Summary
Nous présentons ici une méthode dans laquelle neutrophiles humains de faible densités (LDN), récupérés du liquide de lavage péritonéal postopératoire, produisent massives pièges extracellulaires neutrophiles (filets) et efficacement emprisonnent quelques cellules tumorales gratuit qui poussent par la suite.
Abstract
Activé des neutrophiles libération neutrophiles extracellulaire pièges (filets), qui peuvent capturer et détruire les microbes. Des études récentes suggèrent que les filets sont impliqués dans divers processus morbides, comme auto-immunes métastases maladie, thrombose et la tumeur. Ici, nous montrons une technique détaillée in vitro pour détecter les activités NET durant le piégeage des cellules tumorales libre, ce qui poussent après fixation de filets. Tout d’abord, nous avons recueilli des neutrophiles faible densité (LDN) du liquide de lavage péritonéal postopératoire des patients qui ont subi les laparotomies. Culture à court terme de la LDN a entraîné formation nette massive qui a été visualisée avec nucléaire vert fluorescent et contre-colorant chromosome. Après incubation Co de lignées cellulaires de cancer de l’estomac humain MKN45, IC-1 et NUGC-4 avec les filets, nombreuses cellules tumorales ont été piégés par les filets. Par la suite, la pièce jointe a été complètement abrogée par la dégradation des filets avec la DNase I. décomposée vidéo a révélé que les cellules tumorales, pris au piège par les NETs ne sont pas mort mais a grandi au contraire vigoureusement dans une culture continue. Ces méthodes peuvent être appliquées à la détection des interactions adhésives entre les filets et les différents types de cellules et de matériaux.
Introduction
Neutrophiles nucléaires polymorphe dans le sang circulant sont généralement séparés de cellules mononucléaires via la méthode de préparation de gradient de densité. Toutefois, certains neutrophiles appelés neutrophiles faible densités (LDN), avec des phénotypes CD11b(+), CD15(+), CD16(+) et CD14(-), sont conjointement purifiées avec des cellules mononucléaires. Le nombre relatif de LDN augmente de manière significative dans diverses conditions pathologiques, y compris les maladies auto-immunes1,2, septicémie3et cancer4,5. Des études antérieures ont montré que LDN constituent une classe phénotypiquement et fonctionnellement distincte de neutrophiles6. Il est à noter que LDN dans le sang circulant sont plus susceptibles de produire des pièges extracellulaires neutrophiles (filets) que la densité normale neutrophiles2,7. Les filets sont des structures de toile d’araignée composés d’acides nucléiques, histones, protéases et protéines granulaires et cytosoliques, et ils peuvent efficacement piéger et détruire les agents pathogènes8.
Récemment, les filets ont démontré pour capturer non seulement les microbes, mais aussi les plaquettes et circulation de cellules tumorales qui peuvent aider à thrombus formation9 et tumeur métastases10,11. Cependant, les mécanismes moléculaires interactions adhésives entre les filets et les plaquettes ou les cellules tumorales sont encore peu claires. Plus récemment, un essai d’adhérence in vitro ont révélé que les cellules de la leucémie myéloïde (K56212) et de cellules de carcinome du poumon (A54913) attachent à filets via les intégrines β1 et β3. Les auteurs ont utilisé le stock NET isolés des neutrophiles et activé par phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) comme l’adhérence substrat14. Bien que ce test permet de détecter des interactions réelles avec composantes nettes en l’absence des neutrophiles, on peut affirmer si la « acellulaire stock NET » isolé par centrifugation à haute vitesse est toujours la structure moléculaire identique à filets produits dans vivo. Récemment, nous avons trouvé ce liquide de lavage péritonéal après que chirurgie abdominale contenait de nombreux LDN mature, qui généré des filets massives et attachés aux cellules tumorales causant des métastases péritonéales,15. Dans cette étude, nous avons examiné avec succès l’adhérence des cellules tumorales aux filets intacts sans aucune manipulation physique. Ici, nous montrons les détails d’une technique pour détecter des interactions adhésives entre les filets et les cellules tumorales gratuit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LDN provenaient de patients recrutés pour cette étude et ont été approuvées par les institutionnels Review Board de Jichi Medical University.
