Summary
Здесь мы представляем метод, в котором low-density нейтрофилов человека (LDN), оправился от послеоперационных перитонеальный лаваж жидкости, производят массовые нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки) и эффективно ловушки бесплатно опухолевых клеток, которые впоследствии растут.
Abstract
Активация нейтрофилов освобождение нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), которые могут захватить и уничтожить микробов. Последние исследования показывают, что сети участвуют в различных процессах болезни, например, аутоиммунные заболевания, тромбоз и опухолевых метастаз. Здесь мы покажем подробный в vitro технику для выявления чистой активности во время треппинга бесплатно опухолевых клеток, которые растут после присоединения к сети. Во-первых мы собрали низкой плотности нейтрофилов (LDN) от послеоперационных перитонеальный лаваж жидкости из пациентов, перенесших лапаротомию. Краткосрочные культивирования LDN привели к массовым NET формирования, который был визуализирован с зеленый люминесцентной ядерных и хромосомы изображение. После совместного инкубации линий клеток человека рак желудка, MKN45, OCUM-1 и NUGC-4 с сеткой Нетс были ловушку многие опухолевых клеток. Впоследствии вложение был полностью отменен, деградация сетей с DNase I. Time-lapse видео показали, что клетки опухоли, захваченных Нетс не умрет, но вместо энергично вырос в непрерывной культуры. Эти методы могут применяться для обнаружения клей взаимодействия сетей и различных видов клеток и материалов.
Introduction
Превращение ядерной нейтрофилов в циркулирующей крови обычно отделяются от мононуклеарных клеток через метод подготовки градиента плотности. Однако некоторые нейтрофилов, известный как low-density нейтрофилов (LDN), с CD11b(+), CD15(+), CD16(+) и CD14(-) фенотипов, совместной очищенную с мононуклеарных клеток. Относительное количество LDN значительно увеличивается при различных патологических состояниях, включая аутоиммунные заболевания1,2, сепсис3и рак4,5. Предыдущие исследования показали, что LDN являются фенотипически и функционально собственный класс6нейтрофилы. Следует отметить, что LDN в циркулирующей крови чаще производить нейтрофилов внеклеточного ловушки (сетки), чем нормальной густоты нейтрофилов2,7. Нетс веб как структуры, состоящий из нуклеиновых кислот, гистонов, протеаз и гранулированных и цитозольной белков, и они могут эффективно завлечь и уничтожить патогенов8.
Недавно было показано сеток захватить не только микробы, но и тромбоцитов и циркулирующих клеток опухоли, которые могут помочь в тромба формирования9 и опухолевых метастаз10,11. Однако молекулярные механизмы за клей взаимодействия сетей и тромбоцитов или опухолевых клеток по-прежнему неясны. Совсем недавно в пробирке адгезии assay показали, что клетки миелоидного лейкоза (12K562) и клетки карциномы легких (13A549) придают сетей через β1 и β3 интегринов. Авторы использовали чистых запасов изолированы от нейтрофилов и активированную phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) как субстрат адгезии14. Хотя этот assay позволяет определение реальных взаимодействий с чистой компонентами в отсутствие нейтрофилов, это спорный ли «клеток свободный чистых запасов» изолированные высокоскоростной центрифугированием сохраняет молекулярной структурой, идентичной сетки производится в VIVO. Недавно мы нашли что перитонеальный лаваж жидкости после абдоминальной хирургии содержатся многие пожилые LDN, который генерируется массивные сеток и придает опухолевых клеток, вызывая перитонеальных метастазов15. В этом исследовании мы успешно изучили адгезию опухолевых клеток с нетронутыми сеток без каких-либо физических манипуляций. Здесь мы показать детали техники для обнаружения клей взаимодействия сетей и бесплатные опухолевых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LDN были получены от пациентов, зачисленных в этом исследовании и были одобрены организационного обзора Совет Jichi медицинского университета.
1. изоляция LDN из брюшной полости смывов и чистой обнаружения
- Приобретение образца
- Влить 1000 мл стерильным физиологическим непосредственно в брюшную полость до закрытия раны в пациентов, которые подверглись абдоминальной хирургии вследствие злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта.
Примечание: Образцы были получены от пациентов, перенесших гастрэктомия, колэктомия или esophagectomy без предвзятости, на основании возраста или пола. Солевой раствор был переведен в контейнер и выливают в весь живот в течение одной минуты. Обычно это выполняется как послеоперационных перитонеальный стиральные без значительного воздействия на пациентов. - Промывание брюшной полости широко для по крайней мере 1 мин.
Примечание: Рекомендуется, что заваренного жидкость медленно перемешивают руками хирурга так что образцы являются однородными. - Восстанавливает 200 мл жидкости промывания с четырьмя 50 мл-шприцы.
Примечание: Иногда резиновый соединитель используется для занять жидкости.
- Влить 1000 мл стерильным физиологическим непосредственно в брюшную полость до закрытия раны в пациентов, которые подверглись абдоминальной хирургии вследствие злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта.
- Выполнение очистки перитонеальный LDN, используя конкретные МАБ гранулоцитов, CD66b16.
Примечание: Поскольку промежуточного слоя после плотность градиентного центрифугирования содержит много мононуклеарных клеток, положительный выбор полиморф нейтрофилов, используя CD66b МАБ была выполнена.- Передать перитонеальный лаваж жидкость 50 мл трубки.
Примечание: В этот шаг, передайте жидкости через 100 мкм Нейлоновый фильтр для удаления примесей. - Центрифуга перитонеальной жидкости на 270 g x 7 мин на RT.
- Ресуспензируйте гранулы в 5 мл PBS с 0,02% ЭДТА.
- Тщательно наложение 5 мл суспензии клеток на 3 мл раствора градиент плотности.
- Центрифуга на 1700 x g 15 мин на RT без каких-либо перерывов.
- Урожай ~ 2-3 мл раствора, содержащего промежуточных слоев (рис. 1A) с помощью пипетки и смешайте его с 10 мл PBS с 0,02% ЭДТА.
- Центрифуга перитонеальной жидкости при 400 g x 7 мин на RT и удалить супернатант.
- Добавьте еще 10 мл PBS с 0,02% ЭДТА и центрифуги на 270 g x 7 мин на RT. удалить супернатант.
- Растворяют в 60 мкл буфера для комплекта разделения магнитных ячейки ячейки Пелле (1 x 10-7).
- 20 мкл ФК блока для гранул и проинкубируйте втечение 10 мин при 4 ° C.
- Добавить 20 мкл анти CD66b с микрошарики и инкубировать еще 10 мин при 4 ° C.
- Вымойте и вновь приостановить гранулы в 500 мкл буфера MACS.
- Применить суспензию клеток к столбцу магнитные в магнитном поле подходящие магнитного сепаратора и собирать потока через содержащих CD66b(-) клетки путем промывания столбец с 15 мл буфера.
- Удалите столбец из магнитного сепаратора и немедленно промыть магнитно помечены CD66b(+) клетки, твердо толкает поршень в столбце.
Примечание: Популяции клеток CD66b(+) состоит в основном из нейтрофилов определяется анализ СУИМ, показывая, что > 95% CD66(+) фракции являются позитивными для CD11b, CD15 и CD16, но негативные для CD14.
- Передать перитонеальный лаваж жидкость 50 мл трубки.
- Генерация сеток
- После центрифугирования в 270 g x 7 мин на RT, вновь приостановить изолированных LDN (5 x 10-6) в 1 мл раствора RPMI1640 с 10% FCS.
- Культура LDN на тарелку с покрытием 6-ну поли L-лизин (6 см в диаметре) за 2 ч при 37 ° c в 5% CO2.
- Добавьте Зеленый флуоресцентный изображение (мембраны непроницаемый краситель пятно на ядро и хромосом) в конечной концентрации 5 мкм.
- Сразу же наблюдать морфология сеток (внеклеточной ДНК компоненты, изгнаны из LDN под микроскопии флуоресцирования).
2. окрашивание опухолевых клеток с красной флуоресцентной клеток компоновщика краска
- Подготовка человеческих раковых клеток линии MKN45, NUGC и OCUM-1.
- Вымыть 1 x 107 клеток с PBS + 0,02% ЭДТА в 15 мл трубки и центрифуги на 270 x g 7 мин на RT.
