Summary
Qui, presentiamo un metodo in cui i neutrofili a bassa densità umani (LDN), recuperati dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatoria, producono massicce trappole extracellulari del neutrofilo (reti) e intrappolano efficientemente le cellule del tumore libero che successivamente crescono.
Abstract
Attiva i neutrofili rilascio dei neutrofili extracellulare trappole (reti), che possono catturare e distruggere i microbi. Studi recenti suggeriscono che le reti siano coinvolti nei vari processi di malattia, quali le metastasi del tumore, la trombosi e la malattia autoimmune. Qui, ci mostra una tecnica dettagliata in vitro per rilevare attività netto durante l'intrappolamento delle cellule del tumore libero, che si sviluppano dopo allegato ai NETs. In primo luogo, abbiamo raccolto i neutrofili a bassa densità (LDN) dal liquido di lavaggio peritoneale postoperatorio da pazienti sottoposti a laparotomie. Coltura a breve termine di LDN provocato dalla massiccia formazione netta che è stato visualizzato con verde fluorescente nucleare e colorante di contrasto del cromosoma. Dopo co-incubazione di linee cellulari di cancro gastrico umano MKN45, OCUM-1 e NUGC-4 con le reti, molte cellule del tumore erano intrappolate dai NETs. Successivamente, l'allegato completamente è stata abrogata dal degrado delle reti con dnasi I. Time-lapse video ha rivelato che le cellule del tumore intrappolate dalle reti non è morto ma invece è cresciuta vigorosamente in una cultura di continua. Questi metodi possono essere applicati alla rilevazione di interazioni adesive tra reti e vari tipi di cellule e materiali.
Introduction
Neutrofili nucleari polimorfo nel sangue circolante in genere sono separati dalle cellule mononucleari attraverso il metodo di preparazione gradienti di densità. Tuttavia, alcuni neutrofili conosciuti come i neutrofili a bassa densità (LDN), con i fenotipi di CD11b(+), CD15(+), CD16(+) e CD14(-), sono co-purificati con cellule mononucleari. Il numero relativo di LDN aumenta significativamente in varie condizioni patologiche tra cui malattie autoimmuni1,2, sepsi3e cancro4,5. Gli studi precedenti hanno dimostrato che LDN sono una classe fenotipico e funzionalmente distinta di neutrofili6. Dovrebbe essere notato che LDN nel sangue circolante sono più probabilità di produrre trappole extracellulari del neutrofilo (reti) di densità normale neutrofili2,7. Le reti sono web-come strutture composte di acidi nucleici, istoni, proteasi e proteine citosoliche e granulare, e in modo efficiente possono intrappolare e distruggere gli agenti patogeni8.
Recentemente, le reti hanno dimostrate di catturare non solo i microbi, ma anche le piastrine e cellule tumorali che possono assistere all'embolo formazione9 e tumore metastasi10,11circolanti. Tuttavia, i meccanismi molecolari dietro le interazioni adesive tra reti e piastrine o le cellule del tumore sono ancora poco chiari. Più recentemente, un'analisi di adesione in vitro hanno rivelato che le cellule di leucemia mieloide (K56212) e cellule di carcinoma del polmone (A54913) alleghino alle reti tramite le integrine β1 e β3. Gli autori hanno usato stock netto isolato dai neutrofili e attivato da phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) come il substrato di adesione14. Anche se questo test permette di individuare i reali interazioni con componenti netti in assenza di neutrofili, è discutibile se il "cell-free stock netto" isolato mediante centrifugazione ad alta velocità mantiene la struttura molecolare identica ai NETs prodotto in vivo. Recentemente, abbiamo trovato quel liquido di lavaggio peritoneale dopo chirurgia addominale conteneva molti LDN maturo, che generò massicce reti e attaccato alle cellule del tumore che causano metastasi peritoneali15. In questo studio, abbiamo esaminato con successo l'adesione delle cellule del tumore ai NETs intatto senza alcuna manipolazione fisica. Qui, indichiamo i dettagli di una tecnica per rilevare interazioni adesive tra le reti e le cellule del tumore libero.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LDN sono stati ottenuti da pazienti arruolati in questo studio e sono stati approvati dalla istituzionale recensione Consiglio di Jichi Medical University.