1. isolement de la LDN de Lavages de la cavité abdominale et détection NET
- Acquisition de l’échantillon
- Infuser 1 000 mL de sérum physiologique stérile directement dans la cavité abdominale avant de refermer les plaies chez les patients ayant subi une chirurgie abdominale due à une tumeur maligne gastro-intestinale.
NOTE : Échantillons provenaient de patients qui ont subi une gastrectomie, une colectomie ou OESOPHAGECTOMIE sans préjugé fondé sur l’âge ou le sexe. Une solution saline a été transférée dans un récipient et versée dans l’abdomen entier dans la minute. Ceci est habituellement exécuté comme un lavage péritonéal postopératoire sans effets significatifs sur les patients. - Lavage de la cavité abdominale durant au moins 1 minute.
Remarque : Il est recommandé que le liquide perfusé est agité doucement avec les mains du chirurgien afin que les échantillons soient uniformes. - Récupérer 200 mL de liquide de lavage avec quatre seringues de 50 mL.
NOTE : Parfois un raccord en caoutchouc est utilisé pour absorber les liquides.
- Infuser 1 000 mL de sérum physiologique stérile directement dans la cavité abdominale avant de refermer les plaies chez les patients ayant subi une chirurgie abdominale due à une tumeur maligne gastro-intestinale.
- Accomplissent la purification du LDN péritonéale à l’aide de granulocytes spécifiques mAb, CD66b16.
Remarque : Étant donné que la couche intermédiaire après centrifugation en gradient de densité contient beaucoup de cellules mononucléées, sélection positive des neutrophiles polymorphe à l’aide de CD66b mAb a été réalisée.- Transférer le liquide de lavage péritonéal dans un tube de 50 mL.
Remarque : Dans cette étape, passer les fluides par un filtre de nylon 100 µm pour éliminer les impuretés. - Centrifuger le liquide péritonéal à 270 g pendant 7 min à température ambiante.
- Remettre en suspension les pellets dans 5 mL de PBS avec EDTA de 0,02 %.
- Soigneusement superposer les 5 mL de suspension cellulaire sur une solution de gradient de densité 3 mL.
- Centrifuger à 1 700 x g pendant 15 min à ta sans les pauses.
- Récolter le ~ 2-3 mL de solution contenant les couches intermédiaires (Figure 1 a) à l’aide d’une pipette et mélangez-le avec 10 mL de PBS avec EDTA de 0,02 %.
- Centrifuger le liquide péritonéal à 400 g pendant 7 min à ta et éliminer le surnageant.
- Ajouter un autre 10 mL de PBS avec 0,02 % EDTA et centrifuger à 270 x g pendant 7 min à RT. jeter le surnageant.
- Dissoudre le culot cellulaire (1 × 10-7) en 60 µL de tampon pour le kit de séparation cellule magnétique.
- Ajouter 20 µL du bloc Fc dans les granules et incuber pendant 10 min à 4 ° C.
- Ajouter 20 µL de l’anti-CD66b conjugué avec microbilles et incuber pendant une supplémentaire de 10 min à 4 ° C.
- Laver et remettre en suspension les pellets dans 500 µL de tampon de MACS.
- Appliquer la suspension cellulaire à une colonne magnétique du champ magnétique d’un séparateur magnétique approprié et de recueillir les intermédiaires contenant CD66b(-) des cellules de la colonne avec 15 mL de tampon de lavage.
- Retirer la colonne du séparateur magnétique et rincer immédiatement les cellules CD66b(+) magnétiquement étiquetées en appuyant fermement sur le piston dans la colonne.
Remarque : La population de cellules CD66b(+) se compose principalement des neutrophiles, tel que déterminé par analyse de FACS indiquant que > 95 % de la fraction CD66(+) sont positives pour CD11b CD15 et CD16, mais négatives pour CD14.
- Transférer le liquide de lavage péritonéal dans un tube de 50 mL.
- Génération des filets
- Après centrifugation à 270 g pendant 7 min à ta, remettre en suspension la LDN isolée (5 x 106) dans 1 mL de RPMI1640 avec 10 % FCS.
- Culture de la LDN sur une plaque enduite de 6 puits poly-L-lysine (6 cm de diamètre) pendant 2 h à 37 ° c à 5 % de CO2.
- Ajouter le contre-colorant fluorescent vert (un membrane imperméable au colorant pour colorer le noyau et les chromosomes) à la concentration finale de 5 µM.
- Immédiatement, observer la morphologie des filets (les composantes ADN extracellulaires expulsés de la LDN en microscopie de fluorescence).
2. la coloration des cellules tumorales avec cellule fluorescente rouge Linker Dye
- Préparer le cancer chez l’humain des lignées de cellules MKN45, NUGC et IC-1.
- Laver 1 x 107 cellules avec PBS + 0,02 % et d’EDTA dans un tube de 15 mL et centrifuger à 270 x g pendant 7 min à température ambiante.
- Ajouter 1 mL de solution de colorant, coloration pour les pellets et Pipeter doucement.
- Dissoudre 4 µL de colorant rouge Fluorescent cellule Linker dans 1 mL de solution de coloration et mélanger avec la suspension de cellules de l’étape 2.2.
- Incuber les boulettes pendant 4 min à température ambiante.
- Ajouter 4 mL de DMEM (10 % FBS) pour arrêter la réaction de coloration.
- Centrifuger 270 x g pendant 7 min et éliminer le surnageant.
- Répétez les étapes 2.6 et 2.7 deux fois.
- Vérifier avec un microscope à fluorescence (excitation = 551 nm, émettant = 567 nm) que les cellules tumorales sont colorés de rouge.
3. analyse de l’adhésion cellulaire tumorale aux filets
- Remettre en suspension les cellules de tumeur tachée fluorescent rouge (1 x 10-6) dans 1 mL de milieu RPMI 1640 additionné de 0,1 % de BSA.
- Ajouter les cellules tumorales à la culture de la LDN qui produit les filets tel que décrit à l’étape 1.3.
- Incuber pendant 5 min à 37 ° c, ce qui permet aux cellules tumorales de contacter les filets.
Remarque : D’incubation longue induit adhérence de cellules tumorales à LDN ou aux plaques. - Enlever le support et laver délicatement les puits en ajoutant 2 mL de médias préchauffée (0,1 % de BSA + RPMI 1640) et en agitant le plat.
- Répéter la procédure de nettoyage à l’étape 3.4 deux fois.
NOTE : Depuis les filets faiblement fixer sur la plaque, le lavage se fasse aussi doucement que possible pour éviter la suppression des filets eux-mêmes. - Ajouter le colorant fluorescent vert pour colorer le noyau et les chromosomes à une concentration finale de 5 µg/mL pour la visualisation des filets.
- Observer les filets et attaché en utilisant les filtres appropriés des cellules tumorales (verte, excitation = 504 nm, émettant = 523 nm ; rouge, excitation = 551 nm, émettant = 567 nm).
- Fusionner les chiffres pour montrer les cellules tumorales qui sont piégés par les filets.
NOTE : Dans certaines expériences, enzyme de dégradation de l’ADN a été ajoutée à la culture de la LDN (concentration finale de 100 U/mL) 5 min avant incubation co pendant 5 min.
4. time Lapse analyse vidéo des cellules tumorales piégés
- Culture la LDN péritonéale dans un 35 mm rond plat recouvert de poly-L-lysine, tel que décrit à l’étape 1.3.