- Добавить 1 мл раствора для окраски гранул красителя и Пипетка осторожно.
- Распустить 4 мкл люминесцентные клеток компоновщика красного красителя в 1 мл раствора для окрашивания и смешать с суспензию клеток от шаге 2.2.
- Инкубировать гранулы для 4 мин на RT.
- Добавить 4 мл DMEM (10% FBS) остановить окрашивание реакции.
- Центрифуга 270 g x 7 мин и удалить супернатант.
- Повторите шаги, 2.6 и 2.7 дважды.
- Проверить с флуоресцентным микроскопом (возбуждения = 551 Нм, испуская = 567 Нм) что опухолевые клетки являются пятнами красного.
3. анализ опухоли клеточной адгезии к сеткам
- Вновь приостановите красных флуоресцентных окрашенных опухолевых клеток (1 x 10-6) в 1 мл RPMI 1640 с 0,1% BSA.
- Добавьте опухолевые клетки LDN культуру, которая производится Нетс, как описано в шаге 1.3.
- Инкубируйте 5 минут при 37 ° c, что позволяет опухолевых клеток связаться Нетс.
Примечание: Длительный инкубационный вызывает опухоли клеточной адгезии LDN или пластины. - Удаление среды и осторожно Промыть лунки, добавив 2 мл подогретую СМИ (0,1% BSA + RPMI 1640) и закрученной блюдо.
- Повторите процедуру стиральная в шаге 3.4 дважды.
Примечание: Поскольку сеток слабо прикрепить к пластине, Стиральная должно быть сделано мягко, как можно избежать удаления самих сетей. - Добавьте зеленый флуоресцентные краски для окрашивания ядра и хромосом в конечной концентрации 5 мкг/мл для визуализации сетей.
- Наблюдение за сетями и придает опухолевых клеток, используя соответствующие фильтры (зеленый, возбуждения = 504 нм, испуская = 523 Нм; красный, возбуждения = 551 Нм, испуская = 567 Нм).
- Слияние цифры, чтобы показать опухолевых клеток, которые оказались в ловушке в сети.
Примечание: В некоторых экспериментах, фермент деградации ДНК был добавлен в культуре LDN (конечная концентрация 100 ед/мл) 5 мин до совместного инкубации за 5 мин.
4. время Замедленная съемка видео анализ захваченных опухолевых клеток
- Культура перитонеальный LDN в 35 мм круглый блюдо с поли L-лизин, как описано в шаге 1.3 покрытием.
- Добавьте зеленый флуоресцентные краски для окрашивания ядра и хромосом для визуализации сетей, как описано в шаге 1.3.
- После 1 мин инкубации удалите средства массовой информации и добавить 2 мл 0,1% BSA + RPMI 1640.
- Удалите средства массовой информации и добавить что безупречная 1 x 10-6 MKN45 клетки приостановлено в 0,1% BSA + RPMI 1640. Инкубируйте 5 мин на RT.
- Удалите все неприсоединенные опухолевых клеток, аккуратно мыть как описано в шаге 3.4 и добавьте DMEM с 10% FCS, дополненная 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл.
- Маунт культуры блюдо в целом представление ячейки наблюдения системы и выберите соответствующее поле, в котором опухоли клетки попали в сети.
- Продолжать совместно культура еще 2 дня и непрерывной фотографировать поля каждые 6 мин под нормальный свет и флуоресценции, который обнаруживает клетки MKN45 и сетки, соответственно.
- Наложения изображения на каждом timepoint и построить промежуток времени видео с помощью программы просмотра изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В 2-х часовой культуре, CD66b(+) LDN, производные от перитонеальный лаваж жидкости показал строку структуры окрашенных с Грин Люминесцентная краска для ядерной и хромосомы (рис. 1B), при этом мононуклеарных клеток не CD66b(-) (рис. 1 c). Однако, когда LDN культур были предварительно обработанных с 100 ед/мл DNase I, характерная структура была разрушена (рис. 1 d), указав, что они состояли из внеклеточной ДНК, изгнаны из нейтрофилов. Когда LDN были культивированный на пластиковые пластины без покрытия, многие сети кластеров, плавающие в СМИ были замечены, с несколько сеток на дне (Рисунок 1E).
