Summary
Vi præsenterer her, en metode hvor menneskelige low-density neutrofile (LDN), inddrives fra postoperative peritoneal lavage væske, producere massive neutrofile ekstracellulære fælder (net) og effektivt fælde gratis tumorceller, der senere vokser.
Abstract
Aktiveret neutrofiler release neutrofile ekstracellulære fælder (net), som kan fange og ødelægge mikrober. Nylige undersøgelser tyder på at NETs er involveret i forskellige sygdomsprocesser, såsom autoimmune sygdom, trombose og tumor metastaser. Her viser vi en detaljeret in vitro- teknik til at detektere netto aktivitet under diffusering af gratis tumorceller, der vokser efter tilknytning til NETs. Først, vi indsamlet lavdensitet neutrofile (LDN) fra postoperative peritoneal lavage væske fra patienter, der gennemgik laparotomies. Kortsigtede dyrkning af LDN resulterede i massiv netto dannelse, der blev visualiseret med grøn fluorescerende nukleare og kromosom kontrastfarve. Efter Co inkubation af menneskelige gastrisk kræft cellelinjer MKN45, dokumenter-1 og NUGC-4 med garnene, blev mange tumorceller fanget af nettene. Efterfølgende, den vedhæftede fil blev fuldstændig ophævet ved nedbrydning af net med DNase I. Time-lapse video afslørede, at tumorceller fanget af garnene ikke gjorde dø, men i stedet voksede kraftigt i en kontinuerlig kultur. Disse metoder kan anvendes til påvisning af selvklæbende interaktioner mellem net og forskellige typer af celler og materialer.
Introduction
Polymorph nukleare neutrofiler i cirkulerende blod er typisk adskilt fra mononukleære celler gennem metoden tæthed gradient forberedelse. Nogle neutrofiler, kendt som low-density neutrofile (LDN), med CD11b(+), CD15(+), CD16(+) og CD14(-) fænotyper, er imidlertid Co renset med mononukleære celler. Det relative antal LDN øger i forskellige patologiske betingelser herunder autoimmune sygdomme1,2, sepsis3og kræft4,5. Tidligere undersøgelser har vist, at LDN er en fænotype og funktionelt adskilte klasse af neutrofiler6. Det skal bemærkes, at LDN i cirkulerende blod er mere tilbøjelige til at producere neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) end normal tæthed neutrofiler2,7. NETs er web-lignende strukturer sammensat af nukleinsyrer, histoner, proteaser og kornede og cytosole proteiner, og de kan effektivt have fat og ødelægger patogener8.
For nylig, net har vist sig at fange ikke kun mikrober, men også blodplader og cirkulerende tumorceller, som kan hjælpe med blodprop dannelse9 og tumor metastaser10,11. Men de molekylære mekanismer bag de selvklæbende interaktioner mellem net og blodplader eller tumorceller er stadig uklart. En in vitro- vedhæftning analyse afslørede for nylig, at myeloid leukæmiceller (K56212) og lunge cancer celler (A54913) tillægger net via B1 og β3 integriner. Forfatterne anvendte NET stock isoleret fra neutrofile og aktiveres af phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) som vedhæftning substrat14. Selv om denne analyse giver påvisning af virkelige interaktioner med netto komponenter i fravær af neutrofiler, kan det diskuteres hvorvidt de "celle-gratis NET stock" isoleret ved højhastigheds centrifugering bevarer den molekylære struktur identisk med net produceret i vivo. For nylig, fandt vi at peritoneal lavage væske efter abdominal kirurgi indeholdt mange modne LDN, som genereres massive redskaber og knyttet til tumorceller forårsager peritoneal metastaser15. I denne undersøgelse undersøgte vi med held vedhæftning af tumorceller til intakt redskaber uden fysisk manipulation. Her, viser vi oplysninger om en teknik til at registrere klæbende interaktioner mellem net og gratis tumorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LDN er fremstillet af patienter tilmeldt i denne undersøgelse og blev godkendt af den institutionelle Review Board af Jichi medicinske universitet.
1. isolering af LDN fra bughulen Lavages og netto påvisning
- Prøven erhvervelse
- Indgyde 1.000 mL normalt sterilt saltvand direkte ind i bughulen før sår lukning i patienter, der har gennemgået abdominal kirurgi på grund af gastrointestinale malignitet.