1. isolamento di LDN dalla cavità addominale lavande e rilevamento netto
- Acquisizione del campione
- Infondere 1.000 mL di normale soluzione salina sterile direttamente nella cavità addominale prima della chiusura della ferita in pazienti sottoposti a chirurgia addominale a causa di malignità gastrointestinale.
Nota: I campioni sono stati ottenuti da pazienti che hanno subito una gastrectomia, colectomia o esofagectomia senza pregiudizi basati sull'età o sesso. Soluzione salina è stato trasferito in un contenitore e versato in tutto l'addome entro un minuto. Questo è effettuato ordinariamente come un lavaggio peritoneale postoperatorio senza significativi effetti sui pazienti. - Lavaggio della cavità addominale estesamente per almeno 1 min.
Nota: È consigliabile che il fluido infuso lentamente si agita con le mani del chirurgo affinché i campioni siano uniformi. - Recuperare 200 mL di liquido di lavaggio con quattro siringhe da 50 mL.
Nota: A volte un connettore di gomma è usato per prendere i fluidi.
- Infondere 1.000 mL di normale soluzione salina sterile direttamente nella cavità addominale prima della chiusura della ferita in pazienti sottoposti a chirurgia addominale a causa di malignità gastrointestinale.
- Eseguire la purificazione di LDN peritoneale usando del granulocyte mAb specifici, CD66b16.
Nota: Poiché lo strato intermedio dopo centrifugazione in gradiente di densità contiene molte cellule mononucleari, selezione positiva dei neutrofili polimorfo utilizzando CD66b mAb è stato effettuato.- Trasferire il liquido di lavaggio peritoneale per un tubo da 50 mL.
Nota: In questo passaggio, passare i fluidi attraverso un filtro di nylon 100 µm per rimuovere le impurità. - Centrifugare il fluido peritoneale a 270 x g per 7 minuti a TA.
- Risospendere il pellet in 5 mL di PBS con EDTA 0.02%.
- Sovrapposizione con attenzione i 5 mL di sospensione cellulare su una soluzione di gradienti di densità 3 mL.
- Centrifugare a 1.700 x g per 15 min a RT senza pause.
- Raccogliere i ~ 2-3 mL di soluzione contenente gli strati intermedi (Figura 1A) usando una pipetta e mescolare con 10 mL di PBS con EDTA 0.02%.
- Centrifugare il liquido peritoneale a 400 x g per 7 min a RT e scartare il surnatante.
- Aggiungere un altro 10 mL di PBS con 0,02% EDTA e centrifugare a 270 x g per 7 min a RT. scartare il surnatante.
- Sciogliere il pellet cellulare (1 x 107) in 60 µ l di tampone per il kit di separazione magnetica delle cellule.
- Aggiungere 20 µ l di blocco Fc per il pellet e incubare per 10 min a 4 ° C.
- Aggiungere 20 µ l di anti-CD66b coniugato con microsfere e incubare per altri 10 min a 4 ° C.
- Lavare e risospendere il pellet in 500 µ l di tampone di MACS.
- Applicare la sospensione cellulare a una colonna magnetica del campo magnetico di un separatore magnetico adatto e raccogliere il flusso continuo contenenti CD66b(-) celle di colonna con 15 mL di tampone di lavaggio.
- Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e sciacquare immediatamente le cellule CD66b(+) magneticamente con etichetta premendo saldamente lo stantuffo nella colonna.
Nota: La popolazione delle cellule di CD66b(+) consiste principalmente di neutrofili come determinato mediante analisi Citofluorimetrica indicando che > 95% della frazione CD66(+) sono positivi per CD11b, CD15 e CD16, ma la negazione per CD14.
