पेरिटोनियल लेवेज द्रव मध्यस्थता ट्यूमर सेल विकास और लगाव से प्राप्त कम घनत्व न्यूट्रोफिल द्वारा उत्पन्न न्युट्रोफिल Extracellular जाल
Summary
यहां, हम एक विधि वर्तमान में मानव कम घनत्व न्यूट्रोफिल (LDN), पश्चात पेरिटोनियल लेवेज द्रव से बरामद, बड़े पैमाने पर न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल) और कुशलता से जाल मुक्त ट्यूमर कोशिकाओं है कि बाद में बढ़ने का उत्पादन ।
Abstract
सक्रिय न्यूट्रोफिल रिलीज न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल), जो कब्जा और रोगाणुओं को नष्ट कर सकते हैं । हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि जाल विभिन्न रोग प्रक्रियाओं में शामिल हैं, जैसे स्व-प्रतिरक्षित रोग, घनास्त्रता, और ट्यूमर मेटास्टेसिस. यहां, हम इन विट्रो तकनीक में एक विस्तृत दिखाने के लिए मुक्त ट्यूमर कोशिकाओं है, जो जाल के लिए लगाव के बाद बढ़ने के ट्रैपिंग के दौरान शुद्ध गतिविधि का पता लगाने । सबसे पहले, हम रोगियों जो laparotomies से गुजरा पश्चात पेरिटोनियल लेवेज द्रव से कम घनत्व न्यूट्रोफिल (LDN) एकत्र की । अल्पकालिक संवर्धन LDN के बड़े पैमाने पर शुद्ध गठन है कि हरी फ्लोरोसेंट परमाणु और गुणसूत्र counterstain के साथ visualized था परिणामस्वरूप । मानव गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों MKN45, OCUM-1, और NUGC-4 जाल के साथ की सह-मशीन के बाद, कई ट्यूमर कोशिकाओं जाल से फंस गए थे । बाद में मोह पूरी तरह DNase के साथ जाल के क्षरण से निष्प्रभाव था I. समय-चूक वीडियो से पता चला है कि ट्यूमर के जाल से फंसे कोशिकाओं को मरना नहीं था, लेकिन बजाय एक सतत संस्कृति में जोरदार वृद्धि हुई । इन विधियों जाल और कोशिकाओं और सामग्री के विभिंन प्रकार के बीच चिपकने वाला बातचीत का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
Polymorph परमाणु न्यूट्रोफिल रक्त संचारित में आम तौर पर घनत्व ढाल तैयारी विधि के माध्यम से mononuclear कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं । तथापि, कुछ न्यूट्रोफिल के रूप में जाना जाता कम घनत्व न्यूट्रोफिल (LDN), CD11b के साथ (+), CD15 (+), CD16 (+), और CD14 (-) phenotypes, सह रहे है mononuclear कोशिकाओं के साथ शुद्ध । LDN की सापेक्ष संख्या में कई रोग की स्थिति में बढ़ जाती है जिसमें स्व-प्रतिरक्षित रोग1,2, पूति3और कर्क4,5शामिल हैं । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि LDN6न्यूट्रोफिल के एक phenotypically और कार्यात्मक विशिष्ट वर्ग हैं । यह ध्यान देने योग्य है कि रक्त परिचालित में LDN अधिक न्युट्रोफिल extracellular जाल (जाल) सामान्य घनत्व न्यूट्रोफिल2,7से उत्पादन की संभावना है । जाल न्यूक्लिक एसिड से बना संरचनाओं की तरह वेब हैं, histones,, और दानेदार और cytosolic प्रोटीन, और वे कुशलतापूर्वक entrap और नष्ट कर सकते है8रोगजनकों ।
हाल ही में, जाल न केवल रोगाणुओं पर कब्जा करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन यह भी प्लेटलेट्स और परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं जो थक्का गठन9 और ट्यूमर मेटास्टेसिस10,11में सहायता कर सकते हैं । हालांकि, जाल और प्लेटलेट्स या ट्यूमर कोशिकाओं के बीच चिपकने वाला बातचीत के पीछे आणविक तंत्र अभी भी अस्पष्ट हैं । हाल ही में, एक इन विट्रो में आसंजन परख पता चला कि माइलॉयड ल्यूकेमिया कोशिकाओं (K56212) और फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं (A54913) β1 और β3 integrins के माध्यम से जाल को देते हैं । लेखकों न्यूट्रोफिल से अलग शुद्ध स्टॉक का इस्तेमाल किया और phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) द्वारा सक्रिय आसंजन सब्सट्रेट14के रूप में । हालांकि इस परख न्यूट्रोफिल के अभाव में शुद्ध घटकों के साथ वास्तविक बातचीत का पता लगाने की अनुमति देता है, यह यकीनन है कि “सेल मुक्त शुद्ध स्टॉक” उच्च गति केंद्रापसारक द्वारा अलग है आणविक संरचना में उत्पादित जाल को बरकरार रखती है vivo. हाल ही में, हमने पाया है कि पेट की सर्जरी के बाद पेरिटोनियल लेवेज द्रव कई परिपक्व LDN, जो बड़े पैमाने पर जाल उत्पंन और पेरिटोनियल मेटास्टेसिस15के कारण ट्यूमर कोशिकाओं से जुड़ी निहित । इस अध्ययन में, हम सफलतापूर्वक किसी भी शारीरिक हेरफेर के बिना बरकरार जाल के लिए ट्यूमर कोशिकाओं के आसंजन की जांच की । यहां, हम जाल और मुक्त ट्यूमर कोशिकाओं के बीच चिपकने वाला बातचीत का पता लगाने के लिए एक तकनीक का विवरण दिखाते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले अध्ययनों से सूचित किया है कि परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं vivo10,11में नेट सब्सट्रेट द्वारा फंस जा सकता है । मेटास्टेटिक स्तन कैंसर कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए दिखाया …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
तकनीकी और लिपिकीय कार्य के लिए हम सुश्री जे. Shinohara और Nieda का धन्यवाद करते हैं. इसके अलावा, हम डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । Shiro मात्सुमोतो, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina, और Kazuya ताकाहाशी ऑपरेटिंग कमरे में नमूना अधिग्रहण के लिए उनके सहयोग के लिए । यह काम शिक्षा के मंत्रालय, विज्ञान, खेल, और जापान की संस्कृति और विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (17K10606) से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए एक अनुदान में सहायता द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
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