हम मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं मानव एमनियोटिक झिल्ली के शीर्ष पर कल्चरित और पशु मॉडलों में भ्रष्टाचार के लिए अपनी तैयारी से व्युत्पंन रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं से बना एक रेटिना ऊतक इंजीनियर करने के लिए एक विधि का वर्णन ।
नेत्र की कई रोग स्थितियों कार्यक्षमता और/या रेटिना वर्णक उपकला (RPE) के अस्तित्व को प्रभावित. ये रेटनाइटिस pigmentosa (आरपी) और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध-पतन (AMD) के कुछ रूपों में शामिल हैं । सेल थेरेपी सबसे होनहार चिकित्सकीय इन रोगों के इलाज के लिए प्रस्तावित रणनीतियों में से एक है, पहले से ही मनुष्य में प्रारंभिक परिणामों को बढ़ावा देने के साथ । हालांकि, भ्रष्टाचार की तैयारी की विधि vivo मेंउसके कार्यात्मक परिणामों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है । दरअसल, RPE कोशिकाओं एक सेल निलंबन के रूप में भ्रष्टाचारी एक ही कोशिकाओं एक रेटिना ऊतक के रूप में प्रत्यारोपित की तुलना में कम कार्यात्मक हैं. इस के साथ साथ, हम एक सरल और reproducible विधि का वर्णन करने के लिए इंजीनियर RPE ऊतक और इसकी तैयारी में एक के लिए vivo आरोपण. मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पंन RPE कोशिकाओं को एक जैविक समर्थन पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, मानव एमनियोटिक झिल्ली (हैम) । कृत्रिम पाड़ों की तुलना में, इस समर्थन एक तहखाने झिल्ली है कि Bruch की झिल्ली के करीब है जहां अंतर्जात RPE कोशिकाओं संलग्न कर रहे है होने का लाभ है । हालांकि, इसके हेरफेर आसान नहीं है, और हम vivo मेंभ्रष्टाचार के लिए अपनी उचित संवर्धन और तैयारी के लिए कई रणनीतियों का विकास किया ।
RPE के अस्तित्व और photoreceptors के homeostasis के लिए महत्वपूर्ण है जिसके साथ यह कसकर जुड़ा हुआ है1. कई रोग की स्थिति आरपी और AMD सहित अपनी कार्यक्षमता और/
आरपी विरासत में मिला monogenic उत्परिवर्तनों कि photoreceptors या RPE कोशिकाओं या दोनों2,3के कार्यों को प्रभावित का एक समूह है । यह अनुमान है कि उत्परिवर्तनों कि विशेष रूप से प्रभावित RPE कोशिकाओं आरपी2के 5% के लिए खाते । AMD एक और शर्त है जहां RPE परत बदल गया है, केंद्रीय दृष्टि नुकसान के लिए अंततः अग्रणी । AMD आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों की जटिल बातचीत के कारण होता है और बुजुर्ग4,5,6को प्रभावित करता है । अनुमानों के अनुसार, AMD २०२०7द्वारा दुनिया भर में १९६,०००,००० रोगियों के लिए एक चिंता का विषय होगा । इन विकारों के लिए, कोई प्रभावी इलाज मौजूद है, और प्रस्तावित रणनीतियों में से एक है नई RPE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए मर/कार्यात्मक मौजूदा RPE कोशिकाओं8।
अंतिम उत्पाद के निर्माण की विधा को भ्रष्टाचारित होना करने के लिए सबसे अच्छा कार्यात्मक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । RPE कोशिकाओं को एक सेल निलंबन के रूप में इंजेक्शन, प्रसव का एक आसान और सरल तरीका होने के बावजूद, उनके अस्तित्व, एकीकरण के बारे में चिंताओं को बढ़ा, और कार्यक्षमता9,10,11,12 , 13. वैज्ञानिकों अबऔर अधिक जटिल योगों इंजीनियर रेटिना ऊतक9,13,14,15,16देने के लिए विकसित कर रहे हैं । इस संदर्भ में, हम एक मूल विधि इन विट्रो RPE ऊतक कि प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता में उत्पन्न करने के लिए विकसित9.
RPE सेल बैंकों मानव भ्रूण स्टेम (ES) कोशिकाओं से व्युत्पंन इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है । हालांकि, विभिंन सेल स्रोतों से वैकल्पिक RPE सेल बैंकों (मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल, प्राथमिक RPE कोशिकाओं, आदि) और एक अलग विधि के साथ विभेदित भी इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त हैं । यह साइटोकिंस और/या छोटे अणुओं17,18,19,20,21,22का उपयोग करते हुए भेदभाव प्रोटोकॉल निर्देशित शामिल हैं ।
प्रत्यारोपण किया जा करने के लिए, इंजीनियर ऊतक एक पाड़ पर तैयार किया जाना चाहिए । पिछले कुछ वर्षों में, विभिंन पाड़ों एक बहुलक के आधार पर या जैविक मूल के एक मैट्रिक्स पर विकसित किए गए13,23,24। यहाँ, जैविक सब्सट्रेट इस्तेमाल किया हैम है, लेकिन अन्य सब्सट्रेट, नंगा Bruch झिल्ली की तरह, लागू किया जा सकता है. यहां वर्णित विधि एक जैविक पाड़ है कि अधिक RPE देशी पर्यावरण के लिए प्रासंगिक है का उपयोग करने का लाभ है ।
मानव ES cell-व्युत्पन्न RPE कोशिकाओं को कम से 4 सप्ताह के लिए प्रसंस्कृत किया जाता है ताकि पूरी तरह से एक cobblestone monolayer के रूप में संगठित हो सके । उस चरण में, उपकला प्राप्त कार्यात्मक और ध्रुवीकरण9है. अंत में, इस ऊतक के रूप में आसानी से झुर्रियां, यह एक hydrogel वाहक की एक पतली परत में एंबेडेड इसे और अधिक कठोरता और लोच देने के लिए और इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान इसे बचाने के लिए है । यह उत्पाद तो 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है जब तक भ्रष्टाचार ।
हम एक जैविक पाड़ और पशु मॉडलों में आरोपण के लिए इसकी तैयारी पर RPE कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक विधि का वर्णन किया । प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम के एक सभी प्रक्रिया के साथ हैम के उंमुखीकरण के रखरखाव जब त?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक Jérôme Larghero और वैलेरी Vanneaux (Hôpital सेंट लुइस, पेरिस, फ्रांस) के लिए अपने इनपुट की स्थापना के दौरान यहां वर्णित विधि का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
यह काम ANR [GPiPS: ANR-२०१०-RFCS005 से अनुदान द्वारा समर्थित था; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], शौकीनों डाल ला सभ्य Médicale [जैव इंजीनियरिंग कार्यक्रम-DBS20140930777] और से LABEX पुनर्जीवित [ANR-10-LABX-७३] ओलिवर Goureau और Christelle Monville के लिए । यह NeurATRIS द्वारा समर्थित किया गया था, तंत्रिका विज्ञान में एक शोधों के लिए अनुवादात्मक अनुसंधान अवसंरचना (Investissements d’Avenir) [ANR-11-INBS-0011] और INGESTEM, राष्ट्रीय अवसंरचना (Investissements d’Avenir) इंजीनियरिंग के लिए pluripotent और विभेदित स्टेम कोशिकाएं [ANR-11-INBS-000] to Christelle Monville. करीम बेन M’Barek मंद Stempole और LABEX पुनर्जीवित [ANR-10-LABX-७३] से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । मैं स्टेम दुर्लभ रोग एसोसिएशन फ़्रांसेज़ contre लेस Myopathies (AFM)-Téléthon द्वारा समर्थित के लिए चिकित्सा संस्थान का हिस्सा है ।
Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
Pipet aid | Drummond | 75001 | |
+4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Fine scissors | WPI | 501758 | |
Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
Precision balance | Sartorius | CP225D | |
Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
Microscope | Olympus | SC30 | |
Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
culture insert | Scaffdex | C00001N | |
60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
6-well culture plates | Corning | 3506 | |
Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
Gelatin | MERCK | 104078 | |
human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |