Summary
Her presenterer vi en metode der menneskelige lav nøytrofile (LDN), utvinnes fra postoperativ peritoneal lavage væske, produsere massive nøytrofile ekstracellulære feller (nett) og effektivt felle gratis kreftceller som senere vokser.
Abstract
Aktivert nøytrofile utgivelsen nøytrofile ekstracellulære feller (nett), som kan fange og ødelegge mikrober. Nyere studier tyder på at garn er involvert i ulike sykdommer prosesser, som autoimmun sykdom, blodpropp og svulst metastaser. Her viser vi en detaljert i vitro -teknikk for å oppdage netto aktivitet under fangst av gratis kreftceller, som vokser etter vedlegg til garn. Først samlet vi lav tetthet nøytrofile (LDN) fra postoperativ peritoneal lavage væske fra pasienter som gjennomgikk laparotomies. Kortsiktige dyrking av LDN resulterte i massive netto formasjon som var visualisert med grønne fluorescerende kjernefysiske og kromosom counterstain. Etter co inkubasjonstiden for menneskelig magekreft cellelinjer MKN45 og OCUM-1 NUGC-4 med garn, ble mange kreftceller fanget av garn. Deretter vedlegget ble helt avskaffet av nedbrytning av garn med DNase I. Time-lapse video avslørt at kreftceller fanget av garn ikke dø, men i stedet vokste kraftig i en kontinuerlig kultur. Disse metodene kan brukes til deteksjon av selvklebende interaksjoner mellom garn og ulike typer celler og materialer.
Introduction
Polymorph kjernefysiske nøytrofile i sirkulerende blod er vanligvis atskilt fra mononukleære celler gjennom metoden tetthet gradert forberedelse. Det er imidlertid noen nøytrofile kjent som lav nøytrofile (LDN), med CD11b(+), CD15(+), CD16(+) og CD14(-) fenotyper, co renset med mononukleære celler. Den relative antallet LDN øker betraktelig i ulike pathological betingelser inkludert autoimmune sykdommer1,2, sepsis3og kreft4,5. Tidligere studier har vist at LDN er en svært og funksjonelt klasse av nøytrofile6. Det bør bemerkes at LDN i sirkulerende blod er mer sannsynlig å produsere nøytrofile ekstracellulære feller (nett) enn normal tetthet nøytrofile2,7. Nettene er web-lignende strukturer består av atomer syren, histones, proteaser og detaljert og cytosolic proteiner, og de kan effektivt lure og ødelegge patogener8.
Garn har nylig vist å fange ikke bare mikrober, men også blodplater og sirkulerende kreftceller som kan hjelpe til blodpropp dannelse9 og tumor metastaser10,11. Men er molekylære mekanismer bak selvklebende samspillet mellom garn og blodplater eller tumorceller fortsatt uklart. Flere nylig, i vitro vedheft analysen viste at myelogen leukemi cellene (K56212) og lunge karsinom (A54913) knytter til nett via β1 og β3 integrins. Forfatterne brukt NET lager isolert fra nøytrofile og aktivert av phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) som vedheft substrat14. Selv om denne analysen oppdages av ekte interaksjon med netto komponenter i fravær av nøytrofile, er det arguable om de "cell-free NET lager" isolert av høyhastighets sentrifugering beholder den molekylære strukturen identisk garn produsert i vivo. Nylig fant vi at peritoneal lavage væske etter abdominal kirurgi inneholdt mange eldre LDN, som genererte enorme garn og knyttet til kreftceller forårsaker peritoneal metastaser15. I denne studien undersøkte vi vellykket vedheft av kreftceller til intakt garn uten fysisk manipulasjon. Her viser vi detaljer om en teknikk for å oppdage selvklebende interaksjoner mellom garn og gratis kreftceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LDN ble innhentet fra pasienter i denne studien, og ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styret av Jichi Medical University.
1. isolering av LDN fra bukhulen Lavages og netto gjenkjenning
- Prøven oppkjøp
- Tilfører 1000 mL av normal sterilt saltvann direkte i bukhulen før såret nedleggelse i pasienter som har gjennomgått abdominal kirurgi på grunn av gastrointestinal kreft.
