Summary
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode in der menschlichen Low-Density Neutrophilen (LDN), erholte sich von postoperativen peritoneal Lavage Fluid, produzieren massive Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs) und effizient trap freie Tumorzellen, die anschließend wachsen.
Abstract
Aktiviert neutrophile Release Neutrophilen extrazelluläre fallen (Netze), die erfassen und Mikroben vernichten können. Neuere Studien legen nahe, dass verschiedene Krankheitsprozesse, wie z. B. Autoimmun-Krankheit, Thrombose und Tumor Metastasen Netze beteiligt sind. Hier zeigen wir eine detaillierte in-Vitro -Technik, um NET Aktivität während das Abfangen von freien Tumorzellen erkennen, die nach Bindung an Netze wachsen. Zunächst sammelten wir niedrige Dichte Neutrophilen (LDN) von postoperativen peritoneal Lavage Fluid von Patienten, die Laparatomien unterzogen. Kurzfristiger Kultivierung von LDN führte zu massiven NET Formation, die mit nuklearen grün fluoreszierende und Chromosom gegenfärbung visualisiert wurde. Nach der Co Inkubation des menschlichen Magen-Krebs-Zell-Linien MKN45, OCUM-1 und NUGC-4 mit den Netzen wurden viele Tumorzellen durch die Netze gefangen. Anschließend die Anlage wurde komplett aufgehoben durch den Abbau von Netzen mit DNase I. Time-lapse Video zeigte, dass Tumorzellen gefangen durch die Netze nicht sterben aber stattdessen wuchs kräftig in einer kontinuierlichen Kultur. Diese Methoden können für die Erkennung von Klebstoff Interaktionen zwischen Netzen und verschiedene Arten von Zellen und Materialien angewendet werden.
Introduction
Polymorphen nuklearen Neutrophilen im Blut zirkulierenden sind in der Regel durch die Art der Dichte-Gradienten Zubereitung von mononukleären Zellen getrennt. Allerdings sind einige Neutrophilen bekannt als Low-Density Neutrophilen (LDN), mit CD11b(+), CD15(+), CD16(+) und CD14(-) Phänotypen, Co gereinigten mit mononukleären Zellen. Die relative Anzahl der LDN erhöht in verschiedenen pathologischen Bedingungen einschließlich Autoimmunerkrankungen1,2, Sepsis3und Krebs4,5. Frühere Studien haben gezeigt, dass LDN eine phänotypisch und funktionell eigene Klasse von Neutrophilen6. Es sei darauf hingewiesen, dass LDN im zirkulierenden Blut sind eher Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs) als normale Dichte Neutrophilen2,7zu produzieren. Netze sind netzartige Strukturen bestehend aus Nukleinsäuren, Histone, Proteasen und körnige und cytosolischen Proteine, und sie können effizient zu fangen und zerstören Krankheitserreger8.
Vor kurzem wurden Netze gezeigt, erfassen nicht nur Mikroben, sondern auch Blutplättchen und zirkulierenden Tumorzellen dem Thrombus Bildung9 und Tumor Metastasen10,11helfen können. Die molekularen Mechanismen hinter der Klebstoffen Interaktionen zwischen Netzen und Blutplättchen oder Tumorzellen sind jedoch noch unklar. In jüngerer Zeit, ein in-Vitro Adhäsion Assay zufolge Netze über β1 und β3 Integrine myeloische Leukämie-Zellen (K56212) und Lunge Karzinomzellen (A54913) zuordnen. Die Autoren verwendeten Netto Lager von Neutrophilen isoliert und durch Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) als die Adhäsion Substrat14aktiviert. Obwohl dieser Assay Erkennung von realen Interaktionen mit NET-Komponenten in das Fehlen von Neutrophilen erlaubt, ist es fraglich ob die molekulare Struktur identisch mit Netzen produziert in behält die "zellfreie Netto Lager" durch High-Speed-Zentrifugation isoliert Vivo. Vor kurzem fanden wir, dass peritoneal Lavage-Flüssigkeit, nach Bauchoperationen viele Reife LDN, enthalten die massive Netze generiert und an Tumorzellen verursacht peritonealen Metastasen15. In dieser Studie untersuchten wir erfolgreich das Anhaften von Tumorzellen intakt Netze ohne physische Manipulation. Hier zeigen wir Details eine Technik, selbstklebende Wechselwirkungen zwischen Netzen und freie Tumorzellen zu erkennen.
