Summary
Burada, postoperatif peritoneal lavaj sıvı, kurtarılan insan düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), büyük nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) üretmek ve verimli bir şekilde daha sonra grow ücretsiz tümör hücreleri tuzak bir yöntem mevcut.
Abstract
Hangi yakalayabilir ve mikroplar yok nötrofil yayın nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar), aktif. Son yıllarda yapılan çalışmalarda NETs, otoimmün hastalığı, kan pıhtılaşması ve tümör Metastazlari gibi çeşitli hastalık süreçlerini katılmaktadırlar öneririz. İşte, bindirme ağları için ek sonra büyümek ücretsiz tümör hücrelerinin sırasında NET faaliyet algılamak için detaylı vitro tekniği göstermektedir. İlk olarak, biz düşük yoğunluklu nötrofil (LDN) laparotomies yapılan hastaların postoperatif peritoneal lavaj sıvı toplanan. Kısa vadeli LDN kültür yeşil floresan nükleer ve kromozom counterstain ile görüntülenmiştir büyük NET oluşumu sonuçlandı. Sonra eş kuluçka insan mide kanseri hücre hatların MKN45, OCUM-1 NUGC-4 ağları ile birçok tümör hücreleri ağlar tarafından kapana kısıldın. Daha sonra ek tamamen DNaz ı. Time-lapse video ağları tarafından tuzağa tümör hücreleri ölmek ortaya ağlar bozulması tarafından kaldırıldı ama bunun yerine şiddetle sürekli bir kültürde büyüdüm. Bu yöntemler ağlar ve hücreleri ve materyaller çeşitli yapışkanlı Hofstede tespiti için uygulanabilir.
Introduction
Polimorf nükleer nötrofiller kan dolaşan içinde genelde yoğunluk gradient hazırlama yöntemi mononükleer hücreler ayrılır. Ancak, bazı nötrofil düşük yoğunluklu nötrofil (LDN), CD11b(+), CD15(+), CD16(+) ve CD14(-) fenotipleri ile bilinen mononükleer hücreler ile birlikte saf. LDN göreli sayısı otoimmün hastalıklar1,2, sepsis3ve kanser4,5de dahil olmak üzere çeşitli patolojik koşullarında önemli ölçüde artırır. Önceki çalışmalarda LDN nötrofil6phenotypically ve işlevsel olarak ayrı bir sınıf olduğunu göstermiştir. Bu unutulmamalıdır ki kan dolaşan içinde LDN nötrofil hücre dışı tuzakları (ağlar) normal yoğunluk nötrofil2,7' den üretmek olasılığı vardır. Ağlar nükleik asitler, histon, proteaz ve taneli ve sitozolik protein oluşan web benzeri yapılar, ve verimli bir şekilde tuzağa ve patojenler8yok.
Son zamanlarda, NETs sadece mikroplar, ama aynı zamanda trombosit ve dolaşan trombus olgusu oluşumu9 ve tümör Metastazlari10,11' yardımcı olabilir tümör hücreleri yakalamak için gösterilmiştir. Ancak, ağlar ve trombosit veya tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimler arkasında moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. Son zamanlarda, bir vitro yapışma tahlil myeloid lösemi hücreleri (K56212) ve Akciğer Karsinomu Hücre (A54913) ağlar için β1 ve β3 integrinler yolu ile atamanız da ortaya koydu. Yazarlar nötrofil izole ve phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) olarak yapışma substrat14tarafından aktive NET stok kullanılır. Bu tahlil NET bileşenleri ile gerçek etkileşim tespiti nötrofil yokluğunda sağlar, "hücre-ücretsiz NET hisse senedi" ile yüksek hızlı Santrifüjü izole moleküler yapısı içinde üretilen Nets aynı olup olmadığı korur tartışılabilir olsa da Vivo. Son zamanlarda, sonra karın ameliyatı büyük ağlar oluşturulan ve periton Metastazlari15neden tümör hücrelere bağlı olan birçok olgun LDN bulunan peritoneal lavaj sıvıyı bulduk. Bu çalışmada, başarılı bir şekilde herhangi bir fiziksel manipülasyon olmadan sağlam Nets tümör hücrelerinin yapışma inceledi. İşte, ağlar ve ücretsiz tümör hücreleri arasındaki yapışkan etkileşimler algılamak için bir teknik ayrıntılarını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LDN Bu çalışmada kayıtlı hastalardan elde edilmiştir ve kurumsal İnceleme Kurulu, Jichi tıbbi üniversite tarafından kabul edildi.
1. yalıtım LDN karın boşluğu Lavages ve NET algılama
- Örnek alma
- 1000 mL normal steril serum doğrudan gastrointestinal malignite nedeniyle karın ameliyatı geçiren hastalarda yara kapatma önce karın boşluğu içine süzülür.
Not: Örnekleri gastrektomi, kolektomi veya yaşında yaş veya cinsiyet dayalı önyargı olmadan yapılan hastalarda elde edilmiştir. Serum fizyolojik bir konteyner içine transfer ve bir dakika içinde tüm karın dökülür. Bu rutin bir ameliyat sonrası periton yıkama hasta üzerinde önemli etkisi olmadan olarak gerçekleştirilir. - Lavaj en az 1 dk. için kapsamlı bir şekilde karın boşluğu.
Not: Bu örnekleri tek tip olması infüzyon sıvı yavaş yavaş cerrahın elleri ile karıştırılır tavsiye edilir. - Lavaj sıvı dört 50 mL şırınga ile 200 mL kurtarmak.
Not: Bazen bir lastik bağlayıcı sıvılar çekmek için kullanılır.
- 1000 mL normal steril serum doğrudan gastrointestinal malignite nedeniyle karın ameliyatı geçiren hastalarda yara kapatma önce karın boşluğu içine süzülür.
- Arıtma periton LDN granülosit belirli mAb, CD66b16kullanarak gerçekleştirin.
Not: yoğunluk gradient Santrifüjü sonra ara katman birçok mononükleer hücreler içerdiğinden, polimorf nötrofil CD66b mAb kullanma olumlu seçimi gerçekleştirildi.- Peritoneal lavaj sıvı bir 50 mL tüp aktarın.
Not: Bu adımda, sıvılar kirleri çıkarmak için bir 100 µm naylon filtreden geçmek. - 270 x g 7 dk RT. az için peritoneal sıvı santrifüj kapasitesi
- Granül PBS %0.02 EDTA ile 5 ml resuspend.
- Dikkatli bir şekilde hücre süspansiyon 3 mL yoğunluk gradient çözüm üzerinde 5 mL yerleşimi.
- 1.700 x g RT, 15dk sınırlarında olmadan için santrifüj kapasitesi.
- Bir pipet kullanarak ara Katmanlar (Şekil 1A) içeren çözüm ~ 2-3 mL hasat ve PBS %0.02 EDTA ile 10 mL ile karıştırın.
- RT, 7 dk 400 x g, peritoneal sıvı santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
- PBS %0.02 EDTA ve santrifüj ile başka bir 10 mL 270 x g RT. atma süpernatant 7 dakika için ekleyin.
- Hücre Pelet (1 x 107) arabelleği için manyetik hücre ayrılık teçhizat 60 µL geçiyoruz.
- Fc blok 20 µL için granül ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
- Anti-CD66b 20 µL lastikteki ile Birleşik ve ek bir 10 min 4 ° C'de için kuluçkaya ekleyin
- Yıkama ve granül MAC'ler arabellek 500 µL içinde yeniden askıya alma.
- Hücre süspansiyon uygun manyetik ayırıcı manyetik alan manyetik bir sütun için geçerli ve sütun arabellek 15 mL ile yıkayarak akışı aracılığıyla içeren CD66b(-) hücreleri toplamak.
- Sütun manyetik ayırıcıyı kaldırmak ve hemen sıkıca sütuna pistonu iterek manyetik olarak etiketli CD66b(+) hücreleri floş.
Not: CD66b(+) hücre nüfus çoğunlukla nötrofil gösteren FACS analiz tarafından belirlenen oluşur > CD66(+) kesir % 95'i CD11b, CD15 ve CD16 olumlu ama CD14 için negatif.
- Peritoneal lavaj sıvı bir 50 mL tüp aktarın.
- Nesil ağlar
- 270 x g RT, 7 dk de aralıklarla sonra izole LDN yeniden askıya alma (5 x 106) RPMI1640% 10 FCS ile 1 ml.
- LDN tabakta 6-şey poli-L-lizin kaplı (6 cm çapında) %5 CO237 ˚C 2 h için kültür.
- Yeşil flüoresan counterstain (çekirdek ve kromozomlar leke geçirmez membran bir boya) 5 mikron son konsantrasyonu ekleyin.
- Hemen ağlar (LDN floresans mikroskobu altında ihraç ekstraselüler DNA bileşenleri) morfoloji gözlemlemek.
2. tümör hücreleri kırmızı floresan hücre bağlayıcı boya boyama
- İnsan kanser hücre hatları MKN45, NUGC ve OCUM-1 hazırlayın.
- 1 x 107 hücreleri PBS + 15 mL tüp ve 270 x g, santrifüj RT. 7 min için %0,02 EDTA ile yıkayın
- Çözüm için granül boyama boya için 1 mL ekleyin ve hafifçe pipet.
- Kırmızı floresan hücre bağlayıcı boya boyama için çözüm 1 ml 4 µL dağıtılması ve hücre süspansiyon adım 2.2 ile karıştırın.
- Granül RT., 4 dk için kuluçkaya
- DMEM 4 mL ekleyin (% 10 FBS) boyama reaksiyonu durdurmak için.
- 270 x g 7 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
- 2.6 ve 2.7 adımları iki kez tekrarlayın.
- Kontrol floresan mikroskop (uyarma 551 = nm, yayan 567 = nm) tümör hücreleri kırmızı lekeli.
3. tümör hücre adezyon Nets Analizi
- RPMI % 0.1 BSA ile desteklenmiş 1640 1 ml kırmızı floresan lekeli tümör hücreleri (1 x 106) yeniden askıya alma.
- 1.3. adımda açıklandığı gibi ağlar üretilen LDN kültür tümör hücreleri ekleyin.
- NETs başvurmanız tümör hücreleri sağlar 37 ˚C, 5 min için kuluçkaya.
Not: Uzun bir kuluçka tümör hücre adezyon LDN veya plakaları neden olmaktadır. - Orta kaldır ve yavaşça kuyuları prewarmed medya (% 0,1 BSA + RPMI 1640) 2 mL ekleme ve çanak dönen yıkayın.
- Adım 3.4 çamaşır yordamda iki kez tekrarlayın.
Not: Beri ağları zayıf plakasına eklemek, çamaşır temizleme ağlarının kendilerini önlemek için mümkün olduğunca yavaşça yapılmalıdır. - Çekirdeği ve kromozom 5 µg/mL NETs görselleştirme için son bir konsantrasyon, boyama için yeşil flüoresan boya ekleyin.
- NETs gözlemlemek ve tümör hücreleri uygun filtreleri kullanarak bağlı (yeşil, uyarma 504 = nm, yayan 523 = nm; kırmızı, uyarma 551 = nm, yayan 567 = nm).
- Ağlar tarafından tuzağa tümör hücreleri göstermek için rakamlar birleştirme.
Not: Bazı deneylerde DNA bozulması enzim 5 dk önce 5 min için ortak kuluçka LDN Kültür (son konsantrasyon 100 U/mL) eklenmiştir.
4. zaman atlamalı Video analiz kapana kısılmış tümör hücrelerinin
- Kültür bir 35 mm periton LDN çanak poli-L-lizin 1.3 adımda anlatıldığı gibi ile kaplı yuvarlak.
- Çekirdeği ve kromozomlar 1.3 adımda anlatıldığı gibi ağlar görselleştirmek için boyama için yeşil flüoresan boya ekleyin.
- 1 dk, kuluçka sonra medyayı çıkarın ve 2 mL % 0,1 BSA + RPMI 1640 ekleyin.
- Medyayı çıkarın ve günahı 1 x 106 MKN45 hücreleri % 0,1 askıya BSA + RPMI 1640 ekleyin. Dik, 5 min için kuluçkaya
- 3.4. adımda açıklandığı gibi yavaşça yıkayarak herhangi bir bekâr tümör hücreleri kaldırın ve DMEM 100 u/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ile % 10 FCS ile ekleyin.
- Kültür çanak bir bütün-görünümü hücresi gözlem sistemi monte ve hangi tümör hücreleri ağlar tarafından tuzak vardır uygun alanı seçin.
- Bir ek 2 gün ortak kültür ve her 6 dk normal ışık ve MKN45 hücreleri ve ağlar, sırasıyla algılar floresans altında alanın sürekli fotoğraf çekmek devam edin.
- Görüntüleri her timepoint, üst üste ve hızlandırılmış videoları Image Viewer yazılımı kullanarak oluşturur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2 saatlik kültüründe CD66b(+) peritoneal lavaj sıvı gösterdi dize yapılardan türetilmiş LDN lekeli yeşil-floresan boya için nükleer ve kromozom (Şekil 1B), mononükleer hücreler vermedi CD66b(-) ise (Şekil 1 c). LDN kültürleri ile ön işleme Ancak, 100 U/mL DNaz olduğumu karakteristik yapısı (Şekil 1 d), yok ekstraselüler DNA nötrofil ihraç oluşan olduklarını gösteren. LDN kültürlü zaman plastik tabaklar üzerinde kaplama, yüzen çok NET kümeleri olmadan (Şekil 1E) altta birkaç ağları ile medya gözlenmiştir.
Ardından, yapışma Nets tümör hücresi satırlarının incelemek için MKN45 hücreleri floresan kırmızı boya ile etiketli ağlar için eklendi ve işbirliği için 5 dakika inkübe. Nazik yıkandıktan sonra birçok MKN45 hücreleri bulundu (Şekil 2A ve 2 C) bağlı. Buna ek olarak, kaç MKN45 hücre ne zaman bağlı LDN ön işleme DNaz ile ı (Şekil 2B ve 2 C). Birleştirilmiş şekil açıkça ekli MKN45 hücreleri çoğunluğu plaka (Şekil 2B) dibinde oluşan yapılar olarak görülen ağları ile birlikte yerelleştirilmiş olduğunu gösterdi. Benzer yapışma modeller OCUM-1 ve NUGC-4 (Şekil 2E ve 2F) ile tespit edildi.
Bu yana ağlar için bakteri sitotoksik olduğu gösterilmiştir, sonra tümör hücreleri tarafından ağlar die tuzağa incelenmiştir veya sürekli bir ortak kültür hızlandırılmış video kullanarak hayatta. İlginçtir, ağlar, yavaş yavaş birkaç saat içinde kayboldu iken, MKN45 hücreleri tuzağa ağlar tarafından şiddetle daha sonra çoğalırlar başladı (Video 1).