Bemærk: Prøver blev indhentet fra patienter, der undergik en gastrektomi, kolektomi eller esophagectomy uden fordomme baseret på alder eller køn. Saltvand blev overført i en beholder og hældes i hele maven inden for et minut. Dette udføres rutinemæssigt som en postoperativ peritoneal vask uden betydelige virkninger på patienter. - Lavage bughulen udførligt for mindst 1 min.
Bemærk: Det anbefales at infunderes væsken langsomt rørte med kirurgens hænder, således at prøverne er ensartet. - Genskab 200 mL lavage væske med fire 50 mL sprøjter.
Bemærk: Nogle gange en gummi-stik bruges til at tage op væsker.
- Indgyde 1.000 mL normalt sterilt saltvand direkte ind i bughulen før sår lukning i patienter, der har gennemgået abdominal kirurgi på grund af gastrointestinale malignitet.
- Udfør rensning af peritoneal LDN bruger granulocyt specifikke mAb, CD66b16.
Bemærk: Da det mellemliggende lag efter tæthed gradient centrifugering indeholder mange mononukleære celler, positiv markering af polymorph neutrofiler ved hjælp af CD66b mAb blev udført.- Overføre peritoneal lavage væske til en 50 mL tube.
Bemærk: I dette trin skal passere væsker gennem en 100 µm nylon filter til at fjerne urenheder. - Centrifugeres peritonealvæske ved 270 x g i 7 min. ved RT.
- Resuspend pellets i 5 mL PBS med 0,02% EDTA.
- Omhyggeligt overlay 5 mL cellesuspension til 3 mL tæthed gradient løsning.
- Der centrifugeres ved 1.700 x g i 15 min. ved RT uden afbrydelser.
- Høste ~ 2-3 mL af opløsning indeholdende de mellemliggende lag (figur 1A) ved hjælp af en pipette og bland det med 10 mL PBS med 0,02% EDTA.
- Centrifugeres peritonealvæske ved 400 x g i 7 min. ved RT og supernatanten.
- Tilføj en anden 10 mL PBS med 0,02% EDTA, og der centrifugeres ved 270 x g i 7 min. ved RT. udsmid supernatanten.
- Opløse celle pellet (1 x 107) i 60 µL af buffer for magnetisk celle adskillelse kit.
- Tilføj 20 µL af Fc blok til pellets og inkuberes i 10 min. ved 4 ° C.
- Tilføj 20 µL af anti-CD66b konjugeret med microbeads og inkuberes i en yderligere 10 min. ved 4 ° C.
- Vask og genopslæmmes pellets i 500 µL af MACS buffer.
- Anvende cellesuspension til en magnetisk kolonne i magnetfelt af en egnet magnetisk separator og indsamle gennemstrømnings-indeholdende CD66b(-) cellerne ved at vaske kolonnen med 15 mL buffer.
- Fjern kolonnen fra den magnetisk separator og straks skylle de magnetisk mærket CD66b(+) celler ved fast at skubbe stemplet i kolonnen.
Bemærk: CD66b(+) celle befolkning består hovedsageligt af neutrofiler som fastsat af FACS analyse som viser, at > 95% af CD66(+) fraktion er positiv for CD11b, CD15 og CD16, men negative for CD14.
- Overføre peritoneal lavage væske til en 50 mL tube.
- Generation af net
- Efter centrifugering ved 270 x g i 7 min. ved RT, genopslæmmes i isolerede LDN (5 x 106) i 1 mL af RPMI1640 med 10% FCS.
- Kultur LDN på en 6-godt poly-L-lysin belagt plade (6 cm i diameter) i 2 timer ved 37 ˚C i 5% CO2.
- Tilføj den grøn fluorescerende kontrastfarve (en membran-vandtætte farvestof at plette kernen og kromosomer) i en endelig koncentration på 5 µM.
- Straks observere morfologi af redskaber (de ekstracellulære DNA komponenter bortvist fra LDN under Fluorescens mikroskopi).
2. farvning af tumorceller med rødt fluorescerende celle Linker farvestof
- Forberede menneskelige cancer cellelinjer MKN45, NUGC og dokumenter-1.
- Vask 1 x 107 celler med PBS + 0,02% EDTA i en 15 mL rør og på 270 x g der centrifugeres i 7 min. ved RT.
- Tilsættes 1 mL af opløsning til farvning af farvning til pellets, og tilsæt forsigtigt.