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Protocol
LDN wurden Patienten in dieser Studie entnommen und durch die institutionelle Review Board der Jichi Medizinische Universität angenommen wurden.
1. Isolierung von LDN aus Bauchhöhle Lavages und NET Detection
- Probe-Übernahme
- Die Infusion 1.000 mL normale sterile Kochsalzlösung direkt in die Bauchhöhle vor Wundverschluss bei Patienten, die aufgrund von Magen-Darm-Malignität Bauch operiert wurden.
Hinweis: Proben stammen von Patienten, die eine Gastrektomie, Colectomy oder Ösophagektomie ohne Vorurteile basierend auf Alter oder Geschlecht unterzogen. Kochsalzlösung wurde in einen Behälter überführt und innerhalb einer Minute in den ganzen Unterleib gegossen. Dies wird als eine postoperative peritonealen waschen ohne erhebliche Auswirkungen auf Patienten routinemäßig durchgeführt. - Lavage der Bauchhöhle ausgiebig für mindestens 1 Minute.
Hinweis: Es wird empfohlen, dass die infundierte Flüssigkeit langsam mit der Chirurg Hände gerührt wird, damit die Proben einheitlich sind. - 200 mL Lavage-Flüssigkeit mit vier 50 mL Spritzen zu erholen.
Hinweis: Manchmal wird ein Kaltgerätestecker verwendet, um die Flüssigkeiten aufnehmen.
- Die Infusion 1.000 mL normale sterile Kochsalzlösung direkt in die Bauchhöhle vor Wundverschluss bei Patienten, die aufgrund von Magen-Darm-Malignität Bauch operiert wurden.
- Durchführen Sie Reinigung des peritonealen LDN mit Granulozyten spezifische mAb, CD66b16.
Hinweis: Da die Zwischenschicht nach Dichte-Gradienten-Zentrifugierung viele MONONUKLEÄRE Zellen enthält, wurde positiver Selektion der polymorphen Neutrophilen mit CD66b mAb durchgeführt.- Übertragen Sie die peritoneale Lavage-Flüssigkeit auf eine 50 mL-Tube.
Hinweis: In diesem Schritt durchlaufen Sie die Flüssigkeiten einen 100 µm Nylon-Filter, um Verunreinigungen zu entfernen. - Zentrifugieren der peritonealen Flüssigkeit bei 270 X g für 7 min bei RT
- Die Pellets in 5 mL PBS mit 0,02 % EDTA aufzuwirbeln.
- Überlagern Sie sorgfältig die 5 mL Zellsuspension auf eine 3 mL Dichte-Gradienten-Lösung.
- Zentrifugieren Sie bei 1.700 x g für 15 min bei RT ohne Pausen.
- Ernten Sie ~ 2-3 mL Lösung enthält die Zwischenschichten (Abbildung 1A) mit einer Pipette zu und mischen Sie es mit 10 mL PBS mit 0,02 % EDTA.
- Zentrifugieren der peritonealen Flüssigkeit bei 400 X g für 7 min bei RT und den überstand verwerfen.
- Fügen Sie ein weiteres 10 mL PBS mit 0,02 % EDTA und Zentrifuge bei 270 X g für 7 min bei RT. verwerfen der Überstand.
- Die Zelle-Pellet (1 x 107) in 60 µL Puffer für das magnetische Zelle Trennung Kit auflösen.
- Die Pellets 20 µL des Fc Block hinzufügen und 10 min bei 4 ° c inkubieren
- Fügen Sie 20 µL des Anti-CD66b mit Microbeads konjugierten und eine zusätzliche 10 min bei 4 ° c inkubieren
- Waschen Sie und wieder auszusetzen Sie, die Pellets in 500 µL Puffer MACS.
- Anwenden der Zellsuspension auf eine magnetische Spalte in das Magnetfeld des einen geeigneten Magnetabscheider und durchströmten enthaltenden CD66b(-) Zellen durch Waschen der Spalte mit 15 mL des Puffers zu sammeln.
- Entfernen Sie die Spalte aus der Magnetabscheider und sofort die magnetisch beschrifteten CD66b(+) Zellen fest drücken Sie den Kolben in die Spalte durchspülen.
Hinweis: Die CD66b(+)-Zell-Population besteht zum Großteil aus Neutrophilen durch FACS Analyse darauf hinweist, dass > 95 % der CD66(+)-Fraktion sind für CD11b, CD15 und CD16 positiv, sondern negativ für CD14.