- Trasferire il liquido di lavaggio peritoneale per un tubo da 50 mL.
- Generazione di reti
- Dopo centrifugazione a 270 x g per 7 min a RT, Risospendere la LDN isolata (5 x 106) in 1 mL di RPMI1640 con 10% FCS.
- Cultura la LDN su un piatto rivestito di poli-L-lisina 6-pozzetti (6 cm di diametro) per 2 ore a 37 ° c 5% CO2.
- Aggiungere il colorante di contrasto fluorescente verde (un colorante membrana impermeabile per il nucleo e cromosomi) alla concentrazione finale di 5 µM.
- Immediatamente osservare la morfologia delle reti (i componenti del DNA extracellulare espulsi da LDN sotto microscopia a fluorescenza).
2. colorazione delle cellule del tumore con tintura di Linker cella fluorescente rosso
- Preparare il cancro umano linee cellulari MKN45, NUGC e OCUM-1.
- Lavare 1 x 107 cellule con PBS + 0,02% EDTA in una provetta da 15 mL e centrifugare a 270 x g per 7 minuti a TA.
- Aggiungere 1 mL di soluzione per tintura di macchiatura per il pellet e pipettare delicatamente.
- Sciogliere 4 µ l di colorante rosso fluorescente cella Linker in 1 mL di soluzione per la macchiatura e mescolare con la sospensione cellulare dal punto 2.2.
- Incubare i pellet per 4 minuti a TA.
- Aggiungere 4 mL di DMEM (10% FBS) per interrompere la reazione di macchiatura.
- Centrifugare 270 x g per 7 min e scartare il surnatante.
- Ripetere due volte i passaggi 2.6 e 2.7.
- Controllare con un microscopio a fluorescenza (eccitazione = 551 nm, che emettono = 567 nm) che le cellule del tumore sono macchiate di rosso.
3. analisi di adesione delle cellule del tumore ai NETs
- Risospendere le cellule di tumore macchiato fluorescente rosso (1 x 106) in 1 mL di RPMI 1640 completati con 0.1% BSA.
- Aggiungere le cellule del tumore per la cultura LDN che ha prodotto le reti come descritto al punto 1.3.
- Incubare per 5 min a 37 ° c, che permette alle cellule del tumore di contattare le reti.
Nota: Lunga incubazione induce adesione delle cellule del tumore per LDN o le piastre. - Rimuovere il supporto e lavare delicatamente i pozzetti aggiungendo 2 mL di media preriscaldata (0.1% BSA + RPMI 1640) e il piatto di turbine.
- Ripetere due volte la procedura di lavaggio al punto 3.4.
Nota: Poiché le reti debolmente collegare alla piastra, lavaggio dovrebbe essere fatto nel modo più delicato possibile per evitare la rimozione delle reti stesse. - Aggiungere il colorante fluorescente verde per la colorazione del nucleo e cromosomi ad una concentrazione finale di 5 µ g/mL per la visualizzazione delle reti.
- Osservare le reti e attaccato le cellule del tumore usando i filtri appropriati (verde, eccitazione = 504 nm, che emettono = 523 nm; rosso, eccitazione = 551 nm, che emettono = 567 nm).
- Unire le cifre per mostrare le cellule del tumore che sono intrappolate dai NETs.
Nota: In alcuni esperimenti, enzima di degradazione del DNA è stato aggiunto alla cultura LDN (concentrazione finale di 100 U/mL) 5 min prima del co-incubazione per 5 min.
4. time Lapse Video analisi delle cellule del tumore intrappolati
- Cultura la LDN peritoneale in un 35 mm tondo piatto rivestito con poli-L-lisina come descritto al punto 1.3.
- Aggiungere il colorante fluorescente verde per la colorazione del nucleo e cromosomi per visualizzare le reti come descritto al punto 1.3.