- Opløses 4 µL af rødt fluorescerende celle Linker farvestof i 1 mL af opløsning til farvning og blandes med cellesuspension fra trin 2.2.
- Inkuber pellets i 4 min på RT.
- Der tilsættes 4 mL af DMEM (10% FBS) at stoppe den farvning reaktion.
- Centrifugeres 270 x g i 7 min og supernatanten.
- Gentag trin 2.6 og 2.7 to gange.
- Tjek med et fluorescens mikroskop (excitation = 551 nm, udsender = 567 nm) at tumorcellerne farves rød.
3. analyse af Tumor celle vedhæftning til redskaber
- Genopslæmmes rødt fluorescerende farves tumorceller (1 x 106) i 1 mL af RPMI 1640 suppleret med 0,1% BSA.
- Tilføje tumorcellerne til LDN kultur, der producerede redskaber som beskrevet i trin 1.3.
- Inkuber i 5 min på 37 ˚C, som gør det muligt for tumorceller at kontakte NETs.
Bemærk: Lang inkubationstid inducerer tumor celle vedhæftning til LDN eller pladerne. - Fjern mediet og brøndene vaskes forsigtigt ved at tilføje 2 mL af forvarmet medier (0,1% BSA + RPMI 1640) og hvirvlende fadet.
- Gentag proceduren vask i trin 3.4 to gange.
Bemærk: Siden net svagt tillægger pladen, vask skal ske så skånsomt som muligt for at undgå fjernelse af nettene, selv. - Tilføj den grøn fluorescerende farvestof til farvning kernen og kromosomer i en endelig koncentration på 5 µg/mL for visualisering af nettene.
- Observere nettene og knyttet tumorceller ved hjælp af passende filtre (grøn, excitation = 504 nm, udsender = 523 nm; rød, excitation = 551 nm, udsender = 567 nm).
- Flette figurer for at vise de tumorceller, der er fanget af nettene.
Bemærk: I nogle eksperimenter, DNA nedbrydning enzym blev føjet til LDN kultur (endelig koncentration på 100 U/mL) 5 min før Co inkubation i 5 min.
4. gang Lapse Video analyse af de fangne tumorceller
- Kultur de peritoneal LDN i en 35 mm runde fad belagt med poly-L-lysin som beskrevet i trin 1.3.
- Tilføj den grøn fluorescerende farvestof til farvning af kernen og kromosomer at visualisere redskaber som beskrevet i trin 1.3.
- Efter 1 min inkubation, fjerne medierne og der tilsættes 2 mL af 0,1% BSA + RPMI 1640.
- Fjern mediet og tilsæt unstained 1 x 106 MKN45 celler suspenderet i 0,1% BSA + RPMI 1640. Inkuber i 5 min på RT.
- Fjern eventuelle løstliggende tumorceller ved forsigtigt vask som beskrevet i trin 3.4 og tilføje DMEM med 10% FCS suppleret med 100 u/mL Penicillin og 100 µg/mL streptomycin.
- Montere kultur fadet i en helhed-se cellen observationssystem og vælge det relevante felt i hvilke tumor celler er fanget af nettene.
- Fortsætte med at co kultur for en yderligere 2 dage og tage løbende billeder af feltet hver 6 min under normale lys og fluorescens, der registrerer MKN45 celler og redskaber, henholdsvis.
- Indsætte billeder på hvert tidspunkt og konstruere time-lapse videoer ved hjælp af Image Viewer software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I 2-timers kultur, CD66b(+) LDN stammer fra peritoneal lavage væske viste streng strukturer farves med grønt-fluorescerende farvestof for nukleare og kromosom (figur 1B), mens CD66b(-) mononukleære celler ikke (figur 1 c). Men når LDN kulturer blev forbehandlet med 100 U/mL DNase, den karakteristiske struktur var ødelagt (fig. 1 d), der angiver, at de var sammensat af ekstracellulære DNA bortvist fra neutrofiler. Når LDN var kulturperler på plast plader uden belægning, mange NET klynger flyder i blev medier observeret, med få net på bunden (figur 1E).
Næste, for at undersøge vedhæftning af tumor cellelinjer til redskaber, MKN45 celler mærket med rødt fluorescerende farvestof blev tilføjet til redskaber og co inkuberes i 5 minutter. Efter skånsom vask, mange MKN45 celler blev fundet fastgjort (figur 2A og 2 C). Derimod få MKN45 celler knyttet når LDN var forbehandlet med DNase jeg (figur 2B og 2 C). Det flettede tal viste tydeligt, at et flertal af de vedlagte MKN45 celler var Co lokaliseret med net, set som strukturer dannet på bunden af pladen (figur 2D). Lignende vedhæftning mønstre blev observeret med dokumenter-1 og NUGC-4 (figur 2E og 2F).
Da net har vist sig at være cytotoksiske for bakterier, vi derefter undersøgt, om tumorceller fanget af NETs dør eller overleve i en løbende fælles kultur bruge time-lapse video. Interessant, mens net gradvist forsvandt i flere timer, MKN45 cellerne fanget af NETs begyndte at formere sig kraftigt bagefter (Video 1).
Figur 1: netto dannelsen efter kulturen af peritoneal LDN. (A) efter tæthed gradient centrifugering af postoperative lavage væske, celler inddrives fra de mellemliggende lag er vist. (B) derefter CD66b(+) LDN blev adskilt fra CD66b(-) mononukleære celler og kulturperler på poly-L-lysin belagt 6-godt plader, efterfulgt af nukleare farvning farvestof tilsætning og umiddelbar observation med Fluorescens mikroskopi. (C) det samme antal CD66b(-) mononukleære celler blev kulturperler på de samme betingelser. (D) The LDN éncellelag blev inkuberet med DNase jeg 5 minutter før nukleare farvning. (E) CD66b(+) LDN var kulturperler på plast plader uden belægning. Hvide søjler repræsenterer 100 µm. Dette tal blev ændret fra en tidligere publikation15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: vedhæftning af tumor celler til NETs. (A) Peritoneal LDN var kulturperler på poly-L-lysin belagt 6-godt plader til 2 h, som producerede massive net. Rød fluorescein-mærket MKN45 blev derefter tilføjet. Efter en 5-minutters inkubation, løstliggende celler blev fjernet ved skånsom vask og resterende tumorceller blev observeret under et fluorescens mikroskop. (B) før tilføjelsen af MKN45, LDN éncellelag var forbehandlet med DNase jeg i 5 min. (C) i eksperimenter (A) og (B), antallet af vedlagte MKN45 celler blev talt i 3 tilfældige felter under fluorescens mikroskop og betyde ± SD blev udtrykt. (D) efter skånsom vask, grøn fluorescerende farvestof for nukleare og kromosom blev føjet til fælles kultur. I repræsentative felter, fotos af vedlagte MKN45 og NET strukturer blev taget ved hjælp af passende optiske bølgelængde filtre, og de to tal blev sammenlagt. De samme eksperimenter udført i (D) blev også udført for dokumenter-1 (E) og NUGC-4 (F). Hvide søjler repræsenterer 100 µm. Dette tal blev ændret fra en tidligere publikation15. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: efter vedhæftning opførsel af de fangne tumorceller. LDN var kulturperler på poly-L-lysin belagt 6-godt plader for 2 timer, og netto dannelse blev bekræftet af grøn fluorescerende farvestof for nukleare og kromosom. Derefter unstained MKN45 celler blev tilføjet og co inkuberes i 5 minutter, og separate celler blev fjernet ved skånsom vask og fortsatte med at være co kulturperler i 10% FCS + DMEM. Ved hjælp af en helhed-se cellen observationssystem, blev områder hvor tumorceller blev fanget ved net søgt efter. Fotografier af feltet blev derefter taget hver 6 minutter under normale lys og fluorescens, der aktiveret klare tal af tumorceller og redskaber, henholdsvis. Endelig, billederne blev overlejret med Image Viewer software, og en tid, bortfalder video blev lavet på en 3600 x højere hastighed end real-time. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere undersøgelser har rapporteret, at cirkulerende tumorceller kan blive fanget af netto substrater i vivo10,11. Metastatisk brystkræftceller har vist sig at stimulere neutrofile og fremkalde dannelse af redskaber, som hjælper i tumorcellevækst i target organ17. Desuden fandt vi, at kortsigtede kulturer af LDN fra postoperative lavage væske produceret massive redskaber, der effektivt kunne lokke tumorceller uden yderligere stimulation15. Disse observationer tyder på en mulig rolle for mekaniske inddragelse af redskaber i forbindelse med metastatisk. De detaljerede molekylære mekanismer, der mægle klæbende interaktioner mellem net og tumorceller er imidlertid stadig uklart. Nylige undersøgelser har impliceret inddragelse af integrin i denne proces ved hjælp af NET stock isoleret fra aktiveret neutrofiler, der tjener som vedhæftning substrat12,13. Dog renset og koncentrerede net komponenter formodes for at have stort set forskellige molekylære strukturer fra original net. I sammenligning bruger vores metode intakt redskaber uden fysisk manipulation, som er en stor fordel, når den undersøger de detaljerede mekanismer af selvklæbende interaktioner med net. Med denne simple teknik, kan forskerne registrere specifikke udlæg i mange tumorceller til NETs hurtigt (inden for 5 min).