Merk: Eksempler Hentet fra pasienter som gjennomgikk en gastrectomy, colectomy eller esophagectomy uten bias basert på alder eller kjønn. Saline ble overført til en beholder og helles i hele magen innen ett minutt. Dette utføres rutinemessig som en postoperative peritoneal vask uten betydelig effekt på pasienter. - Lavage bukhulen mye til minst 1 min.
Merk: Det anbefales at infundert væsken er langsomt rørt med kirurgens hender slik at prøvene er ensartet. - Gjenopprette 200 mL lavage væske med fire 50 mL-sprøytene.
Merk: Noen ganger en gummi-kontakt til å ta opp væsker.
- Tilfører 1000 mL av normal sterilt saltvann direkte i bukhulen før såret nedleggelse i pasienter som har gjennomgått abdominal kirurgi på grunn av gastrointestinal kreft.
- Utfør rensing av peritoneal LDN bruker granulocytt bestemt mAb, CD66b16.
Merk: Ettersom det mellomliggende laget etter tetthet gradert sentrifugering inneholder mange mononukleære celler, positiv utvalg av polymorph nøytrofile bruker CD66b mAb ble utført.- Overføre peritoneal lavage væske til en 50 mL tube.
Merk: I dette trinnet kan du passere væsker gjennom en 100 µm nylon filteret fjerner urenheter. - Sentrifuge peritoneal væsken 270 x g i 7 min på RT.
- Resuspend pellets i 5 mL av PBS med 0,02% EDTA.
- Nøye overlegg 5 mL av cellen suspensjon på en 3 mL tetthet gradert løsning.
- Sentrifuge 1700 x g i 15 min på RT uten pauser.
- Høste det ~ 2-3 mL løsning som inneholder de mellomliggende lag (figur 1A) bruker en pipette, og bland det med 10 mL PBS med 0,02% EDTA.
- Sentrifuge peritoneal væsken 400 x g i 7 min på RT og kast nedbryting.
- Legge til en annen 10 mL PBS med 0,02% EDTA og sentrifuger 270 x g i 7 min på RT. Forkast nedbryting.
- Løses celle pellet (1 x 107) i 60 µL bufferen for magnetisk celle separasjon kit.
- Legge til 20 µL av Fc blokk pellets og ruge i 10 min på 4 ° C.
- Legge til 20 µL av anti-CD66b konjugert med microbeads og ruge for en ekstra 10 minutter på 4 ° C.
- Vask og re avbryte pellets 500 µL Mac bufferen.
- Cellen suspensjon gjelder en magnetisk kolonne i det magnetiske feltet i egnet magnetiske skilletegn og samle gjennomflytsenhet inneholder CD66b(-) cellene ved å vaske kolonnen med 15 mL bufferen.
- Fjern kolonnen fra magnetiske skilletegnet og umiddelbart skylle ut magnetisk merket CD66b(+) cellene ved å skyve stempelet fast i kolonnen.
Merk: CD66b(+) cell befolkningen består hovedsakelig av nøytrofile etter FACS analyse som angir at > 95% av CD66(+) brøk er positivt for CD11b, CD15 og CD16, men negativt for CD14.
- Overføre peritoneal lavage væske til en 50 mL tube.
- Generasjon av garn
- Etter sentrifugering 270 x g i 7 min på RT, å suspendere den isolerte LDN (5 x 106) i 1 mL av RPMI1640 med 10% FCS.
- Kultur LDN på en 6-vel poly-L-lysine belegg plate (6 cm diameter) for 2t på 37 grader i 5% CO2.
- Legge den grønne fluorescerende counterstain (en membran-ugjennomtrengelig fargestoff stain kjernen og chromosomes) på den endelige konsentrasjonen av 5 µM.
- Umiddelbart observere morfologi av garn (de ekstracellulære DNA-komponentene utvist fra LDN under fluorescens mikroskopi).
2. flekk av kreftceller med røde fluorescerende celle koblingsfunksjonalitet fargestoff
- Forberede menneskets kreftcelle linjer MKN45, NUGC og OCUM-1.
- Vask 1 x 107 celler med PBS + 0.02% EDTA i en 15 mL tube og sentrifuger 270 x g i 7 min på RT.
- Legg 1 mL av løsning for fargestoffet flekker med pellets, og Pipetter forsiktig.
