Summary
כאן, אנו מציגים שיטה שבה נויטרופילים אנושיים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), התאוששה נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח, לייצר מסיבית מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות), השמנה ביעילות תאים סרטניים חינם לאחר מכן לגדול.
Abstract
הפעלת נויטרופילים שחרור נויטרופילים חוץ-תאית מלכודות (רשתות), אשר יכולים ללכוד ולהשמיד חיידקים. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי רשתות מעורבים בתהליכי מחלה שונים, כגון גרורות המחלה פקקת, הגידול אוטואימוניות. כאן, אנו מראים טכניקה מפורט במבחנה לזיהוי פעילות נטו במהלך לכידה של תאים סרטניים חינם, אשר גדלים לאחר חיבור רשתות. ראשית, אספנו בצפיפות נמוכה נויטרופילים (-כעבור שנה.-) של נוזל שטיפת הצפק לאחר הניתוח בחולים שעברו laparotomies. Culturing לטווח קצר של-כעבור שנה-הביא שמצביעה נטו מסיבית היה מדמיין עם גרעיני ירוק פלורסנט, כרומוזום counterstain. לאחר דגירה שיתוף של שורות תאים סרטן קיבה אנושית MKN45, OCUM-1 ו- NUGC-4 עם הרשתות, תאים סרטניים רבים נלכדו על ידי הרשתות. כתוצאה מכך, הקובץ המצורף היה יושב לחלוטין על ידי ההשפלה של רשתות עם Time-lapse אני DNase הסרטונים גילה כי תאים סרטניים, שנלכד על ידי הרשתות לא מת, אבל במקום גדל נמרצות בתרבות רציפה. שיטות אלה ניתן להחיל את הגילוי של דבק אינטראקציות בין רשתות סוגים שונים של תאים וחומרים.
Introduction
פולימורף נויטרופילים גרעיני במחזור הדם מופרדים בדרך כלל תאי תאי דרך שיטת הכנה הדרגתיות צפיפות. עם זאת, כמה נויטרופילים הידוע בשם נויטרופילים בצפיפות נמוכה (-כעבור שנה-), עם פנוטיפים CD11b(+), CD15(+), CD16(+), CD14(-), הם מטוהרים במשותף עם תאי תאי. המספר היחסי של-כעבור שנה-מגדיל באופן משמעותי בתנאים פתולוגיים שונים, כולל מחלות אוטואימוניות1,2, אלח דם3ו-4,סרטן5. מחקרים קודמים הראו כי-כעבור שנה-מחלקה phenotypically והן מבחינה תפקודית ברורים של נויטרופילים6. יצוין, כי-כעבור שנה-במחזור הדם הם נוטים יותר לייצר מלכודות חוץ-תאית נויטרופילים (רשתות) מצפיפות נורמלי נויטרופילים2,7. הרשתות הן מבנים דמויי-אינטרנט המורכב של חומצות גרעין, שינויים היסטוניים, פרוטאזות, חלבונים פרטנית ו cytosolic, הם ביעילות במלכודת, להרוס פתוגנים8.
לאחרונה, רשתות הוכחו ללכוד לא רק חיידקים, אבל גם טסיות דם ופיזור תאים סרטניים, אשר יכולים לסייע כגון היווצרות9 וגידול גרורות10,11. עם זאת, המנגנונים המולקולריים מאחורי האינטראקציות דבק בין רשתות, טסיות דם או תאים סרטניים נמצאים עדיין לא ברור. לאחרונה, assay אדהזיה במבחנה גילה כי תאים לוקמיה מיאלואידית (K56212) ותאים קרצינומה של הריאות (A54913) לצרף רשתות באמצעות אינטגרינים β1 וβ3. המחברים השתמשו נטו מניות מבודד נויטרופילים ומופעל על ידי phorbol 12-פעילים 13-אצטט (PMA) המצע אדהזיה14. למרות assay זה מאפשר זיהוי של אינטראקציות אמיתי עם רכיבים נטו בהיעדרו של נויטרופילים, זה לנתיחה אם "התא ללא מניות נטו" מבודדת על ידי צנטריפוגה במהירות גבוהה משמרת את המבנה המולקולרי זהה רשתות המיוצר ב ויוו. לאחרונה, מצאנו את נוזל שטיפת הצפק לאחר ניתוח בבטן הכיל הרבה בוגרים-כעבור שנה-, אשר נוצר רשתות מסיבי המוצמדות לתאים הגידול גורם גרורות הצפק15. במחקר זה, בדקנו בהצלחה את הידבקות תאים סרטניים רשתות שלמות ללא כל פעולה פיזית. כאן, אנו מראים פרטים של טכניקה לגילוי דבק אינטראקציות בין רשתות תאים סרטניים חינם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
-כעבור שנה-התקבלו מחולים שהשתתפו במחקר זה ואושרו על-ידי מוסדיים סקירה לוח של jichi ב רפואה באוניברסיטה.
1. בידוד של-כעבור שנה-של חלל הבטן Lavages וזיהוי נטו
- רכישת המדגם
- להשרות 1000 מ"ל של תמיסת סטרילית ישירות לתוך חלל הבטן לפני סגירת הפצע בחולים שעברו ניתוח בטן בשל ממאירות במערכת העיכול.
הערה: דגימות התקבלו מהמטופלים שעברו ניתוח קיבה, קיצור קיבה, או esophagectomy ללא הטיה על בסיס גיל או מין. תמיסת מלח היה הועבר לתוך מיכל והוא נשפך לתוך הבטן כל. דקה אחת. זה מתבצע באופן שגרתי כמו שטיפת הצפק לאחר הניתוח ללא השפעות משמעותיות על חולים. - שטיפת חלל הבטן בהרחבה לפחות 1 דקות.
הערה: מומלץ כי הנוזל מוחדר אט-אט מנוער בידיים של המנתח כך הדגימות אחיד. - לשחזר 200 מ של נוזל שטיפה עם 4 מזרקים 50 מ.
הערה: לפעמים גומי מחבר משמש כדי לקחת את הנוזלים.
- להשרות 1000 מ"ל של תמיסת סטרילית ישירות לתוך חלל הבטן לפני סגירת הפצע בחולים שעברו ניתוח בטן בשל ממאירות במערכת העיכול.
- לבצע טיהור של הצפק-כעבור שנה-באמצעות גרנולוציט mAb ספציפי, CD66b16.
הערה: כיוון שכבת ביניים לאחר צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות מכיל תאי תאי רבים, הבחירה חיובית של נויטרופילים פולימורף באמצעות CD66b mAb בוצעה.- העברת נוזל שטיפת הצפק שפופרת 50 מ.
הערה: בשלב זה, את הנוזלים עוברים דרך מסנן ניילון 100 מיקרומטר להסיר זיהומים. - Centrifuge את הנוזל הצפק ב g x 270 במשך 7 דקות ב- RT.
- Resuspend כדורי ב 5 מ של PBS עם EDTA 0.02%.
- בזהירות כיסוי mL 5 תא השעיה על פתרון הדרגתי של צפיפות 3 מ.
- צנטריפוגה ב g x 1,700 למשך 15 דקות ב RT ללא כל מעברי.
- הקציר mL ~ 2-3 של פתרון המכיל שכבות ביניים (איור 1 א') באמצעות פיפטה ומערבבים אותו עם 10 מ"ל של PBS עם EDTA 0.02%.
- Centrifuge את הנוזל הצפק-400 g x עבור 7 דקות ב RT וזורקים את תגובת שיקוע.
- להוסיף עוד 10 מ"ל של PBS עם EDTA 0.02%, צנטריפוגה g x 270 עבור 7 דקות-RT. להשליך תגובת שיקוע.
- להמיס בגדר תא (1 x 107) 60 µL מאגר עבור ערכת ההפרדה תא מגנטי.
- להוסיף 20 µL של Fc גוש כדורי, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס.
- הוסף 20 µL של האנטי-CD66b מצומדת עם גרגרי ואת תקופת דגירה של 10 דקות נוספות ב 4 º C.
- רוחצים את מחדש להשעות את כדורי ב- 500 µL מאגר מקינטוש.
- החלת התליה תא על עמודה מגנטי בשדה המגנטי של מפריד מגנטי מתאים ולאסוף זרימה דרך המכיל CD66b(-) התאים ע י שטיפת העמודה עם 15 מ"ל של המאגר.
- הסר את העמודה במפריד מגנטי, מיד לשטוף את התאים CD66b(+) מגנטית שכותרתו בדחיפה בחוזקה על הבוכנה לתוך העמודה.
הערה: האוכלוסייה תא CD66b(+) מורכב בעיקר נויטרופילים כפי שנקבע על ידי ניתוח FACS המציין > 95% של השבר CD66(+) הם חיוביים עבור CD11b, CD15 CD16, אבל שלילי עבור CD14.
