Summary
ひと低密度好中球 (LDN) 術後の腹腔洗浄液から回収が大規模な好中球細胞外トラップ (網) を生成し、その後成長無料腫瘍細胞を効率的にトラップの方法を紹介します。
Abstract
好中球リリース好中球細胞外トラップ (網) を取り込んで微生物を破壊することができますをアクティブ化します。最近の研究では、ネットがさまざまな病気プロセス、自己免疫疾患、血栓症、腫瘍の転移などに関与していることを示唆しています。ここで、網に付着後成長無料腫瘍細胞の捕捉中にネット活動を検出する詳細な培養技術を紹介します。第 1 に、開腹症例から術後腹腔洗浄液から低密度好中球 (LDN) を集めました。LDN の短期養殖緑蛍光核と染色体の対比染色に視覚化された大規模なネット形成で起因しました。ひと胃癌細胞株ネットと NUGC 4、OCUM 1、MKN45 の共同培養後多くの腫瘍細胞は網によって閉じ込められました。その後、添付ファイルは、DNase I. 低速度撮影ビデオは網によって閉じ込められている腫瘍細胞が死んでいなかったこと明らかに取り付けた網の劣化によって完全に廃止されたが、代わりに連続培養における旺盛します。これらのメソッドは、ネットとセルと材料の様々 なタイプの接着剤の相互作用の検出に適用可能性があります。
Introduction
循環血液における多形核好中球は通常単核細胞から密度グラデーション製法によって区切られます。ただし、CD11b(+)、CD15(+)、CD16(+)、および CD14(-) の表現型を持つ低密度好中球 (LDN) として知られているいくつかの好中球、単核細胞と共同浄化されました。LDN の相対数は、大幅自己免疫疾患1、2敗血症3がん4,5など様々 な病態で増加します。以前の研究では、LDN が好中球6の表現型と機能別のクラスであることを示しています。循環血液で LDN は通常の密度好中球2,7より好中球細胞外トラップ (網) を生成する可能性が高いことに注意してください。ネットは核酸、ヒストンやプロテアーゼ、粉粒体、ゾル性細胞質蛋白質から成る web のような構造であり、彼らは効率的にわなに掛けることができる病原体8を破壊して。
最近では、ネットをキャプチャだけでなく、微生物も血小板、血栓形成9および腫瘍転移10,11に役立つ腫瘍細胞を循環する示されています。しかし、ネットと血小板または腫瘍細胞間接着剤の相互作用の背後にある分子メカニズムはまだ明らかではありません。最近では、体外で接着アッセイは、骨髄性白血病細胞 (K56212) および肺癌細胞 (A54913) が β3 と β 1 インテグリンを介してネットに接続するを明らかにしました。著者には、好中球由来及びホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) 接着基板14によって活性化ネット ストックが使用されます。かどうかの生産網と同じ分子構造を保持"由来の無細胞ネット証券「高速遠心分離によって分離されたこのアッセイは、好中球の不在で NET コンポーネントと現実の相互作用の検出を使用できますが、それは議論の余地vivo。最近、我々 は腹部手術に含まれる大規模な網を生成、腹膜転移15を引き起こす腫瘍細胞に接続されている多くの成熟した LDN 後その腹腔洗浄液を発見します。本研究では、物理的な操作をすることがなくそのままネットへの腫瘍細胞の接着を調べた正常に。ネットと無料の腫瘍細胞間接着の相互作用を検出する技術の詳細を紹介します。
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Protocol
LDN は本研究で登録された患者から得られたし、制度的レビュー ボードの自治医科大学によって承認されました。
1. 腹腔内洗浄と純の検出から LDN の分離
- サンプルの収集
- 消化管の悪性腫瘍による腹部手術を受けた患者の創傷閉鎖する前に腹腔内に直接通常の滅菌生理食塩水 1000 mL を吹き込みます。
注: サンプルは、年齢や性別に基づくバイアスのない胃切除術、結腸切除術、または食道切除術を受けた患者から得られました。生理食塩水は、コンテナーに転送され、注がれる腹部全体 1 分以内。これは日常的に患者に重大な影響なし術後腹腔洗浄として実行されます。 - 少なくとも 1 分間広く腹腔洗浄液。