- Ajouter le colorant fluorescent vert pour colorer le noyau et les chromosomes de visualiser les filets tel que décrit à l’étape 1.3.
- Après 1 min d’incubation, retirez le support et ajouter 2 mL de 0,1 % de BSA + RPMI 1640.
- Retirez le support et ajouter sans coloration 1 x 106 MKN45 cellules en suspension dans 0,1 % BSA + RPMI 1640. Incuber 5 min à température ambiante.
- Supprimez toutes les cellules tumorales seules en lavant doucement comme indiqué au point 3.4 et DMEM avec 10 % de FCS additionné de 100 u/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine.
- Monter la boîte de Petri dans un système d’observation de vue ensemble cellule, puis sélectionnez le champ approprié dans les tumeurs des cellules sont pris au piège par les filets.
- Continuer de co-culture pendant encore 2 jours et prendre des photos continues du champ toutes les 6 minutes sous une lumière normale et la fluorescence, qui permet de détecter les cellules MKN45 et filets, respectivement.
- Superposer les images à chaque validant et construire des vidéos time-lapse utilisant le logiciel Image Viewer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dans la culture de 2 heures, LDN CD66b(+) dérivées de structures fluide chaîne montraient lavage péritonéal teinté avec un colorant fluorescent vert pour nucléaire et chromosome (Figure 1 b), tout en CD66b(-) les cellules mononucléaires n’ont pas (Figure 1). Toutefois, lorsque les cultures LDN prétraités avec 100 U/mL DNase I, la structure a été détruite (Figure 1), indiquant qu’ils étaient composés d’ADN extracellulaire expulsé de neutrophiles. Lorsque LDN ont été cultivés sur des plaques en plastique sans revêtement, nombreuses grappes NET flottant dans les médias ont été observés, avec quelques filets sur le fond (Figure 1E).
Ensuite, afin d’examiner l’adhésion des lignées cellulaires tumorales à filets, cellules MKN45 étiquetés avec un colorant fluorescent rouge furent ajoutés aux NETs et co incubés pendant 5 minutes. Après le lavage doux, MKN45 nombreuses cellules trouvées attaché (Figure 2 a et 2C). En revanche, peu de cellules MKN45 attaché quand LDN prétraités avec la DNase I (Figure 2 b et 2C). La figure fusionnée a clairement montré que la majorité des cellules MKN45 ci-joint ont été conjointement localisée avec des filets, considérés comme des structures formées sur le bas de la plaque (Figure 2D). Des tendances similaires d’adhérence ont été observés avec IC-1 et NUGC-4 (Figure 2E et 2F).
Étant donné que les filets ont démontré être cytotoxiques pour les bactéries, nous ensuite examiné si les cellules tumorales piégé par die filets ou survivre dans une culture mixte continue en utilisant la vidéo Time-lapse. Fait intéressant, alors que les filets ont disparu progressivement en quelques heures, les cellules MKN45 piégé par filets ont commencé à proliférer vigoureusement par la suite (vidéo 1).
Figure 1 : formation nette après la culture du LDN péritonéale. (A) après centrifugation en gradient de densité du liquide de lavage postopératoire, les cellules de la couche intermédiaire sont indiqués. (B) ensuite, CD66b(+) LDN étaient séparés des cellules mononucléaires CD66b(-) et cultivé sur des plaques 6 puits enduits poly-L-lysine, suivis par addition de colorant coloration nucléaire et l’observation immédiate avec la microscopie de fluorescence. (C) le même nombre de cellules mononucléaires CD66b(-) est cultivé dans les mêmes conditions. (D) monocouche de la LDN est incubé avec la DNase I pendant 5 minutes avant la coloration des noyaux. (E) CD66b(+) LDN ont été cultivés sur des plaques en plastique sans revêtement. Les barres blanches représentent 100 µm. Ce chiffre a été modifié depuis une précédente publication15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : adhérence de la tumeur des cellules aux filets. (A) LDN péritonéale ont été cultivés sur des plaques de 6 puits enduits poly-L-lysine pendant 2 h, ce qui produit d’énormes filets. S’ajoutèrent ensuite rouge marqué à la fluorescéine MKN45. Après une incubation de 5 minutes, seules les cellules ont été éliminés par lavage doux, et les cellules tumorales restantes ont été observés sous un microscope à fluorescence. (B) avant l’ajout de MKN45, la monocouche LDN a été prétraitée avec la DNase j’ai pendant 5 min (C) au cours d’expériences (A) et (B), le nombre de cellules MKN45 attachées ont été comptés dans 3 champs aléatoires sous le microscope de fluorescence et moyenne ± SD a été exprimé. (D) après le lavage doux, vert colorant fluorescent pour nucléaire et chromosome a été ajouté à la co-culture. Dans les domaines représentatifs, photos de joint MKN45 et NET des structures ont été prises à l’aide de filtres de longueur d’onde optique appropriée, et les deux personnages ont été fusionnés. Les mêmes expériences effectuées en (ré) ont aussi été réalisées pour IC-1 (E) et NUGC-4 (F). Les barres blanches représentent 100 µm. Ce chiffre a été modifié depuis une précédente publication15. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : adhérence après comportement des cellules tumorales piégés. LDN ont été cultivés sur plaques 6 puits revêtus de poly-L-lysine pendant 2 heures et formation nette a été confirmée par un colorant fluorescent vert pour nucléaire et chromosome. Puis, sans coloration de cellules MKN45 furent ajoutés et co incubés pendant 5 minutes, et seules les cellules étaient éliminés par lavage doux et a continué à être cultivées conjointement 10 % FCS + DMEM. En utilisant un système d’observation de cellules ensemble-vue, les zones où les cellules tumorales ont été piégés par des filets ont été cherchés. Photographies du champ ont été prises puis toutes les 6 minutes sous une lumière normale et la fluorescence, qui a permis des chiffres clairs de cellules tumorales et filets, respectivement. Enfin, les images ont été superposées avec logiciel de visualisation d’Image et une vidéo de laps de temps a été créé à une vitesse supérieure de 3600 x qu’en temps réel. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Des études antérieures ont signalé que les cellules tumorales circulantes peut être piégé par des substrats NET en vivo10,,11. Les cellules de cancer du sein métastatique ont été démontrés pour stimuler des neutrophiles et induisent la formation des filets, qui contribue à la croissance des cellules tumorales dans les organes de cible17. En outre, nous avons constaté que les cultures à court terme de LDN de liquide de lavage postopératoire produisent filets massives que pourraient piéger efficacement les cellules tumorales sans autre stimulation15. Ces observations suggèrent un rôle possible pour l’implication mécanique des filets dans le processus métastatique. Cependant, les mécanismes moléculaires détaillés qui médient interactions adhésives entre les filets et les cellules tumorales est encore incertain. Des études récentes ont mis en cause l’implication des intégrines dans ce processus par le biais de stock NET isolée de neutrophiles activés qui servent l’adhérence substrat12,13. Toutefois, les composants de filets purifiés et concentrés sont censés pour avoir largement différentes structures moléculaires des filets originales. En comparaison, notre méthode utilise des filets intacts sans manipulation physique, qui est un solide avantage lorsqu’on examine les mécanismes détaillés des interactions adhésives avec des filets. Avec cette technique simple, les chercheurs peuvent détecter l’attachement spécifique de nombreuses cellules tumorales aux filets rapidement (en moins de 5 min).