- העברת נוזל שטיפת הצפק שפופרת 50 מ.
- דור של רשתות
- לאחר צנטריפוגה-g x 270 עבור 7 דקות-RT, מחדש להשעות את-כעבור שנה-מבודד (5 x 106) ב 1 מ"ל של RPMI1640 עם 10% FCS.
- תרבות של-כעבור שנה-על הצלחת מצופה 6-ובכן פולי-L-ליזין (6 ס מ קוטר) עבור 2 h ב- 37 הלעפה תרוטרפמט 5% CO2.
- להוסיף את counterstain פלואורסצנטי ירוק (צבע ממברנה-אטום כדי להכתים את גרעין ואת כרומוזומים) הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר.
- מיד להבחין המורפולוגיה של רשתות (חוץ-תאי DNA הרכיבים שגורשו את-כעבור שנה-תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית).
2. צביעת של תאים סרטניים עם צבע מקשר תא ניאון אדום
- להכין סרטן אנושי שורות תאים MKN45, NUGC, OCUM-1.
- לשטוף את התאים7 עונה 1 פרק 10 עם PBS + EDTA 0.02% 15 מ"ל שפופרת, צנטריפוגה ב 270 x g במשך 7 דקות ב- RT.
- להוסיף 1 מ"ל של פתרון עבור צבע מכתימה את כדורי, פיפטה בעדינות.
- להמיס 4 µL של צבע מקשר תא ניאון אדום ב 1 מ"ל של פתרון עבור צביעת ומערבבים עם התליה תא מהשלב 2.2.
- דגירה כדורי במשך 4 דקות ב- RT.
- להוסיף 4 מ של DMEM (10% FBS) כדי לעצור את התגובה מוכתמים.
- צנטריפוגה g x 270 עבור 7 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.
- חזור על שלבים 2.6 ו- 2.7 פעמיים.
- בדוק עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (עירור = 551 nm, פולטות = 567 ננומטר) כי בתאי הגידול מוכתמים באדום.
3. ניתוח של גידול התא הדבקה על רשתות
- מחדש להשעות את תאי הגידול מוכתם ניאון אדום (1 x 106) ב 1 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת BSA 0.1%.
- הוסף את תאי הגידול התרבות-כעבור שנה-שהפיקה את הרשתות כפי שמתואר בשלב 1.3.
- תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 הלעפה תרוטרפמט, אשר מאפשרת לתאי הגידול ליצור קשר עם הרשתות.
הערה: זמן דגירה גורם גידול התא אדהזיה-כעבור שנה- או את הצלחות. - להסיר את המדיום ולשטוף בעדינות את הבארות על-ידי הוספת 2 מ"ל של מדיה prewarmed (BSA 0.1% + RPMI 1640), מתערבל המנה.
- חזור על הפעולות כביסה בשלב 3.4 פעמיים.
הערה: מאז רשתות בחולשה לצרף הצלחת, כביסה צריך להיעשות בעדינות ככל האפשר כדי למנוע הסרה של הרשתות עצמם. - הוסף את הפלורסנט ירוק עבור מכתימה את גרעין ואת כרומוזומים-ריכוז הסופי של 5 µg/mL עבור ויזואליזציה של הרשתות.
- לצפות את הרשתות ומחוברת תאים סרטניים באמצעות את המסננים המתאימים (ירוק, עירור = 504 nm, פולטות = 523 ננומטר; רד, עירור = 551 nm, פולטות = 567 ננומטר).
- למזג את הנתונים כדי להציג את תאי הגידול כי הם לכודים על ידי הרשתות.
הערה: כמה ניסויים, האנזים DNA השפלה נוספה התרבות-כעבור שנה-(הריכוז הסופי של 100 U/mL) 5 דקות לפני שיתוף הדגירה למשך 5 דקות.
4. זמן לשגות ניתוח וידאו של תאי הגידול לכוד
- תרבות-כעבור שנה-פריטוניאלית ב 35 מ מ עגול מאכל מצופה פולי-L-ליזין כפי שמתואר בשלב 1.3.
- הוסף את הפלורסנט ירוק עבור מכתימה את גרעין ואת כרומוזומים להמחיש רשתות כפי שמתואר בשלב 1.3.
- לאחר 1 דקות של דגירה, מסיר את המדיה ולהוסיף 2 מ"ל של BSA 0.1% + RPMI 1640.
