Vi præsenterer her, en metode hvor menneskelige low-density neutrofile (LDN), inddrives fra postoperative peritoneal lavage væske, producere massive neutrofile ekstracellulære fælder (net) og effektivt fælde gratis tumorceller, der senere vokser.
Aktiveret neutrofiler release neutrofile ekstracellulære fælder (net), som kan fange og ødelægge mikrober. Nylige undersøgelser tyder på at NETs er involveret i forskellige sygdomsprocesser, såsom autoimmune sygdom, trombose og tumor metastaser. Her viser vi en detaljeret in vitro- teknik til at detektere netto aktivitet under diffusering af gratis tumorceller, der vokser efter tilknytning til NETs. Først, vi indsamlet lavdensitet neutrofile (LDN) fra postoperative peritoneal lavage væske fra patienter, der gennemgik laparotomies. Kortsigtede dyrkning af LDN resulterede i massiv netto dannelse, der blev visualiseret med grøn fluorescerende nukleare og kromosom kontrastfarve. Efter Co inkubation af menneskelige gastrisk kræft cellelinjer MKN45, dokumenter-1 og NUGC-4 med garnene, blev mange tumorceller fanget af nettene. Efterfølgende, den vedhæftede fil blev fuldstændig ophævet ved nedbrydning af net med DNase I. Time-lapse video afslørede, at tumorceller fanget af garnene ikke gjorde dø, men i stedet voksede kraftigt i en kontinuerlig kultur. Disse metoder kan anvendes til påvisning af selvklæbende interaktioner mellem net og forskellige typer af celler og materialer.
Polymorph nukleare neutrofiler i cirkulerende blod er typisk adskilt fra mononukleære celler gennem metoden tæthed gradient forberedelse. Nogle neutrofiler, kendt som low-density neutrofile (LDN), med CD11b(+), CD15(+), CD16(+) og CD14(-) fænotyper, er imidlertid Co renset med mononukleære celler. Det relative antal LDN øger i forskellige patologiske betingelser herunder autoimmune sygdomme1,2, sepsis3og kræft4,5. Tidligere undersøgelser har vist, at LDN er en fænotype og funktionelt adskilte klasse af neutrofiler6. Det skal bemærkes, at LDN i cirkulerende blod er mere tilbøjelige til at producere neutrofile ekstracellulære fælder (NETs) end normal tæthed neutrofiler2,7. NETs er web-lignende strukturer sammensat af nukleinsyrer, histoner, proteaser og kornede og cytosole proteiner, og de kan effektivt have fat og ødelægger patogener8.
For nylig, net har vist sig at fange ikke kun mikrober, men også blodplader og cirkulerende tumorceller, som kan hjælpe med blodprop dannelse9 og tumor metastaser10,11. Men de molekylære mekanismer bag de selvklæbende interaktioner mellem net og blodplader eller tumorceller er stadig uklart. En in vitro- vedhæftning analyse afslørede for nylig, at myeloid leukæmiceller (K56212) og lunge cancer celler (A54913) tillægger net via B1 og β3 integriner. Forfatterne anvendte NET stock isoleret fra neutrofile og aktiveres af phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) som vedhæftning substrat14. Selv om denne analyse giver påvisning af virkelige interaktioner med netto komponenter i fravær af neutrofiler, kan det diskuteres hvorvidt de “celle-gratis NET stock” isoleret ved højhastigheds centrifugering bevarer den molekylære struktur identisk med net produceret i vivo. For nylig, fandt vi at peritoneal lavage væske efter abdominal kirurgi indeholdt mange modne LDN, som genereres massive redskaber og knyttet til tumorceller forårsager peritoneal metastaser15. I denne undersøgelse undersøgte vi med held vedhæftning af tumorceller til intakt redskaber uden fysisk manipulation. Her, viser vi oplysninger om en teknik til at registrere klæbende interaktioner mellem net og gratis tumorceller.
Tidligere undersøgelser har rapporteret, at cirkulerende tumorceller kan blive fanget af netto substrater i vivo10,11. Metastatisk brystkræftceller har vist sig at stimulere neutrofile og fremkalde dannelse af redskaber, som hjælper i tumorcellevækst i target organ17. Desuden fandt vi, at kortsigtede kulturer af LDN fra postoperative lavage væske produceret massive redskaber, der effektivt kunne lokke tumorceller uden yderlig…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Ms. J. Shinohara og I. Nieda for teknisk og kontorarbejde. Vi takker også, Drs. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina og Kazuya Takahashi for deres samarbejde for prøven erhvervelse på operationsstuen. Dette arbejde blev støttet af en licensbetaling for videnskabelig forskning fra ministeriet for uddannelse, videnskab, sport, og kultur af Japan og Japan samfund til fremme af videnskab (17K 10606).
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |