Summary
Se describe un método para diseñar un retineano tejido compuesto de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de las células de vástago pluripotent humanas cultivadas sobre las membranas amnióticas humanas y su preparación para injerto en modelos animales.
Abstract
Varias condiciones patológicas del ojo afectan a la funcionalidad y la supervivencia del epitelio retiniano del pigmento (RPE). Estas son algunas formas de retinitis pigmentosa (RP) y degeneración macular senil (DMS). La terapia celular es una de las estrategias terapéuticas más prometedoras propuestas para curar estas enfermedades, con alentar ya resultados preliminares en seres humanos. Sin embargo, el método de preparación del injerto tiene un impacto significativo en sus resultados funcionales in vivo. De hecho, son menos funcionales que las misma células trasplantadas como un tejido retiniano células RPE injertadas como una suspensión. Adjunto, describimos un método simple y reproducible al ingeniero RPE tejido y su preparación para la implantación de una en vivo . Se siembran las células RPE derivadas de células madre pluripotentes humanas sobre un soporte biológico, la membrana amniótica humana (jamón). En comparación con andamios artificiales, este apoyo tiene la ventaja de tener una membrana del sótano que está cerca de donde se unen las células RPE endógenas la membrana de Bruch. Sin embargo, su manipulación no es fácil, y hemos desarrollado varias estrategias para su adecuado cultivo y preparación para injerto en vivo.
Introduction
RPE es crucial para la supervivencia y la homeostasis de los fotorreceptores con el cual está firmemente asociado1. Varias condiciones patológicas alteran su funcionalidad y supervivencia, incluyendo RP y AMD.
RP es un grupo de mutaciones monogénicas hereditarias que afectan a las funciones de los fotorreceptores o las células RPE o ambos2,3. Se estima que las mutaciones que afectan específicamente el RPE células representan el 5% de RP2. AMD es otra condición donde se altera la capa RPE, pérdida de visión central en última instancia a líder. AMD es causado por las interacciones complejas de factores genéticos y ambientales y afecta a los ancianos4,5,6. Según las proyecciones, AMD será un motivo de preocupación para pacientes 196 millones en todo el mundo por 20207. Para estos trastornos, no hay cura efectiva existe, y una de las estrategias propuestas es el trasplante de nuevas células RPE para compensar muerto/no funcional preexistente de las células RPE8.
El modo de formulación de los productos finales a ser injertada es esencial para asegurar los mejores resultados funcionales. Células RPE inyectadas como una suspensión, a pesar de ser un método fácil y sencillo de entrega, plantear inquietudes acerca de su supervivencia, integración y funcionalidad9,10,11,12 , 13. los científicos están preparando más formulaciones complejas para ofrecer ingeniería de tejido retiniano9,13,14,15,16. En este contexto, hemos desarrollado un método original para generar el en vitro RPE tejido que podría ser utilizado para trasplante9.
Los bancos de células RPE derivados de células madre embrionarias humanas (ES) se utilizan en el presente Protocolo. Sin embargo, la alternativa RPE célula bancos procedentes de diferentes células (células madre pluripotentes humanas, las células RPE primarias, etc.) y distinguido con un método diferente también son adecuados para este protocolo. Incluye diferenciación dirigida protocolos con citoquinas y moléculas pequeñas17,18,19,20,21,22.
Para ser trasplantado, el tejido diseñado debe estar preparado en un andamio. En los últimos años, diferentes andamios han desarrollado basado en un polímero o en una matriz de origen biológico13,23,24. Aquí, el sustrato biológico utilizado es el jamón, pero otros substratos, como membranas de Bruch denudadas, podrían ser implementados. El método descrito en el presente documento tiene la ventaja de usar un andamio biológico más relevante para el entorno nativo de RPE.
Células madre derivadas de células RPE embrionarias humanas se cultivan durante al menos 4 semanas para completamente organizado como una monocapa de adoquines. En ese momento, el epitelio obtenido es funcional y polarizado9. Por último, como este tejido se arruga fácilmente, está incrustada en una capa delgada de un portador de hidrogel para darle más rigidez y elasticidad y para protegerlo durante el procedimiento de inyección. Este producto se almacena a 4 ° C hasta el injerto.
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Protocol
Todos los materiales humanos utilizados en el presente Protocolo se utilizaron según regulaciones de la Unión Europea. La línea humana de la célula ES utilizada en este estudio se derivó de un embrión único. La pareja que había donado el embrión completamente fue informada y dio su consentimiento para una donación anónima. Una línea de células de humano ES de tipo clínico fue derivada de este embrión, bancarizada, calificada y debidamente documentada por la células de Roslin (Reino Unido). Jamones fueron procurados en condiciones estériles durante una cesárea en madres que han firmado un consentimiento informado para la donación de placenta según las pautas del hospital (APHP, Hôpital Saint Louis).
1. preparación de medios de cultivo y reactivos
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Preparación de medio de cultivo de células RPE
- Para preparar el medio de cultivo de células RPE, agregar sustituto de suero de 4% (20 mL para un volumen final de 500 mL) x 1.000 diluido 2-Mercaptoetanol (500 μl de un volumen final de 500 mL) y solución de aminoácidos no esenciales 1% Eagle′s medio esencial mínimo (MEM) (5 mL para un final volumen de 500 mL) a la glucosa alta de modificado Eagle de Dulbecco medium (DMEM) (475 mL para un volumen final de 500 mL).
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Preparación del medio de transporte y conservación
- Para preparar el medio de transporte y conservación, añadir 1% de penicilina-estreptomicina (5 mL para un volumen final de 500 mL) a CO2-medio independiente (495 mL para un volumen final de 500 mL) y guardar a 4 ° C.
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Resuspensión de la enzima thermolysin
- Preparación de solución madre de thermolysin
- Para preparar una solución madre de thermolysin, descongelar el polvo thermolysin, que se almacenó a-20 ° C, a temperatura ambiente.
- Como la actividad enzimática puede variar de lote a lote, calcular esta actividad basada en el certificado de análisis con el polvo de thermolysin del lote a utilizar. Dividir la "actividad proteasa Neutral calculado = ANPC" (indicado en el certificado de análisis) por 181 (que es el peso molecular de tirosina). El resultado obtenido corresponde a la actividad enzimática total de la thermolysin suministrado en polvo (U/vial).
- Prepare una solución de 200 U/mL añadiendo el volumen de agua correspondiente a la total actividad enzimática (U/vial) dividida por 200 (U/mL).
- Disolver la enzima transfiriendo el agua que se agregó hacia arriba y hacia abajo. Vórtice la solución por 30 s y compruebe si el polvo totalmente ha sido suspendido. Pipeteo más puede ser necesario para una completa disolución.
- Alícuota de la solución y almacenar a-20 ° C.
- Preparación de una solución de trabajo de thermolysin
Nota: La solución de thermolysin debe ser preparada en el día del tratamiento de jamón.- Descongelar las alícuotas stock de thermolysin de 200 U/mL almacenado a-20 ° C. Diluya la solución stock 200 x en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una actividad enzimática final de 1 U/mL. Preparar 40 mL para tratar manchas de jamón de 1 – 4.
- Filtrar la solución de thermolysin a través de un previo de filtro 0.2 μm a utilizar.
- Preparación de solución madre de thermolysin
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Resuspensión de gelatina
- Preparación de solución de gelatina 20% y el bloque
Nota: La solución de gelatina 20% y el bloque se pueden preparar hasta 1 semana antes de su uso.- Caliente el CO2-medio independiente a 42 ° C en un baño de agua durante 30 minutos (hasta 1 h). En un tubo de 50 mL, añadir 10 g de gelatina en 40 mL de CO2de calentado-medio independiente y agitar la solución.
- Disolver la gelatina durante 30 – 60 min a 42 ° C. Vortex cada 10 minutos para homogeneizar la solución.
- Una vez que la solución esté homogénea, añadir 4 mL de la solución de gelatina 20% a cuatro platos de cultura 6 cm. Evitar las burbujas. Añadir una película de parafina plástico para proteger los platos y deje que la solución solidificar a 4 ° C.
- Preparación de solución de gelatina 8%
Nota: La solución de gelatina 8% puede preparada el día antes de su uso y almacenada a 4 ° C.- Caliente el CO2-medio independiente a 42 ° C por 30 min (hasta 1 h). En un tubo de 50 mL, añadir 4 g de gelatina en 46 mL de caliente CO2-medio independiente y agitar la solución.
- Disolver la gelatina durante 30 – 60 min a 42 ° C. Agregar una película de parafina plástica para proteger el tubo y mantenerlo en un baño de agua a 37 ° C para ser utilizada el mismo día, o almacenar a 4 ° C para su uso posterior.
- Preparación de solución de gelatina 20% y el bloque
2. Thermolysin tratamiento de las membranas amnióticas humanas
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Lavado de la membrana amniótica humana
- Tienen jamones como pedazos pequeños (aproximadamente de 30 x 30 mm) fijada en un andamio de nylon, o ya en 4 ° C en PBS o congelado. Siempre congelado, descongelar las membranas a 37 ° C en una incubadora durante 30 minutos.
- Lavar las membranas:
- Colocar membranas de 1 a 4 en una botella de 250 mL conteniendo 80 mL de PBS. Utilizar tantas botellas como sea necesario.
- Agite cada botella en un agitador de placa a una velocidad alta durante 5 minutos, luego descartar el PBS. Agregar 80 mL de PBS y repita.
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Tratamiento Thermolysin
- Añadir 40 mL de la solución de trabajo de thermolysin (1 U/mL) por la botella que contiene las membranas (membranas de 1 – 4 por botellas; hasta 3 botellas a la vez).
- Agitar las botellas durante 5 minutos a 450 rpm y luego vortex por 30 s. repetir 1 x.
- Deseche la solución de thermolysin y añadir 80 mL de PBS.
- Agitar las botellas por 5 min a 450 rpm. Descartar el PBS y añadir 80 mL de PBS. Repetir x 3.
3. fijación de membranas amnióticas humanas en una inserción de la cultura
- Utilice pinzas largas estériles (que pueden llegar a la parte inferior de la botella) para quitar los jamones uno a uno y cada jamón de transferencia a un plato de cultura de 10 cm conteniendo 10 mL de PBS.
- En una nueva 10 cm placa de cultivo que contiene 10 mL de PBS, coloque una de las membranas con el nylon hacia abajo. Separar dos de los cuatro clips que se utilizan para fijar la membrana de nylon.
- Inserte el anillo más pequeño de la inserción de la cultura entre el nylon y la membrana.
- Asegúrese de que la membrana cubra completamente el anillo más pequeño. Clip de la segunda parte de la inserción de la cultura encima de la membrana. La membrana del sótano del jamón es hacia arriba dentro de la inserción de la cultura. Suelte los dos clips.
- Cortar con las tijeras estériles, el exceso de membrana fuera de la inserción de la cultura si es necesario. Mediante pinzas, transferir la membrana fija en la inserción de la cultura a una placa de 12 pozos, añadir PBS y guardar la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
- Repetir estas operaciones (del paso 3.2 a 3.5) con las otras membranas.
4. descongelación y siembra de células del epitelio pigmentario de la retina en las membranas amnióticas humanas
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Descongelación de células del epitelio pigmentario de la retina
- El Banco de células RPE se congela en 1 millón de células por viales criogénicos en nitrógeno líquido. Descongelar como muchos frascos criogénicos como sea necesario (se siembran las 350.000 células por membrana).
- Preparar un tubo de 15 mL que contiene 3 mL de medio RPE por vial criogénico. Una vez que el frasco se descongele, transferir las células a cada tubo. Repita esta operación para los otros frascos.
- Homogeneizar (pipeta hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para resuspender las células en el medio RPE) y tomar 10 μl de la solución celular y transferir a un tubo de 1,5 mL. Añadir 10 μl de azul tripán. Lugar 15 μl de esta solución en una cámara de conteo, entonces cuente el número de células viables (no coloreados en azul) bajo un microscopio con el objetivo 4 X. Repita esta operación para los otros frascos.
- Mientras tanto, centrifugar los tubos de 15 mL a 110 x g durante 5 min., descartar el sobrenadante y resuspender las células en 700.000 células/mL.
-
Siembra de células del epitelio pigmentario de la retina en las membranas amnióticas humanas
- Retire la placa de 12 pozos que contienen las membranas de la incubadora.
- Aspire el PBS. Añadir 500 μl de la suspensión preparada en el paso 4.1.4 en el centro de la inserción de la cultura. Añadir 1 mL de medio RPE fuera de la inserción de la cultura (dentro del pozo). Repita para las otras membranas.
- Coloque la placa de 12 pozos que contienen las membranas en la incubadora.
5. mantenimiento de cultivos de células de epitelio pigmentario de la retina en las membranas amnióticas humanas
- Renovar el medio 2 x por semana, generalmente los lunes y el viernes, hasta por lo menos 30 días de la cultura.
- Aspire el medio dentro y fuera de la inserción de la cultura para cada pozo y renovar con medio fresco (1 mL fuera de la inserción de la cultura y 500 μl dentro). Coloque la placa en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
6. preparación de la versión de epitelio pigmentario de la retina para el trasplante
Nota: A partir de 30 días de la cultura, el tejido está listo para el trasplante.
- Caliente la solución de 8% de gelatina en un baño de agua a 37 ° C durante 30 minutos llenar la cámara interna de vibratome con frío CO2-medio de independiente (a 4 ° C).
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Coloque el bloque de gelatina 20% en el vibratome.
- Tomar la placa de cultivo de 6 cm que contiene el bloque de 20% de gelatina de la nevera. Con un bisturí, cortar un bloque de 5 cm x 5 cm. Pegar la parte superior del bloque para el apoyo con pegamento de cianoacrilato o su equivalente.
- Colocar una nueva hoja en el vibratome.
- Ajuste el nivel del bloque hasta que quede al mismo nivel de la hoja de afeitar.
- Llene la bañera alrededor de la ayuda con fresca CO2-medio independiente a 4 ° C. Cortar el bloque con el vibratome con una velocidad media hasta que el bloque se corta uniformemente, hacia una superficie lisa. Establecer la posición 0.
- Aspire el medio alrededor del bloque de gelatina hasta que esté completamente seca y luego tomar la placa de cultivo de 12 pocillos que contienen los tejidos de la incubadora a 37 ° C.
- Con fórceps, abra cuidadosamente el inserto de la cultura en la parte superior del bloque de gelatina. Cortar con las tijeras, todas las partes de las membranas que no contiene células (fuera del ring donde no fueron cultivadas células). Aspire el medio residual todo.
- Añadir 1 mL de la solución líquida de gelatina de 8% a 37 ° C para cubrir las membranas. Retire con cuidado el exceso. Espere 5-8 min para permitir que la gelatina se solidifique.
- Añadir fresco CO2-medio independiente (a 4 ° C) al baño hasta que la membrana está cubierta.
- Corte, con el vibratome en una posición de-100 μm, con una velocidad media, permaneciendo consciente de cómo se comporta el bloque. Al final de la sección, tenga cuidado de mantener la orientación del tejido.
- Con un bisturí, cortar una esquina para identificar la orientación de la sección.
- Recoger la membrana incrustada en gelatina con una espátula y colocar en una placa de 6 pozos llenada con el medio de conservación a 4 ° C, hasta el injerto en el ojo receptor.
- A la hora de los trasplantes, ajustar el tamaño del implante que el tamaño del ojo receptor bajo un microscopio quirúrgico (1-3 para las ratas, 10 – 15 mm2 para primates no humanos).
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Representative Results
Jamones contienen una capa epitelial que debe retirarse antes de la siembra de las células RPE. Un tratamiento enzimático de la membrana se realiza con el thermolysin bajo agitación. En orden no para no perder la polaridad de la membrana (el epitelio está en un lado), se fija en un soporte que composición puede ser diferente según el proveedor (figura 1A). Comprobar la adherencia de la membrana para su apoyo en este paso y añadir clips si es necesario. En el momento de la fijación en la inserción de la cultura, trabajar con cuidado para evitar hacer agujeros en la membrana y mantener su polaridad de la membrana basal hacia arriba (figura 1B). Cuando se siembran las células en las membranas, podría escapar de estos agujeros y se reducirá la concentración celular final. La presencia de agujeros podría visualizarse bajo el microscopio o añadir PBS dentro de la inserción de la cultura y comprobando si PBS tiene fugas. Debe desecharse cualquier membrana con orificios.
Después de la fijación de la cubierta de la cultura, la presencia de células residuales en un microscopio de contraste de fase es evaluado (figuras 1 y 1D). Clásico, algunas células muertas podrían permanecer en la superficie de la membrana, pero esas células se eliminarán cuando se cambia el medio de cultivo (figura 1). Las fibras de la membrana basal podrían verse en un aumento mayor (figura 1) si no hay células permanecen. Si ese no es el caso, puede ajustar el tiempo de la incubación con thermolysin.
En los días siguientes a la siembra de las células RPE, comprobar si las células se adhieren. Según el microscopio utilizado, puede ser difícil de ver claramente las células durante las primeras semanas, pero si las células no se adhieren, se verán células flotando en el medio de cultivo celular. Una vez que el epitelio está formado y comienza a madurar, se convierte en más fácil de ver bajo un microscopio (figuras 2A, 2By 2C). En 3 semanas, las células forman un epitelio monocapa completa típico de RPE (organización de adoquines). Después de 4 semanas, el epitelio es bastante maduro para su preparación para la implantación (Figura 2D). Sin embargo, podría mantenerse en cultivo durante más semanas por razones logísticas.