- Dopo 1 min di incubazione, rimuovere il supporto e aggiungere 2 mL di 0.1% BSA + RPMI 1640.
- Rimuovere il supporto e aggiungere non colorati 1 x 106 MKN45 cellule sospese in 0,1% BSA + RPMI 1640. Incubare per 5 min a RT.
- Rimuovere tutte le cellule del tumore non collegato lavando delicatamente come descritto al punto 3.4 e aggiungere DMEM con 10% FCS completati con 100 u/mL penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina.
- Montare la piastra di coltura in un sistema di osservazione di tutta la vista cellulare e selezionare il campo appropriato nel quale tumore le cellule sono intrappolate dai NETs.
- Continuare a co-cultura per altri 2 giorni e scattare foto continue del campo ogni 6 min sotto luce normale e fluorescenza, che rileva le cellule MKN45 e reti, rispettivamente.
- Sovrapporre le immagini a ogni timepoint e costruire time-lapse video utilizzando il software Image Viewer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nella cultura 2 ore, LDN CD66b(+) derivata da lavaggio peritoneale fluido stringa ha mostrato strutture colorate con colorante verde fluorescente per nucleare e cromosoma (Figura 1B), mentre CD66b(-) cellule mononucleari non ha fatto (Figura 1). Tuttavia, quando le culture LDN sono state pretrattate con 100 U/mL dnasi I, la caratteristica struttura è stato distrutta (Figura 1), che indica che sono stati composti di DNA extracellulare espulso dai neutrofili. Quando LDN sono state coltivate su piatti di plastica senza rivestimento, molti cluster NET galleggianti in media sono stati osservati, con poche reti sul fondo (Figura 1E).
Successivamente, per esaminare l'adesione delle varietà di cellula tumore ai NETs, MKN45 cellule etichettate con colorante fluorescente rosso erano aggiunto ai NETs e co-incubate per 5 minuti. Dopo il lavaggio delicato, MKN45 molte cellule sono state trovate allegata (Figura 2A e 2C). Al contrario, pochi MKN45 cellule attaccate quando LDN sono stati pretrattati con dnasi I (Figura 2B e 2C). La figura risultante ha mostrato chiaramente che una maggioranza delle cellule MKN45 annesso erano co-localizzati con reti, viste come strutture formate sul fondo della piastra (Figura 2D). Modelli di adesione simili sono stati osservati con OCUM-1 e NUGC-4 (Figura 2E e 2F).
Dal momento che le reti hanno dimostrate di essere citotossici ai batteri, abbiamo quindi esaminato se le cellule del tumore intrappolati da die reti o sopravvivere in una co-coltura continua utilizzando video time-lapse. È interessante notare che, mentre le reti sono sparito gradualmente entro alcune ore, le cellule MKN45 intrappolati dai NETs ha iniziato a proliferare vigorosamente in seguito (Video 1).