- מסיר את המדיה ולהוסיף מוכתם עונה 1 פרק 106 MKN45 תאים הושעו ב- 0.1% BSA + RPMI 1640. תקופת דגירה של 5 דקות ב- RT.
- להסיר תאים סרטניים כעיגולים בצבע כלשהו על ידי שטיפת בעדינות כפי שמתואר בשלב 3.4 ולהוסיף DMEM עם 10% FCS בתוספת 100 u/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100.
- הר המנה תרבות במערכת תצפית נוף כל תא, בחר את השדה המתאים איזה גידול תאים לכוד על ידי הרשתות.
- ממשיכים תרבות משותפת עבור נוספים יומיים לצלם תמונות רציף של השדה בכל 6 דקות תחת תאורה רגילה וזריחה, אשר מזהה תאים MKN45 ורשתות, בהתאמה.
- להרכיב את התמונות על כל timepoint ולבנות זמן לשגות וידאו באמצעות התוכנה מציג תמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בתרבות 2 שעות CD66b(+)-כעבור שנה-נגזר מבנים מחרוזת הראה נוזל שטיפת הצפק צבעונית עם צבע ירוק-פלורסנט עבור גרעיני, כרומוזום (איור 1B), בעוד CD66b(-) תאי תאי לא (איור 1C). עם זאת, כאשר pretreated היו התרבויות-כעבור שנה-עם 100 DNase U/mL, המבנה האופייני היה נהרס (איור 1D), המציין כי הם מורכבים של דנ א חוץ-תאית, שגורשו נויטרופילים. כאשר-כעבור שנה-היו תרבותי על צלחות פלסטיק ללא ציפוי, אשכולות נטו רבים צף, נצפו מדיה עם מספר רשתות בתחתית (איור 1E).
הבא, לבחון הידבקות של הקווים תא הגידול כדי רשתות, MKN45 התאים בלוחיות הפלורסנט אדום היו שיתווספו הרשתות, שיתוף הדגירה למשך 5 דקות. לאחר כביסה עדינה, MKN45 רבים נמצאו תאים מצורף (איור 2 א ו- 2 C). לעומת זאת, כמה תאים MKN45 מצורף כאשר pretreated היו-כעבור שנה-עם DNase אני (איור 2B ו- 2 C). הדמות הממוזג הראו בבירור כי רוב התאים MKN45 מצורף היו שותף מקומי בעזרת רשתות, ראה כמבני שהוקמה על החלק התחתון של הלוח (איור דו-ממדי). אדהזיה דפוסים דומים נצפו עם OCUM-1 ו- NUGC-4 (איור 2E ו- 2F).
מאז רשתות הוכחו להיות ציטוטוקסיות חיידקים, לאחר מכן אנו בחן אם תאים סרטניים שנלכדת על-ידי רשתות למות או לשרוד בתרבות שיתוף מתמשך באמצעות צילומי הווידאו. מעניין, בעוד רשתות נעלם בהדרגה בתוך מספר שעות, לכוד, התאים MKN45 על ידי הרשתות החלו להתרבות נמרצות לאחר מכן (Video 1).