La caractéristique la plus importante du protocole est l’utilisation d’une plaque de revêtement poly-L-lysine pour fixer les structures nettes sur le bas de la plaque. Lorsque des plaques de plastique intacts ont été utilisés pour la culture de la LDN, seulement quelques filets ont été détectés au fond. En outre, nombreuses grappes vert-positifs ont été observés comme flottant librement dans les milieux de culture, quand ils auraient dû être détachées de la plaque (Figure 1). Nous avons aussi examiné la formation nette sur des plaques recouvertes de collagène, fibronectine et laminine, qui a permis la détection de structures de toile d’araignée dans la couche inférieure. Toutefois, les filets semblent attacher aux substrats moins étroitement à la poly-L-lysine, et ils ont été facilement enlevés par la procédure de nettoyage. Par conséquent, ces autres options ne suffisent pas pour les tests d’adhérence. En fait, si nous utilisons des plaques sans revêtement poly-L-lysine, filets et des cellules de tumeur ci-joint peuvent devenir facilement retirés de la plaque en ajoutant simplement des médias dans les puits.
L’étape critique dans la détermination de l’adhérence est la période d’incubation de la co-culture avec les cellules tumorales. Cinq minutes est suffisante pour que les cellules tumorales à se lier aux NETs. Dans les conditions expérimentales, lors de l’ajout de la solution contenant les cellules tumorales à la plaque 6 puits, toutes les cellules tumorales a établir un contact physique avec les structures nettes formées au bas de la plaque. Cependant, co-culture pour obtenir les résultats une plus longue période (par exemple, plus de 10 minutes) dans la fixation des cellules tumorales à LDN ou substrats de la poly-L-lysine. Par conséquent, le temps d’incubation doit être court pour détecter une fixation spécifique aux NETs. La manœuvre de lavages doux est un autre point essentiel. Nous avons pris soin d’ajouter lentement les médias chauffés de la paroi latérale de chaque bien, doucement pivoter la plaque et éliminer le surnageant avec dispositif d’aspiration. Étant donné que les filets se collent à la plaque faiblement, ce processus doit être effectué d’une manière particulièrement prudente.
Cette technique met en évidence le fait qu’un mécanisme moléculaire différent est nécessaire pour la liaison à filets quelques minutes, que les cellules tumorales que montré lors d’un essai d’adhérence avec une incubation d’environ 30 à 60 minutes au NET les stocks de12,13. Expériences à l’aide de cette méthode de blocage peut élucider les mécanismes moléculaires détaillés dans lesquels filets véritables piègent divers matériaux. Toutefois, une limitation de cette technique est que le processus de lavage peut différer lorsque l’adhésives interactions se produisent entre les filets et de cellules tumorales in vivo. Dans le contexte clinique, la densité des cellules tumorales est beaucoup plus faible que celle utilisée dans le présent protocole, qui peut-être présenter une autre limite.
Analyse vidéo Time-lapse est très utile pour le suivi des résultats des différents événements cellulaires sur une période de jours. En utilisant le système d’affichage de la cellule entière, nous montrons que filets sont progressivement dégradées, vraisemblablement par la DNAse contenue dans le sérum, tandis que MKN45 piégé par début de filets à proliférer vigoureusement par la suite. Cette vidéo ne montre que la division des cellules tumorales attaché aux filets, avec aucune comparaison à MKN45 fixé à la plaque. Neutrophiles contaminés et la teinture coloration nucléaire supplémentaire peuvent ont également affecté la croissance des cellules tumorales. Donc, nous ne pourrions pas tirer une conclusion définitive concernant les effets nets des filets sur la croissance des cellules tumorales. Toutefois, cette analyse indique que les cellules tumorales ne sont pas tués par les filets et peuvent en effet survivre après provocation par des filets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions Mme J. Shinohara et I. Steve de travail technique et clérical. Aussi, nous remercions les Drs Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina et Kazuya Takahashi pour leur coopération pour acquisition d’échantillon en salle d’opération. Ce travail a été soutenu par une subvention pour la recherche scientifique du ministère de l’éducation, Science, Sports et Culture du Japon et la société japonaise pour la Promotion de la Science (17K 10606).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
