Summary
Aquí, presentamos un método en el que neutrófilos baja densidad humanos (LDN), recuperados del líquido de lavado peritoneal postoperatorio, producen enormes trampas extracelulares neutrófilos (redes) y atrapan eficientemente las células tumorales libres que posteriormente crecen.
Abstract
Activa neutrófilos liberación neutrófilo extracelular trampas (redes), que pueden capturar y destruir microbios. Estudios recientes sugieren que las redes están implicadas en varios procesos de enfermedad como autoinmune enfermedad, trombosis y tumor metástasis. A continuación, os mostramos una técnica detallada en vitro para detectar actividad de red durante la captura de las células tumorales libres, que crecen después de la conexión a redes. En primer lugar, se recopilaron neutrófilos de baja densidad (LDN) de líquido de lavado peritoneal postoperatorio de pacientes sometidos a laparotomies. Cultivo a corto plazo de LDN dio lugar a la masiva formación neta que fue visualizada y contratinción cromosoma nuclear verde fluorescente. Después de la incubación conjunta de líneas celulares de cáncer gástrico humano MKN45, OCUM-1 y NUGC-4 con las redes, muchas células del tumor fueron atrapadas por las redes. Posteriormente, el accesorio completamente fue abrogado por la degradación de las redes con DNasa I. Time-lapse video reveló que no murió atrapadas por las redes de las células del tumor pero en su lugar crecieron vigorosamente en un cultivo continuo. Estos métodos pueden ser aplicados a la detección de interacciones adhesivas entre redes y varios tipos de células y materiales.
Introduction
Neutrófilos nucleares polimorfo en la sangre circulante se separan típicamente de células mononucleares a través del método de preparación de gradiente de densidad. Sin embargo, algunos neutrófilos conocidas como baja densidad neutrófilos (LDN), con fenotipos de CD11b(+), CD15(+), CD16(+) y CD14(-), son co purificados con las células mononucleares. El número relativo de LDN aumenta significativamente en varias condiciones patológicas incluyendo enfermedades autoinmunes1,2, sepsis3y cáncer4,5. Estudios previos han demostrado que LDN son una clase fenotípicamente y funcionalmente distinta de neutrófilos6. Cabe señalar que LDN en la sangre circulante son más propensos a producir neutrófilos trampas extracelulares (redes) de densidad normal neutrófilos2,7. Redes son como estructuras compuestas de ácidos nucleicos, las histonas, proteasas y proteínas citosólicas y granulares, y eficientemente pueden atrapar y destruir patógenos8.
Recientemente, las redes se han demostrado para capturar no sólo microbios, pero también las plaquetas y circulación de las células del tumor que pueden ayudar en trombo formación9 y tumor metástasis10,11. Sin embargo, los mecanismos moleculares detrás de las interacciones adhesivas entre las redes y las plaquetas o células tumorales aún no están claros. Más recientemente, un ensayo de adherencia en vitro reveló que las células de la leucemia mieloide (K56212) y células de carcinoma de pulmón (A54913) conexión a redes de las integrinas β1 y β3. Los autores utilizaron neto stock aislado de neutrófilos y activado por forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) de la adherencia sustrato14. Aunque este ensayo permite la detección de interacciones reales con componentes netos en la ausencia de neutrófilos, es discutible si la "célula libre stock neto" aislado por centrifugación de alta velocidad mantiene la estructura molecular idéntica a las redes producidas en vivo. Recientemente, encontramos del líquido de lavado peritoneal después de cirugía abdominal contiene muchos maduros LDN, que generó enormes redes y conectados a las células del tumor que causa metástasis peritoneal15. En este estudio, se examinó con éxito la adhesión de las células del tumor a redes intactas sin ninguna manipulación física. A continuación, os mostramos detalles de una técnica para detectar las interacciones adhesivas entre redes y células tumorales libres.
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Protocol
LDN se obtuvieron de pacientes incluidos en este estudio y fueron aprobados por el institucional de Junta de Jichi Universidad médica.
1. aislamiento de LDN de lavados de la cavidad Abdominal y de detección de red
- Adquisición de la muestra
- Infunda 1.000 mL de solución salina estéril en la cavidad abdominal antes del cierre de la herida en pacientes sometidos a cirugía abdominal debido a malignidad gastrointestinal.