注: サンプルが均一なので、外科医の手でゆっくりと、注入液攪拌はそれをお勧めします。 - 4 50 mL 注射器洗浄液 200 mL を回復します。
注: 時々 ゴム コネクタが流体を取るされます。
- 消化管の悪性腫瘍による腹部手術を受けた患者の創傷閉鎖する前に腹腔内に直接通常の滅菌生理食塩水 1000 mL を吹き込みます。
- 顆粒球特定 mAb、CD66b16を使用して腹膜の LDN の浄化を実行します。
注: 密度勾配遠心後の中間層には、多くの単核細胞が含まれています、CD66b モノクローナル抗体を用いた多形体好中球の正の選択を行った。- 腹腔洗浄液を 50 mL のチューブに転送します。
注: この手順では、不純物を除去する 100 μ m ナイロン フィルターを通して流体を渡します。 - 室温 7 分 270 x g で腹水を遠心分離します。
- 5 mL の 0.02 %edta で PBS でペレットを再懸濁します。
- 慎重に 3 mL 密度勾配ソリューションに細胞懸濁液 5 mL をオーバーレイします。
- 休憩なしの常温 15 分 1,700 × g で遠心分離機します。
- 2 〜 3 mL のピペットを使用して中間層 (図 1 a) を含む溶液を収穫し、10 ml の PBS の 0.02 %edta のミックスします。
- RT で 7 分の 400 x g で腹水を遠心し、上澄みを廃棄します。
- 破棄した上清で 7 分間 270 x g で 0.02 %edta と遠心分離機の PBS の別の 10 mL を追加します。
- 磁気細胞分離キット用のバッファーの 60 μ L 細胞ペレット (1 x 10 の7) を溶かしてください。
- ペレットに Fc ブロックの 20 μ L を加え、4 ° C で 10 分間インキュベート
- 反 CD66b の 20 μ L マイクロ ビーズと共役し、4 ° C でさらに 10 分間インキュベートを追加します。
- 洗浄し、再 MAC バッファーを 500 μ l 添加の餌を中断します。
- 磁気セパレーターの磁場中磁気列に細胞懸濁液を適用し、15 mL のバッファーとカラムを洗浄することにより、流れを含んでいる CD66b(-) 細胞を収集します。
- 磁選機から列を削除して、しっかりと列にプランジャーを押すことにより磁気標識 CD66b(+) 細胞をすぐに洗い流します。
注: CD66b(+) セル人口を示す FACS 解析によって決定される好中球のほとんどで構成されています > CD66(+) 分画の 95% は CD11b、CD15、CD16 に肯定的な CD14 の負。
- 腹腔洗浄液を 50 mL のチューブに転送します。
- ネットの世代
- RT で 7 分間 270 × g で遠心分離後再分離の LDN を中断 (5 x 106) 1 ml の 10% の FCS で RPMI1640。
- 6 ウェル ポリ-L-リジン コーティング プレート (直径 6 cm) 5% CO2の 37 ° C で 2 時間の LDN を文化します。
- 5 μ M の最終的な集中に蛍光グリーンの対比染色 (核や染色体を染色する膜不透過性色素) を追加します。
- すぐにネット (蛍光顕微鏡下で LDN から追放するものと細胞外 DNA コンポーネント) の形態を観察します。
2. 赤い蛍光細胞リンカー染付腫瘍細胞の染色
- ひと癌細胞株 MKN45、NUGC、および OCUM 1 を準備します。
- 1 x 10 の7セル PBS + 15 の mL の管、室温 7 分 270 × g で遠心分離で 0.02 %edta を洗う
- ペレット、染色色素の溶液 1 mL を追加し、そっとピペットします。
- 赤蛍光細胞リンカー色素染色溶液 1 mL に 4 μ L を溶解し、2.2 の段階から細胞懸濁液と混ぜます。
- 室温 4 分のペレットを孵化させなさい
- DMEM の 4 つの mL を追加 (10 %fbs) 染色反応を停止します。