Далее для изучения адгезию опухолевых клеток линий сеток, MKN45 клетки, помечены красной флуоресцентных красителей были добавлены к сети и совместно инкубировали в течение 5 минут. После нежной стирки, многие MKN45 клетки были найдены прилагается (рисунок 2A и 2 C). Напротив, несколько MKN45 клетки придают когда LDN были предварительно обработанных с DNase I (Рисунок 2B и 2 C). Объединенные фигура ясно показал, что большинство вложенных MKN45 клетки были совместно локализованных с сетки, как структуры, сформированные в нижней части пластины (Рисунок 2D). Аналогичные тенденции адгезии были замечены с OCUM-1 и NUGC-4 (Рисунок 2E и 2F).
Поскольку сети было показано, быть цитотоксических бактерий, мы затем рассмотрены ли опухолевых клеток в ловушке сетей умирают или выжить в непрерывное сотрудничество культуры с помощью покадровой видео. Интересно, что в то время как сети постепенно исчезли в течение нескольких часов, MKN45 клетки ловушке сетей начали размножаться энергично потом (1 видео).
Рисунок 1: NET формирования после культуры перитонеальный LDN. (A) после плотность градиентного центрифугирования послеоперационной промывание жидкости, показываются оправился от промежуточного слоя клеток. (B) затем, CD66b(+) LDN были отделены от CD66b(-) мононуклеарных клеток и культивировали на поли L-лизин 6-ну пластины с покрытием, следуют ядерной окрашивание добавлением красителя и непосредственных наблюдений с микроскопии флуоресцирования. (C) такое же количество CD66b(-) мононуклеарных клеток были культивированный на тех же условиях. (D) LDN монослой был инкубировали с DNase я за 5 минут до ядерных окрашивания. (E) CD66b(+) LDN были культивированный на пластиковые пластины без покрытия. Белые бары представляют 100 мкм. Эта цифра была изменена с предыдущей публикации15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: адгезию опухолевых клеток в сети. (A) перитонеальный LDN были культивированный на поли L-лизин пластины с покрытием 6-хорошо для 2 h, который производится массовый сеток. Затем были добавлены красный MKN45, меченного флюоресцеином. После 5 минут инкубации дно клетки были удалены нежной стирки, и оставшиеся опухолевые клетки были замечены под флуоресцентным микроскопом. (B) перед добавлением MKN45, LDN монослой был предварительно обработанных с DNase, я за 5 минут (C) в экспериментах (A) и (B), количество вложенных MKN45 клеток были подсчитаны в 3 случайных полей под флуоресцентным микроскопом и средний ± SD была выражена. (D) после мытья нежные, зеленый Люминесцентную краску для ядерной и хромосомы был добавлен в сотрудничестве культуры. В представительных областях были сделаны фотографии вложенных структур MKN45 и NET, используя соответствующие волны оптических фильтров, и были объединены две фигуры. Же эксперименты, проведенные в (D) проводились также для OCUM-1 (E) и NUGC-4 (F). Белые бары представляют 100 мкм. Эта цифра была изменена с предыдущей публикации15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1: поведение после прилипания захваченных опухолевых клеток. LDN были культивированный на поли L-лизин 6-ну пластины с покрытием на 2 часа, и чистой формирования было подтверждено зеленый Люминесцентную краску для ядерной и хромосомы. Безупречная MKN45 клетки были добавлены и совместно инкубировали в течение 5 минут, затем неприсоединенной клетки были удалены нежный промывкой и продолжали совместно культивируемых в 10% FCS + DMEM. С помощью системы наблюдения целом вид клеток, районы, где опухолевые клетки были захваченных Нетс были искали. Фотографии поля были затем приняты каждые 6 минут при нормальной света и флуоресценции, что позволило четкие показатели опухолевых клеток и сетей, соответственно. Наконец изображения были наложены с программным обеспечением для просмотра изображений, и промежуток времени видео был создан на 3600 x большей скоростью, чем в реальном времени. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Предыдущие исследования сообщили, что циркулирующих клеток опухоли могут быть захваченных чистой подложки в естественных условиях10,11. Метастатическим груди раковых клеток было показано для стимуляции нейтрофилов и стимулировать формирование сетей, который помогает в рост опухолевых клеток в целевой органа17. Кроме того мы обнаружили, что краткосрочные культур LDN от послеоперационных промывание жидкости производится массивные сеток, которые могут эффективно завлечь опухолевых клеток без дальнейшего стимулирования15. Эти наблюдения предполагают возможной роли для механических участия в процессе метастатического сеток. Однако подробные молекулярные механизмы, которые клей взаимодействие между сетями и опухолевых клеток до сих пор неясно. Недавние исследования замешаны участие Интегрин в этот процесс благодаря использованию чистых запасов, изолированных от активированные нейтрофилы, которые служат адгезии подложке12,13. Однако очищенная и концентрированные компоненты сети должны иметь во многом различных молекулярных структур от оригинальной сетки. В сравнении наш метод использует нетронутыми сеток без физические манипуляции, который является сильным преимуществом при рассмотрении подробных механизмов клей взаимодействия с сетями. С этой простой техники исследователи могут обнаружить конкретную приверженность многих опухолевых клеток сетки быстро (в течение 5 мин).