Nota: Las muestras se obtuvieron de pacientes que se sometieron a una gastrectomía, colectomía o esofagectomía sin prejuicios basados en edad y sexo. Solución salina fue transferida a un recipiente y vierte en el abdomen entero dentro de un minuto. Esto habitualmente se realiza un lavado peritoneal postoperatorio sin efectos significativos en los pacientes. - Lavado de la cavidad abdominal extensivamente durante al menos 1 minuto.
Nota: Se recomienda que el líquido infundido se revuelve lentamente con las manos del cirujano para que las muestras son uniformes. - Recuperar 200 mL del líquido de lavado con cuatro jeringas de 50 mL.
Nota: A veces se usa un conector de goma para tomar los líquidos.
- Infunda 1.000 mL de solución salina estéril en la cavidad abdominal antes del cierre de la herida en pacientes sometidos a cirugía abdominal debido a malignidad gastrointestinal.
- Realizar la purificación de la LDN peritoneal con mAb específico de granulocitos, CD66b16.
Nota: Dado que la capa intermedia después de la centrifugación de gradiente de densidad contiene muchas células mononucleares, selección positiva de neutrófilos polimorfo con CD66b mAb fue realizada.- Transferir el líquido de lavado peritoneal a un tubo de 50 mL.
Nota: En este paso, pasar los fluidos a través de un filtro de nylon μm 100 para quitar impurezas. - Centrifugar el líquido peritoneal a 270 x g por 7 min a TA.
- Resuspender el pellet en 5 mL de PBS con EDTA 0,02%.
- Recubrimiento con cuidado 5 mL de la suspensión celular en una solución de gradiente de densidad de 3 mL.
- Centrifugue a 1.700 x g durante 15 min a temperatura ambiente sin ningún roturas.
- Cosecha el ~ 2-3 mL de solución que contiene las capas intermedias (figura 1A) utilizando una pipeta y mezclar con 10 mL de PBS con EDTA 0,02%.
- Centrifugar el líquido peritoneal a 400 x g por 7 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.
- Agregar otros 10 mL de PBS con EDTA 0,02% y centrifugar a 270 x g por 7 min en RT. descartar el sobrenadante.
- Disolver el precipitado de células (1 x 107) en 60 μL de buffer para el kit de separación magnética de células.
- Añadir 20 μl del bloque Fc a las pelotillas e incubar 10 min a 4 ° C.
- Añadir 20 μl de anti-CD66b conjugado con microesferas e incube un adicional 10 min a 4 ° C.
- Lave y vuelva a suspender los pellets en 500 μl de tampón de MACS.
- La suspensión de células se aplican a una columna magnética en el campo magnético de un separador magnético conveniente y recoger el fluir por el células de CD66b(-) que contiene por la columna con 15 mL de tampón de lavado.
- Retire el separador magnético de la columna y eliminar inmediatamente las células CD66b(+) magnéticamente etiquetadas empujando firmemente el émbolo en la columna.
Nota: La población de células CD66b(+) consiste principalmente en neutrófilos según lo determinado por análisis FACS indicando que > 95% de la fracción CD66(+) son positivas para CD16, CD11b y CD15, pero negativas para CD14.
- Transferir el líquido de lavado peritoneal a un tubo de 50 mL.
- Generación de redes
- Después de la centrifugación a 270 x g por 7 min a temperatura ambiente, volver a suspender la LDN aislado (5 x 106) en 1 mL de RPMI1640 con 10% FCS.
- Cultura de la LDN en una placa recubierta bien 6 poly-L-lisina (6 cm de diámetro) por 2 h a 37 ° c en 5% CO2.
- Añadir el contraste fluorescente verde (un membrana impermeable tinte para teñir el núcleo y cromosomas) en la concentración final de 5 μm.
- Inmediatamente observe la morfología de redes (el extracelulares componentes de DNA de la LDN en microscopía de fluorescencia).
2. tinción de las células del Tumor con el tinte de vinculador de célula fluorescente rojo
- Preparar el cáncer humano líneas celulares MKN45, NUGC y OCUM-1.
- Lavan 1 x 107 células con PBS + EDTA 0,02% en un tubo de 15 mL y centrifugar a 270 x g por 7 min a TA.
- Añadir 1 mL de solución para el tinte de coloración a las pelotillas y pipetee suavemente.
- Disolver 4 μL de colorante de rojo fluorescente de la célula vinculador en 1 mL de solución para tinción y mezclar con la suspensión de células en el paso 2.2.