- Oppløse 4 µL Red fluorescerende celle koblingsfunksjonalitet fargestoff i 1 mL av løsning til farging og bland med cellen suspensjon fra trinn 2.2.
- Inkuber pellets for 4 min på RT.
- Legge til 4 mL DMEM (10% FBS) å stoppe flekker reaksjonen.
- Sentrifuge 270 x g i 7 min og kast nedbryting.
- Gjenta trinn 2.6 og 2.7 to ganger.
- Sjekk med fluorescens mikroskop (eksitasjon = 551 nm, emitting = 567 nm) at kreftceller er farget rødt.
3. analyse av Tumor celle vedheft til garn
- Nytt suspendere røde fluorescerende farget kreftceller (1 x 106) i 1 mL av RPMI 1640 supplert med 0,1% BSA.
- Legge til kreftceller LDN kulturen som produserte garn som beskrevet i trinn 1.3.
- Inkuber i 5 min på 37 grader, som gir kreftceller kontakte garn.
Merk: Lang incubation induserer svulst celleadhesjon LDN eller platene. - Fjern mediet og forsiktig vaske brønnene ved å legge 2 mL prewarmed media (0,1% BSA + RPMI 1640) og virvler parabolen.
- Gjenta vask i trinn 3.4 to ganger.
Merk: Siden garn svakt feste til platen, vask bør gjøres så forsiktig som mulig for å unngå fjerning av garn seg. - Legge til grønne fluorescerende farge for farging av kjernen og kromosomer i en siste konsentrasjon av 5 µg/mL for visualisering av garn.
- Observere garn og festet tumorceller bruke riktige filtre (grønn, eksitasjon = 504 nm, emitting = 523 nm, rød, eksitasjon = 551 nm, emitting = 567 nm).
- Flette tallene for å vise kreftceller som er fanget av garn.
Merk: I noen eksperimenter, DNA fornedrelse enzym lagt til LDN kultur (siste konsentrasjon 100 U/ml) 5 min før co inkubasjonstiden for 5 min.
4. tid Lapse Video analyse av fanget kreftceller
- Kultur i peritoneal LDN i 35 mm runde parabolen belagt med poly-L-lysine som beskrevet i trinn 1.3.
- Legge til grønne fluorescerende farge for farging av kjernen og kromosomene visualisere garn som beskrevet i trinn 1.3.
- Etter 1 min med inkubering, Fjern media og legge 2 mL 0,1% BSA + RPMI 1640.
- Fjern media og legge unstained kvinne 1 x 106 MKN45 celler suspendert i 0,1% BSA + RPMI 1640. Inkuber i 5 min på RT.
- Fjern alle ledige kreftceller ved å vaske forsiktig som beskrevet i trinn 3.4 og legge DMEM med 10% FCS supplert med 100 u/mL Penicillin og 100 µg/mL streptomycin.
- Montere kultur parabol i en utsikt over hele cellen overvåkingssystem og velg det aktuelle feltet i som tumor celler er fanget av garn.
- Fortsette å co kultur for ytterligere 2 dager og ta kontinuerlig bilder av feltet hver 6 min under vanlig lys og fluorescens, som oppdager MKN45 celler og garn, henholdsvis.
- Sammenligne med bildene på hver timepoint og konstruere time-lapse videoer med Image seer programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I 2-timers kulturen, CD66b(+) LDN avledet fra peritoneal lavage væske viste streng strukturer farget med grønt-fluorescerende farge for kjernefysiske og kromosom (figur 1B), mens CD66b(-) mononukleære celler ikke (figur 1 c). Men når LDN kulturer ble forbehandlet med 100 U/mL DNase jeg, karakteristiske strukturen var ødelagt (figur 1 d), som indikerer at de var sammensatt av ekstracellulære DNA utvist fra nøytrofile. Når LDN ble kultivert på plast-plater uten belegg, mange netto klynger flytende i ble media observert, noen garn på bunnen (figur 1E).
Neste, for å undersøke vedheft av svulst celle linjene til garn, MKN45 celler merket med rød fluorescerende farge ble lagt til garn og co ruges i 5 minutter. Etter milde vasking, mange MKN45 celler ble funnet tilkoblet (figur 2A og 2 C). Derimot MKN45 cellene knyttet når LDN var forbehandlet med DNase I (figur 2B og 2 C). Flettede figuren tydelig viste at et flertall av de tilknyttede MKN45 cellene var samlokalisert med garn, sett på som strukturer dannet på bunnen av platen (figur 2D). Lignende vedheft mønstre ble observert med OCUM-1 og NUGC-4 (figur 2E og 2F).
Siden garn har vist seg å være cytotoksiske for bakterier, vi deretter undersøkt om kreftceller fanget av garn dør eller overleve i en kontinuerlig co kultur med time-lapse video. Interessant, mens garn skrittvis forsvant i flere timer, MKN45 cellene fanget av garn begynte å spre kraftig etterpå (Video 1).
Figur 1: NET dannelsen etter kulturen av peritoneal LDN. (A) etter tetthet gradert sentrifugering postoperativ lavage væske, celler fra mellomliggende laget vises. (B) deretter CD66b(+) LDN var atskilt fra CD66b(-) mononukleære celler og kultivert på poly-L-lysine belagt 6-og plater, etterfulgt av kjernefysiske flekker fargestoff tillegg og umiddelbar observasjon med fluorescens mikroskopi. (C) samme antall CD66b(-) mononukleære celler ble kultivert under like forhold. (D) The LDN monolayer ble inkubert med DNase jeg i 5 minutter før kjernefysiske farging. (E) CD66b(+) LDN ble kultivert på plast-plater uten belegg. Hvite feltene representerer 100 µm. Dette tallet ble endret fra en tidligere publikasjon15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: vedheft av tumor celler til garn. (A) Peritoneal LDN ble kultivert på poly-L-lysine belagt 6-vel plater for 2 h, som produserte massive garn. Rød fluorescein-merkede MKN45 ble deretter lagt. Etter en 5-minutters inkubasjon ledige celler ble fjernet ved mild vask og gjenværende kreftceller ble observert under fluorescens mikroskop. (B) før en MKN45, var LDN monolayer forbehandlet med DNase jeg for 5 min. (C) eksperimenter (A) og (B), antall vedlagte MKN45 celler ble talt, i 3 tilfeldig feltene under fluorescens mikroskopet og mener ± SD ble uttrykt. (D) etter milde vasking, grønn fluorescerende farge for kjernefysiske og kromosom ble lagt til co kultur. Bilder av tilknyttede MKN45 og netto strukturer ble tatt med passende optisk bølgelengde filtre representant felt, og de to tallene ble slått sammen. Den samme eksperimenter utført i (D) ble også utført for OCUM-1 (E) og NUGC-4 (F). Hvite feltene representerer 100 µm. Dette tallet ble endret fra en tidligere publikasjon15. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: etter vedheft virkemåten til fanget kreftceller. LDN ble kultivert på poly-L-lysine belagt 6-og plater i 2 timer og netto formasjon ble bekreftet av grønne fluorescerende farge for kjernefysiske og kromosom. Deretter unstained kvinne MKN45 celler ble lagt til og co ruges i 5 minutter, og ledige celler ble fjernet av mild vask og fortsatte å co kultivert i 10% FCS + DMEM. Bruke en utsikt over hele cellen observasjon systemet, var områder hvor kreftceller ble fanget av garn søkte på. Fotografier av feltet ble deretter tatt hver 6 minutter under vanlig lys og fluorescens, som gjorde klart figurer av kreftceller og garn, henholdsvis. Endelig bildene ble lagt med Image seer programvare, og en tid lapse video ble opprettet med en 3600 x høyere hastighet enn sanntid. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidligere studier har rapportert at sirkulerende kreftceller kan overlappes i netto underlag i vivo10,11. Metastatisk brystkreft celler har vist seg å stimulere nøytrofile og indusere dannelsen av garn, som hjelper i svulst cellevekst i målet orgel17. I tillegg fant vi at kortsiktige kulturer av LDN fra postoperativ lavage væsken produsert massiv garn som kunne effektivt lure kreftceller uten ytterligere stimulering15. Disse observasjonene foreslår en mulig rolle for mekanisk involvering av garn i metastatisk prosessen. Detaljert molekylære mekanismer som megle selvklebende samspillet mellom garn og kreftceller er imidlertid uklart. Nyere studier har innblandet involvering av integrin i denne prosessen ved hjelp av NET lager isolert fra aktivert nøytrofile tjene som vedheft substrat12,13. Imidlertid renset og konsentrert garn komponenter skal har hovedsakelig forskjellige molekylære strukturer fra opprinnelige garn. Sammenligning bruker vår metoden intakt garn uten fysisk manipulasjon, som er en sterk fordel når undersøke detaljerte mekanismer av selvklebende interaksjon med garn. Med denne enkle teknikken finner forskere bestemte vedlegg til mange kreftceller til garn raskt (innen 5 min).
Den viktigste funksjonen av protokollen er bruken av en poly-L-lysine belegg plate å fikse netto strukturer nederst på platen. Når intakt plast platene ble brukt for LDN kultur, oppdaget bare noen garn nederst. Videre, mange grønne-positive klynger ble observert som fritt flytende i kultur media, når de skal har vært løsrevet fra platen (figur 1 d). Vi har også undersøkt netto formasjon på platene belagt med kollagen, fibronectin og laminin, som gjorde oppdagelsen av web-lignende strukturer i det nederste laget. Men garn syntes å knytte til substrater mindre tett enn å poly-L-lysine, og de var lett løsrevet av vask. Derfor er disse andre alternativene utilstrekkelig for vedheft analyser. Faktisk, hvis vi bruker plater uten poly-L-lysine belegg, kan garn og alle tilknyttede kreftceller bli lett fjernes fra platen ved å legge til medier fordelt.
Det kritiske trinnet i vedheft analysen er inkubasjonstiden av co kultur med kreftceller. Fem minutter er tilstrekkelig for kreftceller binde til garn. Under eksperimentelle forhold, når du legger løsningen som inneholder kreftceller til 6-vel plate, gjøre alle kreftceller fysisk kontakt med netto strukturer dannet nederst på platen. Imidlertid dyrking co for en lengre periode (f.eks lenger enn 10 minutter) resultater i binding av kreftceller LDN eller poly-L-lysine underlag. Derfor skal inkubasjon tiden kort til å oppdage bestemte binding til garn. Manøvrering av mild vask er et annet viktig punkt. Vi sørget sakte legge varmet media fra sideveggen av hver Vel, forsiktig svinger platen og fjerne nedbryting med en aspirator. Siden garn pinne til platen svakt, bør denne prosessen utføres på en særlig forsiktig måte.
Denne teknikken fremhever det faktum at en annen molekylær mekanisme kreves for kreftceller binding til garn minutter enn som vist i vedheft analysen med en ~ 30-60 minutter inkubasjon nettet aksjer12,13. Blokkerer eksperimenter ved hjelp av denne metoden kan belyse detaljert molekylære mekanismer som ekte garn felle ulike materialer. En begrensning av denne teknikken er imidlertid at vaskeprosessen kan variere når limet samhandlingene oppstår mellom garn og tumor celler i vivo. I klinisk setting er tetthet av kreftceller mye lavere enn det som brukes i denne protokollen, som kan presentere en annen begrensning.
Time-lapse video analyse er svært nyttig for å overvåke resultatene av ulike mobilnettet hendelser over en periode av dager. Bruker hele-celle visning systemet, viser vi at garn er gradvis degradert, antagelig ved DNAse finnes i serum, mens MKN45 fanget av garn start å spre kraftig etterpå. Denne videoen bare viste delingen av kreftceller festet til nett, med ingen sammenligning MKN45 knyttet til plate. Forurenset nøytrofile og ekstra kjernefysiske flekker fargestoff kan har også påvirket veksten av kreftceller. Derfor kan vi ikke trekke en klar konklusjon netto effekt av garn på svulst cellevekst. Denne analysen indikerer imidlertid at kreftceller ikke blir drept av garn og kan faktisk overleve etter entrapment av garn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Ms. J. Shinohara og I. Nieda for tekniske og geistlige. Også takker vi Dr. Shiro Matsumoto, Hidenori Haruta, Kentaro Kurashina og Kazuya Takahashi for deres samarbeid for prøven oppkjøp i operasjonssalen. Dette arbeidet ble støttet av en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning fra departementet for utdanning, vitenskap, sport, og kultur i Japan og Japan Society for fremme av vitenskap (17K 10606).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