Şekil 1: NET oluşumu periton LDN kültür sonra. (A) sonra yoğunluğu degrade Santrifüjü ameliyat sonrası lavaj sıvı orta katmandan kurtarılan hücreleri gösterilir. (B) sonra CD66b(+) LDN CD66b(-) mononükleer hücreler ayrılmış ve ardından nükleer boyama boya ek ve floresan mikroskobu ile acil gözlem poli-L-lizin kaplı 6-şey plakaları kültürlü. (C) CD66b(-) mononükleer hücreler aynı sayıda aynı koşullar altında kültürlü. (D) LDN monolayer inkübe DNaz ile ben nükleer boyama önce 5 dakika. (E) CD66b(+) LDN kaplama olmadan plastik plakalar üzerinde kültürlü. Beyaz çubuklar 100 µm gösterir. Bu rakam bir önceki yayın15güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: yapışma tümör hücreleri için ağlar. (A) periton LDN poli-L-lizin kaplı 6-şey plakaları için 2 h, büyük ağlar üretilen kültürlü. Kırmızı floresein etiketli MKN45 sonra ilave edilmiştir. Sonra bir 5 dakika kuluçka ekli olmayan hücreleri tarafından nazik çamaşır çıkarıldı ve kalan tümör hücreleri floresan mikroskop altında gözlendi. (B) MKN45 toplamadan önce LDN monolayer deneylerde (A) ve (B), bağlı MKN45 hücre sayısı 5 dk. (C) saymıştım floresan mikroskop altında 3 rasgele alanlardaki DNaz ile ön işleme ve Demek ± SD ifade edildi. (D) floresan boya için nazik yıkandıktan sonra yeşil nükleer ve kromozom ortak kültür eklendi. Temsilcisi alanlardaki fotoğrafları ekli MKN45 ve NET yapıları uygun optik dalga boyu filtreleri kullanarak çekilmiştir ve iki figür birleştirildi. (D) içinde gerçekleştirilen aynı deneyler de OCUM-1 (E) ve NUGC-4 (F)için yapıldı. Beyaz çubuklar 100 µm gösterir. Bu rakam bir önceki yayın15güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Video 1: kapana kısılmış tümör hücreleri sonrası yapışma davranışını. LDN 2 saat boyunca poli-L-lizin kaplı 6-şey tabaklarda kültürlü ve NET oluşumu olduğunu doğruladı tarafından yeşil flüoresan boya için nükleer ve kromozom. O zaman, günahı MKN45 hücreleri eklendi ve işbirliği için 5 dakika inkübe ve ekli olmayan hücreleri tarafından nazik çamaşır kaldırıldı ve % 10'luk Co kültürlü için devam etti FCS + DMEM. Bir bütün-görünümü hücresi gözlem sistemi kullanarak, nerede tümör hücreleri ağlar tarafından kapana kısıldın alanlar için arama. Fotoğraf alanının ardından 6 dakikada normal ışık ve tümör hücreleri ve ağlar, net rakamlar sırasıyla etkin floresans altında alınmıştır. Son olarak, görüntüleri Image Viewer yazılımı ile üst üste ve bir zaman atlamalı video 3600 x daha yüksek hızda daha gerçek zamanlı oluşturuldu. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önceki çalışmalarda tümör hücreleri dolaşan NET yüzeylerde vivo içinde10,11tarafından kapana olduğunu bildirdi. Metastatik meme kanseri hücrelerinin nötrofil uyarmak ve hangi tümör hücre büyümesini hedef organ17yardımcı olur ağlar, oluşumu teşvik gösterilmiştir. Buna ek olarak, biz kısa vadeli kültürleri LDN ameliyat sonrası lavaj sıvı üzerinden verimli bir şekilde tümör hücreleri daha fazla stimülasyon15olmadan tuzağa büyük ağlar üretilen bulundu. Bu gözlemler için ağlar mekanik katılımı metastatik sürecinde olası bir rol öneririz. Ancak, yapışkanlı etkileşimleri ağlar ve tümör hücreleri arasında arabuluculuk detaylı moleküler mekanizmaları hala belirsiz. Son yıllarda yapılan çalışmalarda integrin NET hisse senedi yapışma substrat12,13hizmet harekete geçirmek nötrofil dan izole aracılığıyla bu süreçte katılımı karıştığı. Ancak, saflaştırılmış ve konsantre ağları bileşenleri özgün ağlar üzerinden büyük ölçüde farklı moleküler yapıları vardır gerekiyordu. Buna karşılık, bizim Yöntem ağları ile yapıştırıcı etkileşimleri ayrıntılı mekanizmaları incelerken güçlü bir avantajdır fiziksel manipülasyon olmadan olduğu gibi ağlar kullanır. Bu basit tekniği ile araştırmacılar birçok tümör hücreleri hızlı bir şekilde (5 dk) içinde belirli ek Nets algılayabilir.
Protokolü'nün en önemli özelliği NET yapıları kalenin dibinde düzeltmek için bir poli-L-lizin boyalı tabak kullanımıdır. Sağlam plastik tabaklar LDN kültür için kullanıldığında yalnızca birkaç ağlar altındaki tespit edildi. Ayrıca, birçok yeşil-pozitif kümeleri plaka (Şekil 1 d) müstakil olmalıydılar zaman serbestçe kültür medyada yüzen olarak tespit edildi. Ayrıca kolajen, fibronektin ve laminin, alt tabaka web benzeri yapılar algılama etkinleştirilmiş ile kaplı plakalar üzerinde NET oluşumu inceledi. Ancak, NETs yüzeylerde daha az sıkı daha poli-L-lizin takmak için ortaya çıktı ve onlar kolayca çamaşır yordam tarafından kesildi. Bu nedenle, bu diğer seçenekler yapışma deneyleri için yetersiz kalmaktadır. Biz tabak poli-L-lizin kaplamalar olmadan kullanırsanız, aslında, ağlar ve herhangi bir ekli tümör hücreleri kolayca plaka wells için medya ekleyerek olmak-ebilmek çıkarmak.
Kritik yapışma tahlil tümör hücreleri ile ortak kültür kuluçka süresi adımdır. Tümör hücreleri için ağları bağlamak için yeterli beş dakika var. Deneysel koşullarda, tümör hücreleri 6-şey plaka içeren çözüm eklerken, tüm tümör hücreleri kalenin dibinde oluşan NET yapıları ile fiziksel temas yapmak. Ancak, tümör hücreleri LDN veya poli-L-lizin yüzeylerde bağlamada daha uzun bir dönemi (Örneğin, 10 dakikadan uzun) sonuçları için ortak kültür. Bu nedenle, kuluçka süresi Nets özel bağlayıcı algılamak için kısa olmalıdır. Nazik yıkamak için manevra başka bir temel noktasıdır. Yavaş yavaş ısıtılan ortamın her yan duvar, yavaşça plaka salıncak ve süpernatant bir aspiratör ile kaldırmak eklemek için emin yaptık. NETs plakasına zayıf sopa, bu işlem özellikle dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekiyor.
Bu teknik bir yapışma tahlil ~ 30-60 dakika kuluçka ile NET için gösterilen12,13stokları farklı bir moleküler mekanizma daha birkaç dakika içinde ağlar için bağlama tümör hücreleri için gereklidir gerçeği vurgulamaktadır. Bu yöntemi kullanarak deneyler engelleme gerçek ağlar çeşitli malzemeler tuzak detaylı moleküler mekanizmaları aydınlatmak. Ancak, bir bu teknik yapışkanlı etkileşim ağları ve tümör hücreleri içinde vivoarasında gerçekleştiğinde yıkama işlemi farklı olabilir kısıtlamasıdır. Klinik ortamda tümör hücreleri yoğunluğu başka sınırlama takdim edebilir miyim bu protokol için kullanılandan çok daha düşüktür.
Hızlandırılmış video bir gün boyunca çeşitli hücresel olaylar sonuçlarını izlemek için son derece yararlı analizidir. Bütün hücre görünümü sistemiyle, NETs yavaş yavaş, muhtemelen MKN45 şiddetle bundan sonra çoğalırlar ağlar başlangıç tarafından tuzağa ise serum içinde yer alan DNaz tarafından bozulmuş olduğunu göster. Bu video sadece ağlar için hiçbir karşılaştırma için plaka bağlı MKN45 ile bağlı tümör hücrelerinin bölünmesi gösterdi. Kirlenmiş nötrofil ve eklenen nükleer boyama boya tümör hücrelerinin büyümesini de etkilemiş olabilir. Bu nedenle, biz net etkileri ile ilgili tümör hücre büyüme üzerinde kesin bir sonuca ağlarının çizebilirim değil. Ancak, bu analiz tümör hücreleri tarafından ağlar öldü değil ve hatta tuzak ağlar tarafından takip yaşayabilir olduğunu göstermez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bayan J. Shinohara ve ı. Nieda teknik ve idari personel çalışma için teşekkür ederiz. Ayrıca, biz Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina ve Kazuya Takahashi ameliyathane örnek edinme için işbirliği için teşekkür ederiz. Bu eser bir Grant-in-Aid tarafından Milli Eğitim Bakanlığı, bilim, spor ve kültür Japonya ve Japonya Derneği bilimsel araştırma bilim promosyon (17 K 10606) için destek verdi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