- Incubar los pellets durante 4 min a TA.
- Añadir 4 mL de DMEM (10% FBS) para detener la reacción de tinción.
- Centrifugar 270 x g por 7 min y descarte el sobrenadante.
- Repita los pasos del 2.6 y 2.7 dos veces.
- Consulte con un microscopio de fluorescencia (excitación = 551 nm, emisión = 567 nm) que las células del tumor se tiñen de rojo.
3. análisis del Tumor Cell adhesión a las redes
- Resuspenda las células del tumor tinción fluorescente roja (1 x 106) en 1 mL de RPMI 1640 suplementado con 0,1% de BSA.
- Añadir las células del tumor a la cultura LDN que producen las redes tal como se describe en el paso 1.3.
- Incubar por 5 min a 37 ° c, que permite a las células del tumor a las redes de contacto.
Nota: Incubación induce la adhesión de células de tumor LDN o las placas. - Quite el medio y lave suavemente los pocillos añadiendo 2 mL de medio precalentado (0.1% de BSA + RPMI 1640) y girando el plato.
- Repetir dos veces el procedimiento de lavado en el paso 3.4.
Nota: Desde redes débil fije a la placa, el lavado debe hacerse lo más suavemente posible para evitar la eliminación de las redes ellos mismos. - Añadir el colorante fluorescente verde para la tinción del núcleo y los cromosomas en una concentración final de 5 μg/mL para la visualización de las redes.
- Observar las redes y une las células del tumor con los filtros adecuados (verde, excitación = 504 nm, emisión = 523 nm; rojo, excitación = 551 nm, emisión = 567 nm).
- Combinar las figuras para mostrar las células del tumor que son atrapadas por las redes.
Nota: En algunos experimentos, enzima de degradación de ADN fue agregado a la cultura LDN (concentración final de 100 U/mL) 5 min antes de la incubación durante 5 minutos.
4. tiempo transcurrido Video análisis de las células tumorales atrapados
- Cultura la LDN peritoneal en un 35 mm ronda plato recubierto con poli-l-lisina como se describe en el paso 1.3.
- Añadir el colorante fluorescente verde para la tinción del núcleo y los cromosomas para visualizar redes tal como se describe en el paso 1.3.
- Después de 1 min de incubación, retirar los medios de comunicación y añadir 2 mL de 0.1% de BSA + RPMI 1640.
- Retirar los medios de comunicación y añadir células sin manchas de 1 x 106 MKN45 suspendieron en 0.1% de BSA + RPMI 1640. Incubar por 5 min a TA.
- Retirar todas las células del tumor lavando suavemente como se describe en el paso 3.4 y agregar DMEM con 10% FCS suplementado con 100 u/mL penicilina y 100 μg/mL estreptomicina.
- Montar la placa de cultivo en un sistema de observación de célula entera vista y seleccione el campo apropiado en cual tumor las células son atrapadas por las redes.
- Continuar conjuntamente la cultura por otros 2 días y tomar fotos continuas del campo cada 6 minutos bajo luz normal y la fluorescencia, que detecta las células MKN45 y redes, respectivamente.
- Superponer imágenes en cada punto y construir vídeos Time-lapse utilizando el software de visor de imágenes.
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Representative Results
En la cultura de 2 horas, LDN CD66b(+) derivado de las estructuras de cadena mostró líquido de lavado peritoneal teñido con tinte verde fluorescente para nuclear y cromosoma (figura 1B), mientras CD66b(-) no las células mononucleares (figura 1). Sin embargo, cuando las culturas LDN fueron pretratadas con 100 U/mL la ADNasa, la estructura característica fue destruida (figura 1), indicando que fueron compuestos de ADN extracelular de neutrófilos. Cuando LDN fueron cultivadas en placas de plástico sin capa, muchos grupos red flotando en los medios de comunicación fueron observados, con pocas redes en la parte inferior (Figura 1E).
A continuación, para examinar la adhesión de las líneas celulares de tumor a las redes, células de MKN45 marcadas con colorante fluorescente rojo eran añadidas a las redes y co se incuba durante 5 minutos. Después de lavado suave, muchos MKN45 se encontraron células Unido (figura 2A y 2C). En cambio, algunas células de MKN45 Unido cuando LDN fueron pretratados con DNasa I (figura 2B y 2C). La figura combinada mostró claramente que la mayoría de las células de MKN45 adjuntadas fueron localizadas junto con las redes, como estructuras formadas en la parte inferior de la placa (Figura 2D). Patrones de adherencia similares se observaron con la OCUM-1 y NUGC-4 (Figura 2E y 2F).