- 7 分 270 × g を遠心し、上清を捨てます。
- 2.6 および 2.7 の手順を 2 回繰り返します。
- 蛍光顕微鏡で確認 (励起 = 551 nm、出力 = 567 nm) 腫瘍細胞が赤を染色します。
3. 癌細胞接着のネットの解析
- 1 ml 0.1 %bsa 添加 RPMI 1640 の赤蛍光染色腫瘍細胞 (1 x 106) を再停止します。
- 手順 1.3 で説明したように網を作り出した LDN 文化に腫瘍細胞を追加します。
- 回路網に接触する腫瘍細胞を可能にする、37 ° C で 5 分間インキュベートします。
注: 長い潜伏癌細胞接着の LDN またはプレートを誘導します。 - メディアを取り出して、皿を旋回を prewarmed メディア (0.1 %bsa + RPMI 1640) 2 mL を追加して優しく洗浄します。
- 手順 3.4 では洗濯の手順を 2 回繰り返します。
注: ネットから弱アタッチ プレート、網自体の除去を避けるためにできるだけ優しく洗浄を行う必要があります。 - 核と染色体 5 μ G/ml 網の可視化のための最終的な集中での汚損のため緑の蛍光染料を追加します。
- 網を観察し、適切なフィルターを使用して腫瘍細胞を添付 (緑、励起 = 504 nm、発光 = 523 nm; 赤、励起 = 551 nm、出力 = 567 nm)。
- ネットで閉じ込められている腫瘍のセルを表示する数字をマージします。
注意: いくつかの実験で DNA 分解酵素追加されました LDN 文化 (最終濃度 100 U/mL) に 5 分 5 分の共同培養前に、。
4 閉じ込められた腫瘍細胞の時間経過ビデオ解析
- 35 mm で腹膜の LDN の文化はラウンド被覆ポリ L リジン手順 1.3 で説明した料理です。
- 核と 1.3 の手順で説明されているようにネットを可視化する染色体の汚損のため緑の蛍光染料を追加します。
- インキュベーションの 1 分後にメディアを取り出し、0.1 %bsa + RPMI 1640 2 mL を加えます。
- メディアを取り出し、無染色 1 × 106 MKN45 セル中断 0.1 %bsa + RPMI 1640 を追加します。右で 5 分間インキュベートします。
- 手順 3.4 で優しく洗浄することにより任意の未接続の腫瘍細胞を除去し、100 u/mL ペニシリンおよび 100 μ g/mL ストマイ添加 10 %fcs を DMEM を追加します。
- 全体ビューのセルの観測システムで培養皿をマウントし、腫瘍細胞が網によって閉じ込められている適切なフィールドを選択します。
- 2 日間をさらに共培養し、フィールドの連続撮影通常の光と MKN45 細胞と網をそれぞれ検出する蛍光の下 6 分毎に進みます。
- 各 timepoint でイメージを重ね合わせ、画像ビューアーのソフトウェアを使用して、時間経過のビデオを作成します。
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Representative Results
2 時間の文化で腹膜灌流液の示した文字列の構造から派生した CD66b(+) LDN の緑色蛍光色素で染色核と染色体 (図 1 b) CD66b(-) 単核細胞がいない中 (図 1)。ただし、前処理は LDN 文化 100 U/mL DNase 私は、特徴的な構造は破壊 (図 1)、彼らが好中球から追放された細胞外 DNA で構成されていたことを示します。LDN はコーティングに浮かぶ多くの NET クラスターなしプラスチック プレートで培養したとき (図 1E) の下にいくつかネット メディアは観察されました。
次に、ネットに腫瘍細胞の接着性を調べる MKN45 セルの赤色蛍光色素で標識された網に追加し、5 分インキュベート共同。穏やかな洗浄後細胞が発見された多くの MKN45 は、(図 2 aおよび2 C) を添付しました。対照的に、いくつかの MKN45 セル接続時の前処理は、LDN (図 2 bおよび2 C)。マージされた図は、添付の MKN45 細胞の大半がネット、プレート (図 2 D) の底部に形成される構造とする見ると共局在を明らかに示した。同様の接着パターンは、OCUM 1、NUGC 4 (図 2 eおよび2 f) で観察されました。
ネットが細菌に細胞毒性が示されているので我々 は、ネット金型によって閉じ込められた腫瘍細胞かどうか検査またはコマ撮り映像を用いた連続培養で生き残る。興味深いことに、一方ネットは徐々 にいくつかの時間内で姿を消した、MKN45 細胞はその後積極的に増殖し始めた網 (ビデオ 1) によってトラップします。
図 1: 腹膜 LDN の文化後ネット形成。(A)密度勾配遠心法術後の洗浄液、細胞が中間層から回復が表示されます。(B) CD66b(+) LDN いた CD66b(-) 単核細胞から分離し、核染色色素と蛍光顕微鏡による直接観察後、ポリ L リジン コーティング 6 ウェル プレート上で培養しました。(C) CD66b(-) 単核細胞数が同じは、同じ条件下で培養しました。(D) 、LDN 単層だったインキュベートを DNase 私核染色前に 5 分間。(E) CD66b(+) LDN はコーティングなしのプラスチック プレートで培養した.白い棒は、100 μ m を表します。この図は、以前の文書15から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 腫瘍の接着細胞の網。(A)腹膜 LDN は大規模な網を生成 2 時間ポリ L リジン コーティング 6 ウェル プレートで培養しました。赤の蛍光ラベル MKN45 を追加されました。5 分間インキュベーション後未接続細胞穏やかな洗浄により除去し、蛍光顕微鏡下で残りの腫瘍細胞が観察されました。5 分(C) (A)および(B)接続されている MKN45 細胞数の実験で私は蛍光顕微鏡下で 3 つのランダムなフィールドで数えられた DNase で前処理した LDN 単層だった MKN45 の加算の前に(B)と± SD を表明を意味します。(D)緑の蛍光色素の穏やかな洗浄後核と染色体を共培養を追加しました。代表的なフィールドで添付の MKN45 とネットの構造物の写真は、適切な波長フィルターを使用して撮影された、2 つの数字が合併します。OCUM 1 (E)と(F)NUGC 4 また(D)で同じ実験を行った。白い棒は、100 μ m を表します。この図は、以前の文書15から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1: 閉じ込められた腫瘍細胞の後凝着現象。LDN は 2 時間、ポリ-L-リジン コーティング 6 ウェル プレートで培養したし、ネットの形成が確認された緑の蛍光色素の核と染色体。無染色の MKN45 セルが追加され、5 分インキュベート共同し、未接続細胞穏やかな洗浄により除去し、10% で共培養する続けて FCS + DMEM。腫瘍細胞が網に引っかかったエリア全体表示細胞観察システムを使用して、検索されました。フィールドの写真は、通常の光と蛍光腫瘍細胞と網の明確な数字がそれぞれ有効になって下 6 分が撮影されたし。最後に、画像が画像ビューアーのソフトウェアと重ねられ、タイムラプス ビデオは、リアルタイムより 3600 x 高速で作成されました。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
以前の研究は、10、生体内で純基板11循環腫瘍細胞をトラップできることを報告しています。転移性乳癌細胞は、好中球を刺激しターゲット器官17の腫瘍細胞の成長を支援するネットの形成を誘導する示されています。さらに、術後の洗浄液から LDN の短期的な文化が効率的にさらに刺激15せず腫瘍細胞をわなに掛けることができる大規模な網を生産がわかった。これらの観察は、転移のプロセスでネットの機械的介入のための可能な役割をお勧めします。ただし、ネットと腫瘍細胞の接着剤の相互作用を仲介する詳細な分子メカニズムはまだ明らかではありません。最近の研究は、接着基板12,13として活性化好中球から分離されたネットの在庫を使用してこのプロセスでインテグリンの関与関与しています。ただし、精製と濃縮のネット コンポーネントは元網から大きく異なる分子構造になっています。比較では、本手法は、ネットと接着剤の相互作用の詳細なメカニズムを調べるとき強力な利点は、物理的な操作せずそのままネットを使用します。この単純な手法での研究者は多くの腫瘍細胞の添付ファイルは、特定のネットをすぐに (5 分) 以内を検出できます。