Наиболее важной особенностью протокола является использование поли L-лизин покрытием пластины исправить чистых структур на нижней пластине. Когда нетронутыми пластиковые пластины были использованы для культуры, LDN, только несколько сеток были обнаружены в нижней. Кроме того многие кластеры Грин позитивные были замечены как свободно плавающих в культуре средств массовой информации, когда они должны были оторваны от пластины (рис. 1 d). Мы также рассмотрели NET формирования на пластины, покрытые коллаген, фибронектин и Ламинин, что включено обнаружение веб подобные структуры в нижнем слое. Однако Нетс, как представляется, придают субстратов менее плотно к поли L-лизин, и они были легко отсоединяется Стиральная процедурой. Таким образом эти параметры являются недостаточными для адгезии анализов. В самом деле если мы используем пластин без покрытия поли L-лизин, сеток и любых вложенных опухолевые клетки могут стать легко удалены от плиты, просто добавив средства массовой информации к скважинам.
Важным шагом в assay адгезии является инкубационный период совместного культуры с опухолевых клеток. Пять минут достаточно для опухолевых клеток для привязки к сети. В экспериментальных условиях, при добавлении раствора, содержащего опухолевые клетки к пластине 6-Ну все опухолевые клетки делают физический контакт с чистой структурами, сформированные в нижней части пластины. Однако, совместного культивирования для длительного периода (например, более 10 минут) результаты в привязке опухолевых клеток LDN или поли L-лизин субстратов. Таким образом время инкубации должно быть коротким, чтобы обнаружить конкретные привязки к сети. Маневрирование нежной стирки-это еще один важный момент. Мы убедились, медленно добавить утепленные СМИ от боковой стенке каждого хорошо, осторожно поверните пластину и удалить супернатант с аспиратором. Поскольку сети придерживаться пластины слабо, этот процесс должен производиться особенно осторожным образом.
Эта техника подчеркивается тот факт, что различные молекулярный механизм необходим для опухолевых клеток, привязка к сети в течение нескольких минут, чем что показано в assay адгезии с ~ 30-60 минут инкубации NET акции12,13. Блокируют экспериментов с помощью этого метода можно выяснить подробные молекулярные механизмы, в которых реальная сеток ловушки различные материалы. Однако ограничением этой методики является, что процесс стирки может отличаться, когда клей взаимодействия происходят между сетками и опухолевых клеток в естественных условиях. В клинических условиях, плотность клеток опухоли гораздо ниже, чем используемые в настоящем Протоколе, который может представить другое ограничение.