Puesto que las redes han demostrado ser citotóxicos a las bacterias, que luego examina si las células tumorales atrapados mueren redes o sobrevivir en una cultura Co continua usando Time-lapse video. Curiosamente, mientras que redes desaparecieron gradualmente dentro de varias horas, las células MKN45 atrapados por redes que empezaron a proliferar vigorosamente luego (Video 1).
Figura 1: red formación después de la cultura de LDN peritoneal. (A) después de la centrifugación de gradiente de densidad del líquido de lavado postoperatorio, se muestran las células de la capa intermedia. (B) entonces, LDN CD66b(+) fueron separados de células mononucleares CD66b(-) y cultivadas en placas cubiertas de pozo de 6 poly-L-lisina, seguidas de la adición de colorante tinción nuclear y la inmediata observación con microscopía de fluorescencia. (C) el mismo número de células mononucleares CD66b(-) fueron cultivado en las mismas condiciones. (D) capa monomolecular de la LDN se incubó con DNasa I durante 5 minutos antes de la tinción nuclear. (E) CD66b(+) LDN fueron cultivadas en placas de plástico sin recubrimiento. Barras blancas representan 100 μm. Esta figura fue modificada de una anterior publicación15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: adherencia del tumor de las células a las redes. (A) LDN Peritoneal fueron cultivadas en placas de 6 bien cubiertas poly-L-lisina por 2 h, que produjo enormes redes. Luego se agregaron MKN45 rojo marcado con fluoresceína. Después de una incubación de 5 minutos, las células fueron removidas por lavado suave, y las células restantes del tumor se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. (B) antes de la adición de MKN45, la monocapa LDN fue pretratada con DNasa por 5 min (C) en los experimentos (A) y (B), el número de células de MKN45 adjuntos donde conté en 3 campos al azar bajo el microscopio de fluorescencia y promedio ± SD fue expresado. (D) después de lavado suave, verde colorante fluorescente para nuclear y cromosoma fue agregado a la cultura de cooperación. En campos representativos, fotos de las estructuras MKN45 y red adjuntadas fueron tomadas usando filtros de longitud de onda óptica adecuada, y combinaron a las dos figuras. También se realizaron los mismos experimentos llevados a cabo en (D) de OCUM-1 (E) y NUGC-4 (F). Barras blancas representan 100 μm. Esta figura fue modificada de una anterior publicación15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video 1: comportamiento de la adherencia de las células tumorales atrapados. LDN fueron cultivadas en placas de 6 pozos cubiertas de poli-l-lisina durante 2 horas, y formación de neto fue confirmada por el tinte fluorescente verde para nuclear y cromosoma. A continuación, células sin manchas de MKN45 se agregó y co se incubaron durante 5 minutos y las células fueron por lavado suave y continuadas para ser cultivadas conjuntamente en el 10% FCS + DMEM. Utiliza un sistema de observación de toda visión celular, áreas donde las células del tumor fueron atrapadas por las redes se ha buscado. Fotografías del campo fueron llevados cada 6 minutos bajo luz normal y la fluorescencia, que permitió cifras claras de las células del tumor y de redes, respectivamente. Finalmente, las imágenes se superponen con el software visor de imágenes y un video de lapso de tiempo fue creado en una mayor velocidad de 3600 x que en tiempo real. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
Estudios previos han reportado que circulan las células del tumor puede quedar atrapado por sustratos NET en vivo10,11. Las células de cáncer de mama metastásico han demostrado para estimular neutrófilos e inducir la formación de redes, que ayuda en el crecimiento de células tumorales en el órgano blanco del17. Además, se encontró que las culturas a corto plazo de LDN de líquido de lavado postoperatorio producción redes masivas que podrían atrapar eficientemente las células del tumor sin más estimulación15. Estas observaciones sugieren un papel posible de participación mecánica de redes en el proceso metastásico. Sin embargo, los mecanismos moleculares detallados que median las interacciones adhesivas entre las redes y las células del tumor sigue siendo confuso. Estudios recientes han implicado la participación de integrina en este proceso a través del uso de red acción aislada de neutrófilos activados que sirven como la adherencia sustrato12,13. Sin embargo, componentes de redes purificados y concentrados se suponen que en gran medida diferentes estructuras moleculares de las redes originales. En comparación, nuestro método utiliza redes intactas sin manipulación física, que es una gran ventaja al examinar los mecanismos detallados de interacciones adhesivas con redes. Con esta sencilla técnica, los investigadores pueden detectar el accesorio específico de muchas células del tumor a las redes rápidamente (dentro de 5 min).
