Summary
Här presenterar vi en metod där mänskliga låg densitet neutrofiler (LDN), återhämtat sig från postoperativ peritoneal lavage vätska, producerar massiva neutrofila extracellulära fällor (nät) och effektivt fälla gratis tumörceller som därefter växer.
Abstract
Aktiverade neutrofiler release neutrofila extracellulära fällor (nät), som kan fånga och förstöra mikrober. Nygjorda studier föreslår att nät är inblandade i olika sjukdomsprocesser, såsom autoimmuna sjukdom, trombos och tumör metastaser. Här visar vi en detaljerad i vitro -teknik för att upptäcka NET aktivitet under fångst av gratis tumörceller, som växer efter fastsättning nät. Först samlade vi låg densitet neutrofiler (LDN) från postoperativ peritoneal lavage vätska från patienter som genomgick laparotomies. Kortsiktiga odling av LDN resulterade i massiva NET formation som var visualiserat grön fluorescerande kärnkraft med kromosomen motfärg. Efter samtidig inkubering av mänskliga gastric cancer cellinjer MKN45, OCUM-1 och NUGC-4 med nät, var många tumörceller instängda av näten. Därefter, den bifogade filen upphävdes helt av nedbrytningen av nät med DNAS I. Time-lapse video avslöjade att tumörceller fångade av näten inte dog men istället ökade kraftigt i en kontinuerlig kultur. Dessa metoder kan tillämpas vid påvisande av självhäftande interaktioner mellan nät och olika typer av celler och material.
Introduction
Polymorph nukleära neutrofiler i cirkulerande blod separeras vanligtvis från mononukleära celler via metoden täthet lutning förberedelse. Men är vissa neutrofiler som kallas låg densitet neutrofiler (LDN), med CD11b(+), CD15(+), CD16(+) och CD14(-) fenotyper, samtidig renat med mononukleära celler. Det relativa antalet LDN ökar markant i olika sjukliga tillstånd inklusive autoimmuna sjukdomar1,2, sepsis3och cancer4,5. Tidigare studier har visat att LDN är en fenotypiskt och funktionellt distinkta klass av neutrofiler6. Det bör noteras att LDN i cirkulerande blod är mer benägna att producera neutrofila extracellulära fällor (nät) än normala täthetsfunktionen neutrofiler2,7. Näten är web-liknande strukturer består av nukleinsyror, histoner, proteaser och granulat och cytosoliska proteiner, och de kan effektivt snärja och förstöra patogener8.
NETs har nyligen visat att fånga inte bara mikrober, men också trombocyter och cirkulerande tumörceller som kan bistå tromb bildas9 och tumören metastaser10,11. De molekylära mekanismerna bakom de självhäftande interaktioner mellan nät och trombocyter eller tumörceller är dock fortfarande oklart. Mer nyligen, ett i vitro adhesion test visade att myeloisk leukemiceller (K56212) och lung carcinom celler (A54913) fäster nät via β1 och β3 integriner. Författarna använde nettostock isolerade från neutrofiler och aktiveras av phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat (PMA) som den vidhäftning substrat14. Denna analys kan upptäcka verkliga interaktioner med NET komponenter i avsaknad av neutrofiler, är det tveksamt huruvida de ”cell-free nettostock” isolerad av höghastighetståg centrifugering behåller den molekylära strukturen som är identisk med nät som producerade i vivo. Nyligen hittade vi denna peritoneal lavage vätska efter bukkirurgi innehöll många mogna LDN, som genererade massiva nät och bifogas tumörceller orsakar peritoneal metastaser15. I denna studie undersökte vi framgångsrikt adhesionen av tumörceller till intakt nät utan någon fysisk manipulation. Här visar vi Detaljer för en teknik för att upptäcka självhäftande interaktioner mellan nät och gratis tumörceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LDN erhölls från inkluderades i denna studie och godkändes av institutionella granskning Jichi medicinska universitetets styrelse.
1. isolering av LDN från bukhålan Lavages och NET upptäckt
- Provtagning
- Ingjuta 1000 mL normalt steril koksaltlösning direkt i bukhålan innan sårslutning hos patienter som genomgått bukkirurgi på grund av gastrointestinal malignitet.
Obs: Erhölls prover från patienter som genomgick en gastrectomy eller kolektomi esophagectomy utan partiskhet baserat på ålder eller kön. Koksaltlösning överfördes till en behållare och hällde i hela buken inom en minut. Detta görs rutinmässigt som en postoperativ peritoneal tvätt utan betydande effekter på patienter. - Lavage bukhålan utförligt för minst 1 min.
Obs: Det rekommenderas att den infunderas vätskan rörs långsamt med kirurgens händer så att proven är enhetliga. - Återställa 200 mL lavage vätska med fyra 50 mL sprutor.
Obs: Ibland en gummi-kontakt används för att ta upp vätska.
- Ingjuta 1000 mL normalt steril koksaltlösning direkt i bukhålan innan sårslutning hos patienter som genomgått bukkirurgi på grund av gastrointestinal malignitet.
- Utföra rening av peritoneal LDN använder granulocyt specifika mAb, CD66b16.
Obs: Eftersom det mellanliggande skiktet efter densitet gradient centrifugering innehåller många mononukleära celler, framfördes positiva urval av polymorph neutrofiler använder CD66b mAb.- Överföra peritoneal lavage vätskan till en 50 mL tub.
Obs: I det här steget passera vätskorna 100 µm nylon filter för att avlägsna orenheter. - Centrifugera peritonealvätska vid 270 x g i 7 min på RT.
- Återsuspendera pellets i 5 mL PBS med 0,02% EDTA.
- Noggrant overlay 5 mL cellsuspension på en 3 mL täthet lutning lösning.
- Centrifugera vid 1.700 x g i 15 min på RT utan några pauser.
- Skörda de ~ 2-3 mL lösning som innehåller de mellanliggande lager (figur 1A) med pipett och blanda det med 10 mL PBS med 0,02% EDTA.
- Centrifugera peritonealvätska vid 400 x g i 7 min på RT och kasta bort supernatanten.
- Lägga till en annan 10 mL PBS med 0,02% EDTA och centrifugera vid 270 x g i 7 min på RT. Kassera supernatanten.
- Lös upp cellpelleten (1 x 107) i 60 µL buffert för magnetiska cell separation kit.
- Tillsätt 20 µL av Fc block till pellets och inkubera i 10 minuter vid 4 ° C.
- Tillsätt 20 µL av den anti-CD66b konjugerat med mikrokulor och inkubera i en ytterligare 10 min vid 4 ° C.
- Tvätta och resuspendera pellets i 500 µL av Mac-buffert.
- Gälla en magnetisk kolumn i det magnetiska fältet i en lämplig magnetisk separator cellsuspensionen och samla genomflöde innehållande CD66b(-) cellerna genom att tvätta kolonnen med 15 mL buffert.
- Ta bort kolumnen från den magnetiska avskiljaren och omedelbart spola ut magnetiskt märkta CD66b(+) cellerna av fast kolven in i kolonnen.
Obs: CD66b(+) cell befolkningen består mestadels av neutrofiler som bestäms av FACS analys som visar att > 95% av den CD66(+) fraktionen är positivt för CD11b, CD15 och CD16, men negativt för CD14.
- Överföra peritoneal lavage vätskan till en 50 mL tub.
- Generation av nät
- Efter centrifugering vid 270 x g i 7 min på RT, återsuspendering den isolerade LDN (5 x 106) i 1 mL RPMI1640 med 10% FCS.
- Kultur i LDN på en 6-väl poly-L-lysin belagda platta (6 cm i diameter) under 2 timmar vid 37 ° c i 5% CO2.
- Lägg till den grön fluorescerande motfärg (en membran-impermeable färg att färga kärnan och kromosomer) med en slutlig koncentration på 5 µM.
- Omedelbart följa morfologi av nät (extracellulär DNA komponenterna utvisas från LDN under fluorescensmikroskopi).
2. färgning av tumörcellerna med röd fluorescerande Cell Linker färgämne
- Förbereda mänskliga cancer cellinjer MKN45, NUGC och OCUM-1.
- Tvätta 1 x 107 celler med PBS + 0,02% EDTA i en 15 mL rör och centrifugera vid 270 x g under 7 min på RT.
- Tillsätt 1 mL av lösning för färgämnet färgning till pellets och Pipettera försiktigt.
- Lös 4 µL av röd fluorescerande Cell Linker färgämne i 1 mL lösning för färgning och blanda med cellsuspensionen från steg 2.2.
- Inkubera pellets för 4 min på RT.
- Tillsätt 4 mL DMEM (10% FBS) att stoppa färgning reaktionen.
- Centrifugera 270 x g i 7 min och kasta bort supernatanten.
- Upprepa steg 2.6 och 2.7 två gånger.
- Kontrollera med fluorescens Mikroskop (excitation = 551 nm, avger = 567 nm) att tumörcellerna färgas röd.
3. analys av tumör celladhesion till nät
- Återsuspendering röd fluorescerande färgade tumörcellerna (1 x 10-6) i 1 mL RPMI 1640 kompletteras med 0,1% BSA.
- Lägga till tumörcellerna LDN kulturen som producerade näten som beskrivs i steg 1.3.
- Inkubera i 5 minuter vid 37 ° c, vilket gör att tumörcellerna att kontakta näten.
Obs: Långa inkubationstider inducerar tumör celladhesion LDN eller plattorna. - Ta bort mediet och försiktigt Tvätta brunnarna genom att lägga 2 mL av förvärmd media (0,1% BSA + RPMI 1640) och virvlande skålen.
- Upprepa förfarandet tvätt i steg 3,4 två gånger.
Obs: Sedan nät svagt bifoga till plattan, tvätt bör ske så varsamt som möjligt för att undvika borttagning av nät själva. - Lägg till den grön fluorescerande färgämnen för färgning kärnan och kromosomer med en slutlig koncentration på 5 µg/mL för visualisering av näten.
- Observera näten och fäst tumörceller med hjälp av lämpliga filter (grön, excitation = 504 nm, avger = 523 nm; röd, excitation = 551 nm, avger = 567 nm).
- Sammanfoga siffrorna för att Visa tumörcellerna som är fångade av näten.
Obs: I vissa experiment, DNA nedbrytning enzym lades till kulturens LDN (slutlig koncentration på 100 U/mL) 5 min innan samtidig inkubering under 5 min.
4. time Lapse Video analys av fångade tumörcellerna
- Kultur den peritoneal LDN i en 35 mm runda maträtt belagd med poly-L-lysin som beskrivs i steg 1.3.
- Lägg till den grön fluorescerande färgämnen för färgning kärnan och kromosomerna att visualisera nät som beskrivs i steg 1.3.
- Efter 1 min inkubering, ta bort materialet och tillsätt 2 mL av 0,1% BSA + RPMI 1640.
- Ta bort materialet och lägga till ofärgade 1 x 106 MKN45 celler upphängd i 0,1% BSA + RPMI 1640. Inkubera i 5 min på RT.
- Avlägsna eventuella okopplade tumörceller genom att försiktigt tvätta enligt steg 3,4 och lägga till DMEM med 10% FCS kompletteras med 100 u/mL Penicillin och 100 µg/mL streptomycin.
- Montera kultur skålen i ett hela-Visa cellen observationssystem och välj lämpligt fält i vilken tumör celler är instängd av näten.
- Fortsätta att samarbete kultur i ytterligare 2 dagar och ta kontinuerliga bilder av fältet var 6 minut under normala ljus och fluorescens, som upptäcker MKN45 celler och nät, respektive.
- Överlagra bilder vid varje tidpunkt och konstruera time-lapse video använder Image Viewer mjukvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I 2-timmars kultur, CD66b(+) LDN härrör från peritoneal lavage vätska visade sträng strukturer målat med grön fluorescerande färgämne för kärnkraft och kromosom (figur 1B), medan CD66b(-) mononukleära celler inte (figur 1 c). Men när LDN kulturerna var förbehandlats med 100 U/mL DNAS var jag, karaktäristiska strukturen förstörs (figur 1 d), vilket indikerar att de består av extracellulära DNA utvisas från neutrofiler. När LDN odlades på plasttallrikar utan beläggning, många NET kluster flytande i observerades media, med några nät i botten (figur 1E).