- Übertragen Sie die peritoneale Lavage-Flüssigkeit auf eine 50 mL-Tube.
- Erzeugung von Netzen
- Nach Zentrifugation bei 270 X g für 7 min bei RT, erneut aussetzen der isolierten LDN (5 x 106) in 1 mL RPMI1640 mit 10 % FCS.
- Kultur der LDN auf einer 6-Brunnen Poly-L-Lysin beschichtete Platte (6 cm Durchmesser) für 2 h bei 37 ° c in 5 % CO2.
- Fügen Sie das grün fluoreszierende gegenfärbung (eine Membran undurchlässig Farbstoff, der Kern und die Chromosomen Beflecken) am die Endkonzentration von 5 µM.
- Die Morphologie der Netze (die extrazelluläre DNA-Bausteine aus der LDN unter Fluoreszenz-Mikroskopie ausgewiesen) sofort zu beobachten.
(2) Färbung der Tumorzellen mit rot fluoreszierende Zelle Linker Farbstoff
- Bereiten Sie menschlichen Krebs Zell-Linien MKN45, NUGC und OCUM-1.
- Waschen Sie 1 x 107 Zellen mit PBS + 0,02 % EDTA in einem 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 270 X g für 7 min bei RT
- Fügen Sie 1 mL der Lösung für Farbstoff Färbung, die Pellets und pipette vorsichtig.
- Lösen Sie 4 µL rot fluoreszierende Zelle Linker Farbstoff in 1 mL der Lösung zum Färben und mischen mit der Zellsuspension aus Schritt 2.2.
- Die Pellets für 4 min bei RT inkubieren
- Fügen Sie 4 mL DMEM (10 % FBS), die Färbung Reaktion zu stoppen.
- 270 X g für 7 min zentrifugieren und den überstand verwerfen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.6 und 2.7 zweimal.
- Erkundigen Sie sich bei einem Fluoreszenzmikroskop (Erregung = 551 nm emittieren = 567 nm), dass die Tumorzellen rot gefärbt sind.
3. Analyse der Tumor Zelladhäsion, Netze
- Wieder aussetzen Sie rot fluoreszierende gefärbten Tumorzellen (1 x 106) in 1 mL RPMI 1640 mit 0,1 % BSA ergänzt.
- Fügen Sie die Tumorzellen, die LDN-Kultur, die die Netze hergestellt, wie unter Punkt 1.3 beschrieben.
- Inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° c, wodurch die Tumorzellen, die Netze zu kontaktieren.
Hinweis: Lange Inkubationszeit induziert Tumor Zelladhäsion LDN oder an den Platten. - Entfernen Sie das Medium und waschen Sie vorsichtig die Brunnen durch Hinzufügen von 2 mL vorgewärmte Medien (0,1 % BSA + RPMI-1640) und Schwenken die Schüssel.
- Wiederholen Sie der Waschvorgang in Schritt 3.4 zweimal.
Hinweis: Seit Netze schwach bis auf den Teller legen, Waschen sollte so schonend wie möglich zu entfernen die Netze selbst erfolgen. - Fügen Sie die grünen fluoreszierenden Farbstoff zum Färben der Kern und die Chromosomen in eine Endkonzentration von 5 µg/mL für die Visualisierung der Netze.
- Die Netze zu beobachten und an Tumorzellen mit den entsprechenden Filtern (grün, Erregung = 504 nm, emittierende = 523 nm; rot, Erregung = 551 nm, emittierende = 567 nm).
- Zusammengeführt werden die Zahlen, um die Tumorzellen zeigen, die von den Netzen gefangen sind.
Hinweis: In einigen Experimenten wurde DNA-Abbau-Enzym die LDN-Kultur (Endkonzentration von 100 U/mL) 5 min vor der Co Inkubation für 5 min hinzugefügt.
4. Zeit Zeitraffer Video-Analyse der eingeschlossenen Tumorzellen
- Kultur der peritonealen LDN in einem 35 mm Runde Schüssel beschichtet mit Poly-L-Lysin wie unter Punkt 1.3 beschrieben.
- Fügen Sie die grünen fluoreszierenden Farbstoff zum Färben der Kern und die Chromosomen, Netze, wie unter Punkt 1.3 beschrieben zu visualisieren.
- Entfernen Sie nach 1 min Inkubation das Medium und 2 mL 0,1 % BSA + RPMI 1640.
- Entfernen Sie den Datenträger, und fügen Sie ungefärbt 1 x 106 MKN45 Zellen in 0,1 % suspendiert, BSA + RPMI 1640. 5 min bei RT inkubieren
- Entfernen Sie alle ungebunden Tumorzellen durch sanft Waschen wie unter Punkt 3.4 beschrieben und fügen Sie DMEM mit 10 % FCS mit 100 u/mL Penicillin und 100 µg/mL Streptomycin ergänzt.
- Montieren Sie der Kulturschale in ein Beobachtungssystem Blick auf ganze Zelle und wählen Sie das entsprechende Feld in welchem, das Tumor Zellen durch die Netze gefangen sind.
- Weiterhin gemeinsam für weitere 2 Tage Kultur und kontinuierliche Fotografieren des Feldes alle 6 min. unter normalem Licht und Fluoreszenz, die MKN45 Zellen und Netze, bzw. erkennt.
- Überlagern Sie die Bilder bei jedem Timepoint und konstruieren Sie Zeitraffer-Videos mit Bild-Viewer-Software.
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Representative Results
In der 2-Stunden-Kultur CD66b(+) LDN peritoneal Lavage Fluid angezeigte Zeichenfolge Strukturen abgeleitet gebeizt mit grün fluoreszierenden Farbstoff für nukleare und Chromosom (Abbildung 1 b), während CD66b(-) MONONUKLEÄRE Zellen nicht (Abbildung 1). Jedoch wenn die LDN-Kulturen mit vorbehandelt wurden 100 U/mL DNase I, die charakteristische Architektur wurde zerstört (Abbildung 1), darauf hinweist, dass sie bestehend aus extrazellulärer DNA aus Neutrophilen vertrieben wurden. Wenn LDN wurden auf Kunststoffplatten kultiviert, ohne Beschichtung, viele NET Cluster schwebend in Medien, mit einigen Netzen auf der Unterseite (Abbildung 1E) beobachtet.
Als nächstes um Adhäsion der Tumor-Zell-Linien, Netze zu untersuchen, MKN45 Zellen mit roten Leuchtstofffärbung beschriftet wurden hinzugefügt, um die Netze und Co für 5 Minuten inkubiert. Nach der sanften Reinigung angebracht viele MKN45 Zellen gefunden wurden (Abb. 2A und 2 C). Im Gegensatz dazu einige MKN45 Zellen angebracht wenn LDN waren vorbehandelt mit DNase I (Abb. 2 b und 2 C). Die zusammengeführte Figur zeigte deutlich, dass eine Mehrheit der beigefügten MKN45 Zellen wurden Co lokalisierte mit Netzen, als Strukturen, die auf der Unterseite der Platte (Abb. 2D) gebildet. Ähnliche Haftung Muster wurden mit OCUM-1 und NUGC-4 (Abb. 2E und 2F) beobachtet.
Da Netze zytotoxische, Bakterien erwiesen haben, wir dann geprüft, ob Tumorzellen durch Netze sterben gefangen oder Überleben in einem kontinuierlichen kokultur mit Zeitraffer-Video. Interessanterweise, während Netze innerhalb einiger Stunden allmählich verschwand, die MKN45 Zellen durch Netze begonnen, danach kräftig vermehren (Video 1) gefangen.