Figura 1: formazione netta dopo la cultura di LDN peritoneale. (A) dopo centrifugazione di pendenza di densità del fluido di lavaggio postoperatoria, cellule recuperate dal livello intermedio sono mostrate. (B) quindi, LDN CD66b(+) erano separati dalle cellule mononucleari CD66b(-) e coltivate su piastre 6 pozzetti poli-L-lisina, seguite dalla aggiunta di colorante colorazione nucleare e immediata osservazione con microscopia di fluorescenza. (C) lo stesso numero di cellule mononucleari di CD66b(-) sono stato coltivato nelle stesse condizioni. (D) dello strato monomolecolare la LDN è stato incubato con dnasi I per 5 minuti prima di macchiatura nucleare. (E) CD66b(+) LDN sono state coltivate su piatti di plastica senza rivestimento. Barre bianche rappresentano 100 µm. Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: adesione del tumore le cellule ai NETs. (A) peritoneale LDN sono state coltivate su poli-L-lisina 6-pozzetti piastre per 2 h, che ha prodotto enormi reti. Si aggiunsero poi rosso MKN45 marcato con fluoresceina. Dopo un'incubazione di 5 minuti, non attaccate le cellule sono stati rimossi per capi delicati e restanti cellule del tumore sono state osservate con un microscopio a fluorescenza. (B) prima dell'aggiunta di MKN45, il monostrato LDN è stato pretrattato con dnasi I per esperimenti (A) e (B), il numero di cellule MKN45 allegate per 5 min (C) fossi contato in 3 campi aleatori sotto il microscopio di fluorescenza e media ± SD è stato espresso. (D) dopo il lavaggio delicato, verde colorante fluorescente per nucleare e cromosoma è stato aggiunto per la co-cultura. Nei campi rappresentativi, di strutture annesse MKN45 e NET sono state scattate utilizzando filtri di appropriata lunghezza d'onda ottica, e le due figure sono state fuse. Gli stessi esperimenti eseguiti in (D) sono stati effettuati anche per OCUM-1 (E) e NUGC-4 (F). Barre bianche rappresentano 100 µm. Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione15. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: comportamento post-adesione delle cellule del tumore intrappolati. LDN sono state coltivate su poli-L-lisina 6-pozzetti piastre per 2 ore, e formazione netta è stata confermata dalla tintura verde fluorescente per nucleare e cromosoma. Quindi, non macchiate MKN45 cellule erano aggiunto e co-incubate per 5 minuti, e cellule non collegate sono stati rimossi con il lavaggio delicato e ha continuate ad essere co-coltivate in 10% FCS + DMEM. Utilizzando un sistema di osservazione di vista tutta la cellula, aree dove le cellule del tumore sono state intrappolate da reti sono state cercate. Fotografie del campo sono state poi prese ogni 6 minuti sotto la luce normale e fluorescenza, che abilitati cifre chiare delle cellule del tumore e reti, rispettivamente. Infine, le immagini sono state sovrapposte con software del Visualizzatore di immagini e un video time lapse è stato creato a una velocità superiore di 3600 x a in tempo reale. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gli studi precedenti hanno segnalato che cellule tumorali circolanti possono essere intrappolati dal netto substrati in vivo10,11. Cellule di carcinoma mammario metastatico sono state indicate per stimolare i neutrofili e indurre la formazione di reti, che assiste nella crescita delle cellule del tumore nell' organo bersaglio17. Inoltre, abbiamo trovato che colture di breve durata di LDN dal fluido di lavaggio postoperatorio prodotto massicce reti che potrebbero intrappolare efficientemente le cellule del tumore senza ulteriore stimolazione15. Queste osservazioni suggeriscono un ruolo possibile per meccanica coinvolgimento delle reti nel processo metastatico. Tuttavia, i meccanismi molecolari dettagliati che mediano interazioni adesive tra le reti e le cellule del tumore è ancora chiaro. Studi recenti hanno implicato il coinvolgimento dell'integrina in questo processo attraverso l'uso di stock netto isolato da neutrofili attivati che servono come il substrato di adesione12,13. Tuttavia, purificate e concentrate componenti di reti sono dovuto in gran parte diverse strutture molecolari dalle reti originale. In confronto, il nostro metodo utilizza reti intatte senza manipolazione fisica, che è un forte vantaggio quando si esaminano i meccanismi dettagliati di interazioni adesive con reti. Con questa semplice tecnica, i ricercatori in grado di rilevare l'allegato specifico di molte cellule del tumore ai NETs rapidamente (entro 5 min).