Nästa, för att undersöka vidhäftning av tumör cellinjer till nät, MKN45 celler märkta med rött fluorescerande färgämne var läggs till näten och samtidig inkuberas i 5 minuter. Efter varsam tvätt, många MKN45 celler hittades fäst (figur 2A och 2 C). Däremot några MKN45 celler bifogas när LDN var förbehandlats med DNAS I (figur 2B och 2 C). Den sammanslagna figuren visade tydligt att en majoritet av de bifoga MKN45 cellerna var samtidig lokaliserade med nät, ses som strukturer bildas på undersidan av plattan (figur 2D). Liknande vidhäftning mönster observerades med OCUM-1 och NUGC-4 (figur 2E och 2F).
Eftersom nät har visat sig vara cytotoxiska för bakterier, vi sedan undersökte huruvida tumörceller fångade av nät dö eller överleva i en kontinuerlig samarbete kultur med time-lapse video. Intressant, medan nät försvann gradvis inom flera timmar, de MKN45 cellerna fångade av nät börjat föröka sig kraftigt efteråt (Video 1).
Figur 1: NET bildandet efter kulturen av peritoneal LDN. (A) efter densitet gradient centrifugering av postoperativ lavage vätska, cellerna återhämtat sig från det mellanliggande skiktet visas. (B) sedan CD66b(+) LDN skildes från CD66b(-) mononukleära celler och odlade på poly-L-lysin 6-väl plattorna, följt av nukleär färgning dye tillägg och omedelbar observation med fluorescensmikroskopi. (C) samma antal CD66b(-) mononukleära celler odlades på samma villkor. (D) The LDN enskiktslager var inkuberas med DNAS jag i 5 minuter innan nukleär färgning. (E) CD66b(+) LDN odlades på plasttallrikar utan beläggning. Vita staplarna representerar 100 µm. Denna siffra ändrades från en tidigare publikation15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Adhesion av tumör celler till nät. (A) Peritoneal LDN odlades på poly-L-lysin 6-väl plattorna för 2 h, som producerade massiva nät. Röd fluorescein-märkt MKN45 tillfogades därefter. Efter en 5-minuters inkubation, obundna celler avlägsnades genom skonsam tvättning och kvarvarande tumörceller observerades i fluorescens Mikroskop. (B) före tillsats av MKN45, var det LDN enskiktslager förbehandlats med DNAS jag för 5 min. (C) i experiment (A) och (B), antalet bifogade MKN45 celler räknades i 3 slumpmässiga fält under mikroskopet fluorescens och menar ± SD uttrycktes. (D) efter skonsam tvätt, grön fluorescerande färgämne för kärnkraft och kromosom lades till samtidig kulturen. Bilder av bifogade MKN45 och NET strukturer togs med hjälp av lämpliga optisk våglängd filter i representativa fält, och två siffrorna slogs samman. De samma experiment som utförs i (D) utfördes också för OCUM-1 (E) och NUGC-4 (F). Vita staplarna representerar 100 µm. Denna siffra ändrades från en tidigare publikation15. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: efter vidhäftning beteende av fångade tumörcellerna. LDN odlades på poly-L-lysin 6-väl plattorna för 2 timmar, och netto bildandet bekräftades av grön fluorescerande färgämne för kärnkraft och kromosom. Sedan ofärgade MKN45 celler var lagt och samtidig inkuberas i 5 minuter och obundna celler avlägsnades genom skonsam tvättning och fortsatte att vara tillsammans odlade i 10% FCS + DMEM. Hela-Visa cellen observationssystem med var områden där tumörceller var fångade av nät sökte. Fotografier av fältet togs sedan varje 6 minuter under normala ljus och fluorescens, vilket möjliggjorde tydliga siffror av tumörceller och nät, respektive. Slutligen, bilderna var ingraverad med Image Viewer-programvara, och en tid förfaller video skapades på en 3600 x högre hastighet än i realtid. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare studier har rapporterat att cirkulerande tumörceller kan vara fångade av NET substrat i vivo10,11. Metastaserande bröstcancer cancerceller har visat sig stimulera neutrofiler och inducera bildandet av nät, som bistår i tumör celltillväxt i målet orgel17. Vi hittade dessutom att kortsiktiga kulturer av LDN från postoperativ lavage vätska produceras massiva nät som effektivt kan snärja tumörceller utan ytterligare stimulering15. Dessa observationer antyder en möjlig roll för mekanisk inblandning av nät i metastaserande processen. De detaljerade molekylära mekanismer som medla självhäftande interaktioner mellan nät och tumörceller är dock fortfarande oklart. Nyligen genomförda studier har inblandade medverkan av integrin i denna process med hjälp av nettostock isolerade från aktiverade neutrofiler som tjänar som vidhäftning substrat12,13. Men renat och koncentrerat nät komponenter ska har till stor del olika molekylära strukturer från ursprungliga nät. I jämförelse använder vår metod intakt nät utan fysisk manipulation, vilket är en stark fördel vid prövningen av de detaljerade mekanismerna för självhäftande interaktioner med nät. Med denna enkla teknik, kan forskare detektera specifika kvarstad på många tumörceller till nät snabbt (inom 5 min).