Покадровой видео анализ является очень полезным для мониторинга результатов различных клеточных мероприятий в течение дней. С помощью системы поклеточного мнение, мы покажем, постепенно деградировавших сеток, предположительно в результате DNAse, содержащихся в сыворотке крови, тогда как в сети начинают размножаться энергично после ловушку MKN45. Это видео показали только разделение опухолевых клеток, придает сетки, с ни в какое сравнение с MKN45 прикреплены к плите. Загрязненных нейтрофилов и добавил ядерной окрашивание красителем может также повлияли на рост опухолевых клеток. Таким образом мы не могли привлечь определенный вывод относительно чистого эффекта сетки на рост опухолевых клеток. Однако этот анализ показывают, что опухолевые клетки не убили сетки и в действительности может выжить после захвата сеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим г-жа J. Shinohara и I. Nieda для технического и канцелярской работы. Кроме того мы благодарим Drs. Shiro Мацумото, Hidenori Харута, Кентаро Kurashina и Кадзуя Такахаси за их сотрудничество в целях приобретения образца в операционной комнате. Эта работа была поддержана целевые субсидии для проведения научных исследований от министерства образования, науки, спорта и культуры Японии и японского общества для содействия развитию науки (17K 10606).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare, SWEDEN | 17-1440-02 | |
| StraightFrom™ Whole Blood CD66b MicroBeads | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-104-913 | |
| Fc block | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-059-901 | |
| MACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-091-376 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-041-306 | |
| MACS Magnetic Separator | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | 130-042-501 | |
| SYTOX green nucleic acid stain 5mM solution in DMSO | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | S7020 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9691 | |
| Diluent C | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | CGLDIL | |
| RPMI1640 Medium | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | R8758 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium-high glucose (DMEM) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D5796 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | D8537 | |
| 0.5mol/l-EDTA Solution (pH 8.0) | nacalai tesque, Japan | 06894-14 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | gibco by life technologies, Mexico | 10437-028 | |
| Bovine Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | A2153 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies Japan | 15140-122 | |
| Plasmocin Prophylactic | InvivoGen, San Diego, CA-USA | ant-mpp | |
| DNase I | Worthington, Lakewood NJ) | LS002138 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 6Well | IWAKI, Japan | 4810-040 | |
| Poly-L-Lysine-Coated MICROPLATE 24Well | IWAKI, Japan | 4820-040 | |
| fluorescein stereomicroscope | BX8000, Keyence, Osaka Japan | BZ-X710 | |
| Whole view cell observation system | Nikon, Kanagawa, Japan | BioStudio (BS-M10) | |
| MKN45 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| NUGC-4 human gastric cancer cell line | Riken, Tukuba Japan | N/A | |
| OCUM-1 human gastric cancer cell line | Osaka City University, Japan | N/A | Gift from Dr. M.Yashiro |
References
- Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis and Rheumatology. 29 (11), 1334-1342 (1986).
- Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. The Journal of Immunology. 184 (6), 3284-3297 (2010).
- Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low density subpopulations and CD10 (CALLA) negative neutrophils in severely infected patients. Surgery Today. 22 (4), 322-327 (1992).
- Schmielau, J., Finn, O. J. Activated granulocytes and granulocyte-derived hydrogen peroxide are the underlying mechanism of suppression of t-cell function in advanced cancer patients. Cancer Research. 61 (12), 4756-4760 (2001).
- Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. Journal of Leukocyte Biology. 89 (2), 311-317 (2011).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 455-463 (2013).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Demers, M., et al. Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (32), 13076-13081 (2012).
- Cools-Lartigue, J., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis. Journal of Clinical Investigation. , (2013).
- Tohme, S., et al. Neutrophil Extracellular Traps Promote the Development and Progression of Liver Metastases after Surgical Stress. Cancer Research. 76 (6), 1367-1380 (2016).
- Monti, M., et al. Integrin-dependent cell adhesion to neutrophil extracellular traps through engagement of fibronectin in neutrophil-like cells. Public Library of Science One. 12 (2), e0171362 (2017).
- Najmeh, S., et al. Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells via beta1-integrin mediated interactions. International Journal of Cancer. 140 (10), 2321-2330 (2017).
- Najmeh, S., Cools-Lartigue, J., Giannias, B., Spicer, J., Ferri, L. E. Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
- Kanamaru, R., et al. Low density neutrophils (LDN) in postoperative abdominal cavity assist the peritoneal recurrence through the production of neutrophil extracellular traps (NETs). Scientific Reports. 8 (1), 632 (2018).
- Eades-Perner, A. M., Thompson, J., van der Putten, H., Zimmermann, W. Mice transgenic for the human CGM6 gene express its product, the granulocyte marker CD66b, exclusively in granulocytes. Blood. 91 (2), 663-672 (1998).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), 361ra138 (2016).