איור 1: היווצרות נטו לאחר התרבות של הצפק-כעבור שנה. (א) לאחר צפיפות צנטריפוגה הדרגתי של נוזל שטיפה לאחר הניתוח, והתאים התאוששה לשכבת ביניים מוצגים. (B) לאחר מכן, CD66b(+)-כעבור שנה-היו מופרדים מתאי תאי CD66b(-), תרבותי על לוחות 6-ובכן מצופה פולי-L-ליזין, ואחריו גרעיני תוספת צבע צביעת והתבוננות מיידית עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ. (ג) אותו מספר תאי תאי CD66b(-) היו תרבותי תחת באותם התנאים. (ד) ה-כעבור שנה-טפט, נדגרה עם DNase אני למשך חמש דקות לפני צביעת גרעינית. (E) -כעבור שנה-CD66b(+) היו תרבותי על צלחות פלסטיק ללא ציפוי. ברים לבן מייצגים 100 מיקרומטר. איור זה שונה מן הפרסום הקודם15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הדבקה של גידול תאים רשתות. (א) -כעבור שנה-פריטוניאלית היו תרבותי על פולי-L-ליזין מצופה לוחות 6-ובכן כבר שעתיים, אשר הפיק רשתות מסיבי. לאחר מכן נוספו MKN45 שאותה ניתן להתאים fluorescein אדום. לאחר דגירה כ-5 דקות, תאים כעיגולים בצבע הוסרו על ידי שטיפה עדינים, נצפו תאים סרטניים שנותרו תחת מיקרוסקופ זריחה. (B) לפני התוספת של MKN45, טפט-כעבור שנה-היה pretreated עם DNase אני עבור 5 דק (ג) בניסויים (א) ו- (B), מספר התאים MKN45 מצורף נספרו בשדות אקראי 3 תחת המיקרוסקופ פלורסצנטיות, זאת אומרת ± SD בא לידי ביטוי. (ד) לאחר כביסה עדין, ירוק הפלורסנט עבור גרעיני כרומוזום נוסף לתרבות משותפת. בשדות נציג, מבני MKN45, רשת המצורף צולמו באמצעות מסננים אופטי באורך גל המתאים, מוזגו שתי הדמויות. הניסויים זהה הופיעה (D) בוצעו גם עבור OCUM-1 (ה) ו- NUGC-4 (נ). ברים לבן מייצגים 100 מיקרומטר. איור זה שונה מן הפרסום הקודם15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
וידאו 1: התנהגות שלאחר אדהזיה לתאי הגידול לכוד. -כעבור שנה-היו תרבותי על פולי-L-ליזין מצופה לוחות 6-ובכן למשך שעתיים, ואת היווצרות נטו אושר ע י ירוק הפלורסנט עבור גרעיני, כרומוזום. לאחר מכן, תאים MKN45 וללא רבב היו הוסיף משותפת הדגירה למשך 5 דקות ואני כעיגולים בצבע תאים על ידי שטיפה עדין הבדלקינו המשיך להיות תרבותי משותף ב 10% FCS + DMEM. באמצעות מערכת תצפית נוף כל תא, אזורים שבו תאים סרטניים נלכדו על ידי רשתות היו חיפשו. תמונות של השדה ואז נלקחו כל 6 דקות תחת תאורה רגילה וזריחה, שאיפשר דמויות צלול של תאים סרטניים ורשתות, בהתאמה. לבסוף, התמונות היו נקודות המגע המוצגים בתוכנה מציג תמונה ולאחר זמן לשגות וידאו נוצר ב 3600 x מהירות גבוהה יותר מאשר בזמן אמת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקרים קודמים דיווחו כי מחזורי תאים סרטניים יכולים להיות. לכוד סובסטרטים נטו ויוו10,11. תאי סרטן שד גרורתי הוכחו לעורר נויטרופילים, זירוז היווצרות של רשתות, אשר מסייע צמיחת תאים סרטניים גידולים איבר המטרה17. בנוסף, מצאנו כי של נוזל שטיפה לאחר הניתוח לטווח קצר תרבויות של-כעבור שנה-המיוצר מסיבי ברשתות יכול ביעילות אומללותו תאים סרטניים ללא גירוי נוסף15. מקרים אלה מצביעים על תפקיד אפשרי למעורבות מכני של רשתות לתהליך גרורתי. עם זאת, המנגנונים המולקולריים מפורט המתווכות דבק אינטראקציות בין רשתות תאים סרטניים לא ברור עדיין. מחקרים שנעשו לאחרונה לסבך את מעורבותם של אינטגרין בתהליך זה באמצעות מניות נטו מבודד נויטרופילים הופעל זה לשמש אדהזיה המצע12,13. עם זאת, רכיבים רשתות מטוהרים ומרוכז אמור להיות מבנה מולקולרי שונה במידה רבה מן הרשתות המקורית. לשם השוואה, השיטה שלנו משתמשת רשתות שלמות ללא טיפול גופני, וזה יתרון חזק כאשר בחינת המנגנונים מפורט של אינטראקציות דבק עם כילות. בטכניקה פשוטה זו, החוקרים תוכל לאתר את הקובץ המצורף ספציפי של תאים סרטניים רבים כדי רשתות במהירות (תוך 5 דקות).
התכונה החשובה ביותר של הפרוטוקול הוא השימוש של צלחת מצופה פולי-L-ליזין לתקן את המבנים נטו על החלק התחתון של הלוח. כאשר לוחות פלסטיק שלם שימשו את התרבות-כעבור שנה-, רק כמה רשתות אותרו בתחתית. יתר על כן, אשכולות ירוק-חיוביים רבים נצפו בחופשיות צפים בתקשורת תרבות, כאשר הם אמור להיות מנותק מן הלוח (איור 1D). בדקנו גם את היווצרות נטו על צלחות מצופה עם קולגן, fibronectin laminin, שאיפשר את הגילוי של מבנים דמויי-אינטרנט בהשכבה התחתונה. עם זאת, הרשתות הופיע כדי לצרף סובסטרטים פחות בחוזקה כדי פולי-L-ליזין, הם היו מנותקים בקלות על-ידי הפרוצדורה כביסה. לכן, אפשרויות אחרות אלה אינם מספיקים עבור מבחני אדהזיה. למעשה, אם נשתמש צלחות ללא ציפוי פולי-L-ליזין, רשתות ותאים סרטניים המצורפת כל להפוך להסיר בקלות מהצלחת על-ידי פשוט הוספת מדיה הבארות.
השלב הקריטי וזמינותו אדהזיה היא תקופת הדגירה של תרבות משותפת עם תאים סרטניים. חמש דקות מספיקה עבור תאים סרטניים לאגד הרשתות. תחת התנאים ניסיוני, בעת הוספת הפתרון המכיל תאים סרטניים לצלחת 6-ובכן, תאים סרטניים כל ליצור מגע גופני עם המבנים נטו נוצר בחלק התחתון של הלוח. עם זאת, שיתוף culturing לתוצאות התקופה (למשל, יותר מ-10 דקות) עוד בהכריכה של תאים סרטניים-כעבור שנה-או פולי-L-ליזין סובסטרטים. לכן, זמן הדגירה צריך להיות קצר לאתר קשירה ספציפי הרשתות. תמרון של כביסה עדינה היא עוד נקודה חיונית. הקפדנו לאט להוסיף המדיה ומחוממת מן הקיר בצד של כל אחד, בעדינות להניף את הצלחת, ולהסיר את תגובת שיקוע עם העצמות. מאז רשתות מקל לצלחת חלש, תהליך זה יש לבצעו בצורה זהירה במיוחד.
טכניקה זו מדגיש את העובדה כי מנגנון מולקולרי שונה נדרש עבור תאים סרטניים איגוד רשתות בתוך דקות, מאשר באיור של assay אדהזיה עם הדגירה ~ 30-60 דקות לרשת מניות12,13. חסימת ניסויים באמצעות שיטה זו ניתן להבהיר את המנגנונים המולקולריים מפורט שבו רשתות אמיתי השמנה של חומרים שונים. אולם, מגבלה של טכניקה זו היא כי תהליך הכביסה יכול להיות שונה האינטראקציות דבק מתרחשים בין רשתות תאי הגידול בתוך vivo. בהגדרה קלינית, הצפיפות של תאים סרטניים הוא הרבה יותר נמוך מזה בשימוש פרוטוקול זה, אשר עשוי להציג מגבלה אחרת.
ניתוח וידאו זמן לשגות הוא שימושי מאוד עבור ניטור התוצאות של הסלולר אירועים שונים על פני תקופה של ימים. באמצעות מערכת תצוגה תאים שלמים, אנו מראים כי רשתות הן בהדרגה נפגמים, ככל הנראה בשל DNAse הכלול סרום, ואילו MKN45 לכודים על ידי רשתות להתחיל להתרבות נמרצות לאחר מכן. וידאו זה רק הראה חלוקת תאים סרטניים המצורפת רשתות, עם אין השוואה כדי MKN45 מחובר לצלחת. נויטרופילים מזוהמים, לצבוע מכתימים גרעיני נוסף עשוי גם השפיעו את הצמיחה של תאים סרטניים. לכן, אנחנו לא יכולתי לשלוף מסקנה ברורה לגבי ההשפעות נטו של רשתות על צמיחת תאים סרטניים. עם זאת, ניתוח זה מצביעים על כך תאים סרטניים על ידי הרשתות למעשה יכול לשרוד לאחר מלכודת על ידי רשתות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים גברת ג'יי שינוהרה, אני Nieda על עבודה טכנית, קלריקלי. כמו כן, אנו מודים ד"ר שירו מאצומוטו, Hidenori Haruta, Kurashina קנטארו ו Kazuya טקהאשי על שיתוף הפעולה שלהם עבור רכישת המדגם בחדר ניתוח. עבודה זו נתמכה על ידי מענק הסיוע למחקר מדעי של משרד החינוך, המדע, הספורט, ואת התרבות של יפן והחברה יפן הקידום של המדע (17K 10606).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