プロトコルで最も重要なは、プレートの下部にネットの構造を修正するポリ-L-リジン コーティング プレートの使用です。LDN 文化そのままプラ板を用いて、いくつかネットだけが下部に検出されました。さらに、多くの緑-肯定的なクラスターは、プレート (図 1) からデタッチされているときに、文化メディアで自由に浮かぶとして観察されました。また、純コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、底層の web のような構造の検出を有効にすると皮膜形成を調べた。ポリ L リジンに緊密よりも小さい基板に付ける網が登場し、彼らは簡単に洗浄方法でデタッチしました。したがって、これらの他のオプションは、付着の試金のために十分ではありません。実際には、ポリ L リジン コーティングなしの板を使用する場合ネットと接続された腫瘍のセル削除ことができますになる簡単にプレートから井戸にメディアを追加するだけで。
接着アッセイの重要なステップは、腫瘍細胞との共培養の潜伏期間です。5 分はネットにバインドする腫瘍細胞のために十分です。実験の条件では、6 ウェル プレートに腫瘍細胞を含むソリューションを追加する場合、[すべての腫瘍細胞はプレートの下部に形成されたネット構造物の物理的な接触を確認します。ただし、LDN またはポリ L リジン基板への腫瘍細胞のバインディングに長い期間 (例えば、 10 分を超える) 結果の共培養。したがって、インキュベーション時間は短い特異的結合網を検出するべきです。もう一つの重要なポイントは、穏やかな洗浄の工作します。ゆっくりとそれぞれの側壁から温めたメディアも、優しくスイング プレートとヒメアリ上清を除去を追加することを確認しました。ネット弱プレートに固執する、ので、特に慎重な方法でこの処理を実行する必要があります。
この手法に示す 30 ~ 60 分インキュベーションと接着アッセイ ネットに在庫の12,13腫瘍細胞よりも数分では、ネットへのバインドの別の分子メカニズムが必要であるという事実を強調します。このメソッドを使用して実験をブロック、実際ネット トラップ各種材料詳細な分子メカニズムを明らかことができます。ただし、この技法の制限は、ネットと腫瘍細胞の生体接着剤の相互作用が発生したときに洗浄工程が異なるできることです。臨床場面における腫瘍細胞の密度は別の制限が存在する可能性がある、この議定書で使用されるよりもずっと低い。
タイムラプス ビデオ分析は日の期間にわたって様々 な携帯電話のイベントの成果を監視するのに非常に役立ちます。ネットが徐々 に低下、おそらく MKN45 トラップ ネット開始以後活発に増殖するのに対し、血清に含まれる DNAse によって示す全体セル表示システムを使用すると、.このビデオは、唯一 MKN45 プレートに取り付け比較しないとネットに接続されている腫瘍細胞の分裂を示した。汚染された好中球と追加の核染色色素がまた影響を受けた腫瘍細胞の成長。したがって、我々 は、腫瘍細胞増殖に対するネットの純効果について明確な結論を描画できませんでした。ただし、この分析は示し腫瘍細胞網によって殺されずに、ネットによるわなに掛ける事の後を生き残ることができる実際には。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
技術と事務作業、さん j. 篠原と I. Nieda に感謝します。また、松本史朗夫妻、秀典春田、倉科健太郎、高橋一也は、手術室でのサンプルの収集への協力を感謝いたします。この仕事は、学術振興 (17 K 10606) 教育省、科学、スポーツ、日本文化と日本社会科学研究費補助金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
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