Det vigtigste element i protokollen er brugen af en poly-L-lysin belagt plade til at fastsætte de netto strukturer på bunden af pladen. Når intakt plast plader blev brugt til LDN kultur, blev kun et par net fundet i bunden. Desuden, mange grøn-positive klynger blev observeret som frit svævende i dyrkningsmedier, når de skulle have været løsrevet fra plade (fig. 1 d). Vi undersøgte også netto dannelse på plader overtrukket med kollagen, fibronektin, og laminin, som aktiveret registrering af web-lignende strukturer i det nederste lag. Men garnene syntes at tillægge substrater mindre stramt end til poly-L-lysin, og de blev let adskilt af proceduren for vask. Derfor, disse andre indstillinger er utilstrækkelig til vedhæftning assays. I virkeligheden, hvis vi bruger plader uden poly-L-lysin belægninger, kan net og eventuelle vedlagte tumorceller blive let fjernes fra pladen ved blot at tilføje medier brønde.
Den kritiske trin i vedhæftning assay er inkubationstiden for fælles kultur med tumorceller. Fem minutter er tilstrækkelig for tumorceller bindes til NETs. Under forsøgsbetingelser, når du tilføjer den løsning, der indeholder tumorceller til 6-godt pladen, gøre alle tumorceller fysisk kontakt med netto strukturer dannet i bunden af pladen. Dog dyrkning Co for en længere periode (f.eks. mere end 10 minutter) resultater i bindingen af tumorceller til LDN eller poly-L-lysin substrater. I inkubationstiden bør derfor kort til at registrere specifikke binding til NETs. Manøvrering af skånsom vask er et andet vigtigt punkt. Vi sørgede for at tilsættes langsomt varmede medierne fra sidevæg af hver godt, forsigtigt svinge pladen, og Fjern supernatanten med en betjent sug. Da net stick til pladen svagt, skal denne proces udføres i en særlig forsigtig måde.
Denne teknik understreger, at en anden molekylære mekanisme er nødvendig for tumorceller bindende til NETs inden for minutter, end at vist i en vedhæftning assay med en ~ 30-60 minutters inkubation net lagerfører12,13. Blokering eksperimenter ved hjælp af denne metode kan belyse de detaljerede molekylære mekanismer som rigtige net fælde forskellige materialer. En begrænsning af denne teknik er imidlertid at vaskeprocessen kan variere når de klæbende interaktioner forekomme mellem net og tumor celler in vivo. I de kliniske omgivelser er tætheden af tumorceller meget lavere end den, der anvendes i denne protokol, kan udgøre en anden begrænsning.
Time-lapse video analyse er meget nyttig til at overvåge resultaterne af forskellige cellulære arrangementer over en periode af dage. Ved hjælp af hele-celle Se system, vise vi at NETs er gradvist nedbrudt, formentlig af DNAse indeholdt i serum, mens MKN45 fanget af net start til at formere sig energisk derefter. Denne video viste kun division af tumorceller fastgjort til redskaber, med ingen sammenligning med MKN45 knyttet til pladen. Forurenet neutrofile og tilføjede nukleare farvning farvestoffet kan har også påvirket vækst af tumorcellerne. Derfor kunne vi ikke trække en klar konklusion om effekterne net af net på tumorcellevækst. Denne analyse indikerer dog, at tumorceller ikke er dræbt af nettene og kan faktisk overleve efter fastklemning af net.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Ms. J. Shinohara og I. Nieda for teknisk og kontorarbejde. Vi takker også, Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina og Kazuya Takahashi for deres samarbejde for prøven erhvervelse på operationsstuen. Dette arbejde blev støttet af en licensbetaling for videnskabelig forskning fra ministeriet for uddannelse, videnskab, sport, og kultur af Japan og Japan samfund til fremme af videnskab (17K 10606).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