Den viktigaste funktionen av protokollet är användningen av en poly-L-lysin belagda platta att fixa NET strukturer på botten av plattan. När intakt plasttallrikar användes för LDN kulturen, upptäcktes endast några nät i botten. Dessutom observerades många green-positiv kluster som fritt flytande i kultur media, när de borde ha varit fristående från plattan (figur 1 d). Vi har även granskat NET bildandet på plåtar belagda med kollagen, Fibronektin och laminin, som aktiverat upptäckt av web-liknande strukturer i bottenlagret. Dock förtjänar tycktes tillmäter substratesna som är mindre tätt än till poly-L-lysin, och de var enkelt fristående vid förfarandet för tvätt. Dessa andra alternativ är därför otillräckliga för vidhäftning analyser. I själva verket, om vi använder plattor utan poly-L-lysin beläggningar, kan nät och eventuella bifogade tumörceller bli enkelt bort från plattan genom att lägga till media till brunnarna.
Det kritiska steget i vidhäftning analysen är inkubationstiden för samtidig kulturen med tumörcellerna. Fem minuter räcker för tumörceller att binda till näten. Under experimentella förhållanden när du lägger till lösningen innehållande tumörceller till 6-väl plattan, göra alla tumörceller fysisk kontakt med NET strukturer bildas på botten av plattan. Men odling samtidig för en längre period (t.ex. längre än 10 minuter) resulterar i bindningen av tumörceller till LDN eller poly-L-lysin substrat. Inkubationstiden bör därför kort för att detektera specifika bindningen till förtjänar. Manövrering av skonsam tvätt är en annan viktig punkt. Vi såg till att sakta lägga värmde media från sidovägg varje väl, försiktigt swing plattan och ta bort supernatanten med en insugningsventil. Eftersom nät sticka till plattan svagt, bör denna process utföras på ett särskilt försiktiga sätt.
Denna teknik framhåller att det behövs en annan molekylär mekanism för tumörceller bindande till nät inom minuter, än att visas i ett vidhäftning test med en ~ 30-60 minuters inkubation till NET bestånd12,13. Blockerar experiment med denna metod kan belysa de detaljerade molekylära mekanismer där verkliga nät fälla olika material. En begränsning av denna teknik är dock att tvättprocessen kan skilja sig åt när de självhäftande interaktionerna förekomma mellan nät och tumör celler in vivo. I den kliniska inställningen är tätheten av tumörceller mycket lägre än den som används i detta protokoll, som kan presentera en annan begränsning.
Time-lapse video analys är mycket användbara för att övervaka resultaten av olika cellulära händelser under en period av dagar. Använder hela-cell Visa-systemet kan visa vi att nät är gradvis försämras, förmodligen av DNAS som finns i serum, medan MKN45 fångade av nät börja föröka kraftigt därefter. Denna video visade endast uppdelningen av tumörceller som bifogas nät, med ingen jämförelse MKN45 kopplade till plattan. Kontaminerade neutrofiler och extra nukleär färgning färgen kan ha också påverkat tillväxten av tumörcellerna. Därför kunde vi inte dra en definitiv slutsats angående Nettoeffekter av nät på tumör celltillväxt. Denna analys indikerar dock att tumörceller inte dödas av näten och kan faktiskt överleva efter entrapment av nät.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Ms. J. Shinohara och I. Nieda för teknisk- och kontorsarbete. Vi tackar också, Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina och Kazuya Takahashi för deras samarbete för provtagning i operationssalen. Detta arbete stöds av ett bidrag för vetenskaplig forskning från ministeriet för utbildning, vetenskap, sport, och kultur i Japan och Japan Society för främjande av vetenskap (17K 10606).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
