवधि के लिए सह संवर्धन (उदाहरण के लिए, 10 मिनट से अधिक) LDN या पाली-L-lysine सब्सट्रेट करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के बंधन में परिणाम. इसलिए, मशीन समय जाल करने के लिए विशिष्ट बाध्यकारी का पता लगाने के लिए कम होना चाहिए । कोमल धुलाई का युद्धाभ्यास एक और जरूरी बिंदु है । हम धीरे से एक अच्छी तरह से पक्ष की दीवार से गर्म मीडिया जोड़ने के लिए यकीन है, धीरे थाली स्विंग, और एक aspirator के साथ supernatant को दूर करने के लिए सुनिश्चित किया । चूंकि नेट प्लेट कमजोर से चिपके रहते हैं, इस प्रक्रिया को विशेष रूप से सतर्क तरीके से किया जाना चाहिए ।
इस तकनीक तथ्य यह है कि एक अलग आणविक तंत्र ट्यूमर मिनट के भीतर जाल को बाध्यकारी कोशिकाओं के लिए आवश्यक है पर प्रकाश डाला गया है, कि एक ~ 30-60 शुद्ध स्टॉक12,13के लिए मिनट की गर्मी के साथ एक आसंजन परख में दिखाया गया है । इस विधि का उपयोग कर प्रयोग अवरुद्ध विस्तृत आणविक तंत्र जिसमें असली जाल जाल विभिन्न सामग्रियों स्पष्ट कर सकते हैं । हालांकि, इस तकनीक की एक सीमा है कि धोने की प्रक्रिया अलग कर सकते है जब चिपकने वाला बातचीत vivo मेंजाल और ट्यूमर कोशिकाओं के बीच हो । नैदानिक सेटिंग में, ट्यूमर कोशिकाओं का घनत्व बहुत कम है कि इस प्रोटोकॉल है, जो एक और सीमा मौजूद हो सकता है में इस्तेमाल किया ।
समय चूक वीडियो विश्लेषण दिनों की अवधि में विभिन्न सेलुलर घटनाओं के परिणामों की निगरानी के लिए अत्यधिक उपयोगी है. पूरे सेल दृश्य प्रणाली का उपयोग करना है, हम बताते है कि जाल धीरे से नीचा दिखा रहे हैं, DNAse द्वारा संभवतः सीरम में निहित है, जबकि MKN45 द्वारा फंसे जाल शुरू करने के लिए जोरदार पैदा करना के बाद । इस वीडियो केवल जाल से जुड़ी ट्यूमर कोशिकाओं के विभाजन दिखाया, थाली से जुड़ी MKN45 के लिए कोई तुलना के साथ. दूषित न्यूट्रोफिल और जोड़ा परमाणु धुंधला डाई भी ट्यूमर कोशिकाओं के विकास को प्रभावित किया है हो सकता है । इसलिए, हम एक निश्चित ट्यूमर सेल विकास पर जाल के शुद्ध प्रभाव के बारे में निष्कर्ष आकर्षित नहीं कर सका । हालांकि, इस विश्लेषण से संकेत मिलता है कि ट्यूमर कोशिकाओं के जाल से नहीं मारे गए है और वास्तव में जाल से फंसाने के बाद बच सकते हैं ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
तकनीकी और लिपिकीय कार्य के लिए हम सुश्री जे. Shinohara और Nieda का धन्यवाद करते हैं. इसके अलावा, हम डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । Shiro मात्सुमोतो, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina, और Kazuya ताकाहाशी ऑपरेटिंग कमरे में नमूना अधिग्रहण के लिए उनके सहयोग के लिए । यह काम शिक्षा के मंत्रालय, विज्ञान, खेल, और जापान की संस्कृति और विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (17K10606) से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
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