Abbildung 1: NET Bildung nach der Kultur der peritonealen LDN. (A) nach der Dichte Steigung Zentrifugierung der postoperativen Lavage-Flüssigkeit, Zellen von der Zwischenschicht erholt werden angezeigt. (B) dann CD66b(+) LDN wurden von CD66b(-) mononukleären Zellen getrennt und kultiviert auf Poly-L-Lysin beschichteten 6-Well-Platten, gefolgt von nuklearen Färbung Farbstoff Addition und unmittelbare Beobachtung mit Fluoreszenz-Mikroskopie. (C) die gleiche Anzahl von CD66b(-) mononukleären Zellen wurden unter den gleichen Bedingungen kultiviert. (D) die LDN Monoschicht wurde inkubiert mit DNase ich 5 Minuten vor nuklearen Färbung. (E) CD66b(+) LDN wurden kultiviert, auf Kunststoff-Platten ohne Beschichtung. Weiße Balken stehen für 100 µm. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung15geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Haftung der Tumor Zellen zu Netzen. (A) peritonealen LDN wurden kultiviert auf Poly-L-Lysin beschichteten 6-Well-Platten für 2 h, die massive Netze hergestellt. Roten Fluorescein-gekennzeichnete MKN45 wurden dann hinzugefügt. Nach einer 5-minütigen Inkubation ungebundene Zellen wurden durch sanftes Waschen entfernt und verbleibende Tumorzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet wurden. (B) vor der Zugabe von MKN45, LDN Monoschicht wurde vorbehandelt mit DNase I für 5 min. (C) In Experimenten (A) und (B), die Anzahl der angeschlossenen MKN45 Zellen wurden in 3 ZUFALLSFELDER unter dem Fluoreszenzmikroskop gezählt und meine ± SD zum Ausdruck gebracht wurde. (D) nach dem sanften waschen grün fluoreszierenden Farbstoff für nukleare und Chromosom wurde hinzugefügt, um die Co-Kultur. In repräsentativen Bereichen Fotos des beigefügten MKN45 und NET Strukturen wurden mit Hilfe von geeigneten optischen Wellenlänge filtern, und die beiden Figuren wurden zusammengelegt. Die gleichen Experimente durchgeführt ( d) wurden auch für OCUM-1 (E) und NUGC-4 (F)durchgeführt. Weiße Balken stehen für 100 µm. Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung15geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Video 1: Post-Adhäsion Verhalten der eingeschlossenen Tumorzellen. LDN wurden auf Poly-L-Lysin beschichteten 6-Well-Platten für 2 Stunden kultiviert, und NET Bildung wurde bestätigt durch grün fluoreszierenden Farbstoff für nukleare und Chromosom. Dann, ungefärbte MKN45 Zellen wurden hinzugefügt und Co für 5 Minuten inkubiert und ungebundene Zellen wurden durch sanftes Waschen entfernt und in 10 % Co kultiviert werden weiterhin FCS + DMEM. Mit einem Blick auf ganze Zelle Beobachtungssystem, wurden Bereiche wo Tumorzellen mit Netzen gefangen wurden gesucht. Fotos des Feldes wurden dann alle 6 Minuten unter normalem Licht und Fluoreszenz, die klare Zahlen von Tumorzellen und Netzen, bzw. konnte. Schließlich wurden die Bilder mit Image Viewer Software überlagert, und ein Zeitraffer-video entstand ein 3600 X schneller als in Echtzeit. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Frühere Studien haben berichtet, dass die zirkulierenden Tumorzellen durch NET Substrate in Vivo10,11gefangen werden kann. Metastasierendem Brustkrebs-Zellen nachweislich zu stimulieren Neutrophilen und induzieren die Bildung von Netzen, die Zelle Tumorwachstum in die Ziel-Organ-17unterstützt. Darüber hinaus fanden wir, dass kurzfristige Kulturen von LDN aus postoperative Lavage Fluid massive Netze hergestellt, die effizient Tumorzellen ohne weitere Stimulation15verleiten könnte. Diese Beobachtungen legen nahe, eine mögliche Rolle für mechanische Einbindung der Netze in den metastatischen Prozess. Die detaillierte molekularen Mechanismen, die selbstklebende Interaktionen zwischen den Netzen und Tumorzellen zu vermitteln ist jedoch noch unklar. Jüngste Studien haben die Einbeziehung der Integrin in diesem Prozess durch den Einsatz von Netto Lager isoliert von aktivierten Neutrophilen, die als die Adhäsion Substrat12,13dienen verwickelt. Gereinigte und konzentriertere Netze Komponenten sollen jedoch weitgehend unterschiedliche molekulare Strukturen aus ursprünglichen Netzen haben. Im Vergleich dazu verwendet unsere Methode intakt Netze ohne physische Manipulation, was einen großen Vorteil ist, wenn die detaillierten Mechanismen der Klebstoff Interaktionen mit Netzen zu untersuchen. Mit dieser einfachen Technik erkennen Forscher bestimmte Anlage von vielen Tumorzellen zu Netze schnell (innerhalb von 5 min).
Das wichtigste Merkmal des Protokolls ist die Verwendung einer Poly-L-Lysin beschichtete Platte, die Netzstrukturen auf der Unterseite der Platte zu beheben. Wenn intakte Kunststoffplatten für die LDN-Kultur verwendet wurden, waren nur wenige Netze am unteren erkannt. Darüber hinaus wurden viele grün-positiven Cluster beobachtet, als frei schwebend in der Kultur, Medien, wenn sie losgelöst von der Platte (Abbildung 1) hätte sein sollen. Wir untersuchten auch NET Bildung auf Tellern mit Kollagen, Fibronektin und Laminin, die es die Erkennung von Web-ähnliche Strukturen in der Unterschicht ermöglicht beschichtet. Jedoch die Netze erschien Anfügen an den Substraten weniger dicht als auf Poly-L-Lysin, und sie waren einfach losgelöst von den Waschvorgang. Daher sind diese anderen Optionen für Adhäsion Assays unzureichend. In der Tat, wenn wir Platten ohne Poly-L-Lysin Beschichtungen verwenden, können Netze und alle angehängten Tumorzellen leicht von der Platte entfernt werden indem Sie Medien einfach in die Vertiefungen.
Der entscheidende Schritt in die Adhäsion-Assay ist die Inkubationszeit der Co-Kultur mit der Tumorzellen. Fünf Minuten sind ausreichend für Tumorzellen binden an die Netze. Unter den experimentellen Bedingungen, wenn Sie die Lösung mit Tumorzellen, die 6-Well-Platte hinzufügen machen alle Tumorzellen Körperkontakt mit den Netto-Strukturen an der Unterseite der Platte gebildet. Jedoch Kultivierung Co für eine längere Periode (z. B. länger als 10 Minuten) führt die Bindung von Tumorzellen zu LDN oder Poly-L-Lysin Substrate. Daher sollte die Inkubationszeit kurz, spezifische Bindung an die Netze zu erkennen sein. Das Manövrieren der sanften Reinigung ist ein weiterer wesentlicher Punkt. Wir haben langsam hinzufügen die erwärmten Medien von der Seitenwand eines jeden gut, sanft schwingen die Platte, und entfernen Sie den Überstand mit einer Absauganlage sichergestellt. Da Netze an die Platte schwach halten, sollte dieser Prozess in eine besonders vorsichtige Art und Weise durchgeführt werden.
Diese Technik unterstreicht die Tatsache, dass ein anderer molekularen Mechanismus für Tumorzellen binden an Netze innerhalb von Minuten, als benötigt wird, die in eine Adhäsion Assay mit einem ~ 30-60 Minuten Inkubation gezeigt, dass NET12,13Aktien. Blockieren Experimente mit dieser Methode kann die detaillierte molekularen Mechanismen aufzuklären, in denen echte Netze verschiedener Materialien fangen. Eine Einschränkung dieser Technik ist jedoch, dass der Waschvorgang unterschiedlich sein kann, wenn der Klebstoffen Interaktionen zwischen Netzen und Tumor-Zellen in Vivoauftreten. In der klinischen Einstellung ist die Dichte von Tumorzellen wesentlich niedriger als die verwendet in diesem Protokoll, die eine weitere Einschränkung darstellen können.
Time-lapse video-Analyse ist sehr nützlich für die Überwachung der Ergebnisse der verschiedenen zelluläre Ereignisse über einen Zeitraum von Tagen. Die gesamte Zelle View-System verwenden, zeigen wir, dass Netze allmählich abgebaut werden, vermutlich durch DNAse enthalten im Serum, während MKN45 durch Netze Start danach kräftig vermehren gefangen. Dieses Video zeigte nur die Aufteilung der Tumorzellen beigeordnete Netze, kein Vergleich zu MKN45 an der Platte befestigt. Kontaminierte Neutrophils und der zusätzlichen nuklearen Färbung Farbstoff können auch das Wachstum der Tumorzellen beeinträchtigt haben. Daher konnten wir keinen bestimmten Abschluss über die Nettoeffekte Netze auf das Tumorwachstum Zelle ziehen. Diese Analyse zeigt jedoch an, dass Tumorzellen durch die Netze nicht getötet werden und können in der Tat Überleben nach Einschluss von Netzen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Frau J. Shinohara und I. Nidda für technische und kirchliche Arbeit. Wir danken auch, DRS. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina und Kazuya Takahashi für ihre Zusammenarbeit zur Probe Akquisition im OP-Saal. Diese Arbeit wurde durch eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft, Sport und Kultur von Japan und der Japan Society zur Förderung der Wissenschaften (17 K 10606) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
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