La característica más importante del protocolo es el uso de una placa recubierto de poli-l-lisina para fijar las estructuras de las red en la parte inferior de la placa. Cuando intactas placas plásticas fueron utilizadas para el cultivo LDN, sólo unas pocas redes fueron detectadas en la parte inferior. Además, se observaron muchos racimos verde positivo como flotando libremente en los medios de cultivo, cuando debería haber sido separados de la placa (figura 1). También examinamos la red formación en placas recubiertas con colágeno, fibronectina y laminina, que permitió la detección de estructuras web en la capa inferior. Sin embargo, las redes aparecieron fijar a los sustratos menos firmemente a poly-L-lisina, y eran fácilmente separadas por el procedimiento de lavado. Por lo tanto, estas otras opciones no son suficientes para los ensayos de adherencia. De hecho, si usamos las placas sin revestimientos poly-L-lisina, redes y todas las células del tumor adjunto pueden ser quitar fácilmente de la placa añadiendo simplemente los medios de comunicación a los pozos.
El paso crítico en el ensayo de adherencia es el período de incubación de la cultura junto con las células del tumor. Cinco minutos es suficiente para las células del tumor enlazar a las redes. Bajo las condiciones experimentales, al agregar la solución que contiene las células del tumor a la placa de la pozo 6, todas las células del tumor hacen contacto físico con las red estructuras formadas en la parte inferior de la placa. Sin embargo, co-cultivo para resultados de un largo período (por ejemplo, más de 10 minutos) en la Unión de las células del tumor a LDN o sustratos de poli-l-lisina. Por lo tanto, el tiempo de incubación debe ser corto para detectar la unión específica a las redes. La maniobra de lavado suave es otro punto esencial. Nos aseguramos que poco a poco añadir la prensa caliente de la pared lateral de cada uno, suavemente la placa del oscilación y retirar el sobrenadante con un aspirador. Puesto que las redes se pegan a la placa de débil, este proceso debe realizarse de una manera especial cuidada.
Esta técnica destaca que un diverso mecanismo molecular es necesario para enlazar a las redes dentro de minutos, que las células del tumor que se muestra en un ensayo de adherencia con una incubación de 30-60 minutos a red existencias12,13. Experimentos con este método de bloqueo puede dilucidar los mecanismos moleculares detallados en que redes real trampa de varios materiales. Sin embargo, una limitación de esta técnica es que el proceso de lavado puede variar cuando se producen las interacciones adhesivas entre las redes y de las células del tumor in vivo. En el ajuste clínico, la densidad de las células tumorales es muy inferior a la utilizada en el presente Protocolo, que puede presentar otra limitación.
Análisis de vídeo Time-lapse es altamente útil para el seguimiento de los resultados de varios eventos celulares durante un período de días. Usando el sistema de célula entera vista, mostramos que redes son progresivamente degradadas, presumiblemente por DNasa contenida en suero, mientras que MKN45 atrapado por principio de redes a proliferan vigorosamente después de eso. Este video solo mostraba la división de las células tumorales conectados a redes, con la no comparación a MKN45 conectada a la placa. Neutrófilos contaminados y el agregado colorante tinción nuclear pueden también han afectado el crecimiento de las células del tumor. Por lo tanto, no nos podríamos sacar una conclusión definitiva con respecto a los efectos de la red de redes en el crecimiento de células tumorales. Sin embargo, este análisis indican que las células del tumor no son matadas por las redes y de hecho pueden sobrevivir tras la captura por redes.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos a la Sra. J. Shinohara e I. Nieda para trabajo técnico y administrativo. También, agradecemos a los Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina y Kazuya Takahashi por su colaboración para la adquisición de la muestra en sala de operaciones. Este trabajo fue apoyado por una subvenciones para la investigación científica desde el Ministerio de educación, ciencia, deportes y cultura de Japón y la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (17K 10606).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
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