La caratteristica più importante del protocollo è l'uso di una piastra rivestita di poli-L-lisina per correggere le strutture nette sul fondo della piastra. Quando intatti piatti di plastica sono stati utilizzati per la coltura LDN, solo poche reti sono state rilevate nella parte inferiore. Inoltre, molti mazzi di verde-positivi sono stati osservati come galleggiano liberamente nel mezzo di coltura, quando avrebbero dovuto essere distaccate dalla piastra (Figura 1). Inoltre abbiamo esaminato la formazione netta su piastre rivestite con collagene, fibronectina e laminina, che ha permesso l'individuazione di web-come le strutture nello strato inferiore. Tuttavia, le reti sono sembrato allegare ai substrati meno strettamente di poli-L-lisina, ed essi erano facilmente staccati dalla procedura di lavaggio. Di conseguenza, queste altre opzioni sono insufficienti per analisi di adesione. Infatti, se usiamo piastre senza rivestimenti di poli-L-lisina, reti e tutte le cellule del tumore associata possono diventare facilmente rimosso dalla piastra aggiungendo semplicemente la media dei pozzetti.
Il passaggio fondamentale nell'analisi della adesione è il periodo di incubazione della co-coltura con le cellule del tumore. Cinque minuti è sufficiente per le cellule tumorali da associare ai NETs. Sotto le condizioni sperimentali, quando si aggiunge la soluzione contenente le cellule del tumore alla piastra 6-pozzetti, tutte le cellule del tumore fare contatto fisico con il nette strutture formate nella parte inferiore della piastra. Tuttavia, co-coltura per un risultati più a lungo periodo (ad esempio, più di 10 minuti) nell'associazione delle cellule del tumore per LDN o substrati di poli-L-lisina. Di conseguenza, il tempo di incubazione dovrebbe essere breve per rilevare il legame specifico con le reti. Le manovre di lavaggio delicato è un altro punto essenziale. Abbiamo fatto in modo di aggiungere lentamente i media riscaldati dalla parete laterale di ogni bene, delicatamente oscillare la piastra e rimuovere il surnatante con un aspiratore. Poiché le reti bastone alla piastra debolmente, questo processo deve essere eseguito in maniera particolarmente prudente.
Questa tecnica evidenzia il fatto che è necessario un meccanismo molecolare diverso per le cellule tumorali in associazione a reti in pochi minuti, rispetto che mostrato in un test di adesione con un'incubazione di ~ 30-60 minuti per NET le scorte12,13. Bloccando gli esperimenti usando questo metodo può delucidare i meccanismi molecolari dettagliati in cui le reti reali intrappolano vari materiali. Tuttavia, una limitazione di questa tecnica è che il processo di lavaggio può essere diversa se le interazioni adesive si verificano tra reti e di cellule del tumore in vivo. In ambito clinico, la densità delle cellule del tumore è molto inferiore a quella utilizzata nel presente protocollo, che può presentare un'altra limitazione.
Analisi video time-lapse sono altamente utile per monitorare i risultati dei vari eventi cellulari per un periodo di giorni. Utilizzando il sistema di visualizzazione di cellule intere, mostriamo che le reti sono gradualmente degradate, presumibilmente da DNasi contenuta nel siero, mentre MKN45 intrappolati da inizio di reti a proliferare vigorosamente da allora in poi. Questo video ha mostrato soltanto la divisione delle cellule del tumore attaccate a reti, con nessun confronto a MKN45 fissato alla piastra. Neutrofili contaminati e la tintura di macchiatura nucleare aggiunta può avere influenzato anche la crescita delle cellule del tumore. Pertanto, noi potremmo non disegnare una conclusione definita per quanto riguarda gli effetti netti delle reti sulla crescita delle cellule del tumore. Tuttavia, questa analisi indicano che le cellule del tumore non vengono uccisi dai NETs e infatti possono sopravvivere dopo allettamento da reti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo Sig. ra J. Shinohara e I. Nieda per il lavoro di tecnico e di segreteria. Inoltre, ringraziamo la d. ssa Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina e Kazuya Takahashi per la loro collaborazione per l'acquisizione del campione in sala operatoria. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per la ricerca scientifica dal Ministero dell'istruzione, scienza, sport e cultura del Giappone e della Japan Society per la promozione della scienza (17K 10606).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