La preparación del injerto para la implantación se describe en la figura 3. A aposición de la membrana al bloque de gelatina 20%, aspirar todo el medio de cultivo celular excesiva. Este paso es importante, como cualquier medio restante podría impedir la adherencia de la gelatina de 8% a la EPR y la membrana. De hecho, el medio forma una película de líquido entre las capas de gelatina.
La gelatina que se utiliza para la fijación del implante puede ser de una resistencia variable, dependiendo de su índice de floración (es decir, una prueba de control de calidad realizado y proporcionado por los surtidores, que evalúa la fuerza de un gel a una temperatura estandarizada y concentración). Si la gelatina utilizada no es lo suficientemente rígida y desagrega durante el injerto, la referencia de gelatina usada debe cambiarse a otro con una fuerza mayor. La concentración de gelatina se podía también cambiar, basada en la experimentación, para ajustar su fuerza y elasticidad.
Figura 1: insertar imágenes representativas del jamón antes y después del tratamiento thermolysin y fijación en una cultura. (A) imagen representativa de una membrana suministrada por el Banco de tejidos. (B) imagen representativa de una membrana fijada en una inserción de la cultura. (C) imagen representativa de una membrana con thermolysin en una ampliación baja. (D) imagen representativa de una membrana con thermolysin en una alta ampliación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imágenes representativas del jamón al sembrar las células RPE. (A) imagen representativa de la membrana antes de sembrar. (B y C) imágenes representativas de las células RPE en membranas en 3 semanas post siembra. La membrana puede no ser totalmente plana como se ve en el panel C. Barra de escala = 100 μm (C), 20 μm para la ampliación. (D) imagen representativa de las células RPE sobre una membrana a los 30 días post siembra, correspondiente a la hora de incrustar en gelatina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: esquema que describe los pasos secuenciales para la inclusión del tejido retiniano ingeniería que contiene la capa de células RPE en el jamón dentro de una película de gelatina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hemos descrito un método para el cultivo de células RPE sobre un andamio biológico y su preparación para su implantación en modelos animales. Uno de los pasos críticos del protocolo es el mantenimiento de la orientación de la pieza a lo largo del procedimiento hasta su inclusión en gelatina. De hecho, se elimina el epitelio nativo de la membrana y su membrana basal se convierte expuestos9. Las células RPE deban ser sembrado en la cima de esta membrana del sótano. En preparación para incrustación de gelatina, es crucial trabajar con todos los productos a la temperatura definida. De hecho, gelatina tiene la propiedad de ser rígida a 4 ° C y líquido en el cuerpo temperatura (37 ° C)9. Si no se respeta la temperatura, la gelatina podría solidificar o licuar en un paso donde no se desea este efecto.
Se han propuesto varios andamios biológicos, como las membranas25 o jamones26 de Descemet. En particular, jamones, una cesárea27, fueron demostrados para ser bien tolerado en el espacio subretinal, causando inflamación limitada y reducción de la neovascularización coroidea26. La membrana soporta con éxito la cultura de humano RPE células9,28. Además, estas membranas tienen también una larga historia en clínicas29, lo que los hace buenos candidatos para un andamio para la terapia celular RPE. Otros soportes biológicos podrían implementarse fácilmente con este protocolo. Andamios sintético basados en polímero ya son rígidos y que no necesite una gelatina incorporar antes de la implantación13,30,31,32,33. Otros sistemas para la implantación se han desarrollado recientemente para la entrega del subretinal en el ojo humano de una monocapa RPE derivadas de células en un andamio de poliéster rígido34 o en un sustrato de parileno sintético diseñado para imitar la membrana de Bruch35 . Aunque estas estrategias son prometedores, creemos que los andamios biológicos podrían proporcionar la mejor plataforma para ingeniería de tejidos RPE.
En el presente Protocolo, las células RPE sembradas se derivan de células madre embrionarias humanas utilizando un método de diferenciación espontánea. Sin embargo, diferentes tipos de células de EPR podrían ser utilizados, bien diferenciados de células madre humanas pluripotentes inducidas o células RPE primarias obtenidas de cadáveres o incluso de un RPE células línea19,36,37, 38. Además, si utiliza células madre pluripotentes, se desarrollaron varios protocolos en los últimos años para obtener las células RPE basado en una diferenciación espontánea o usando moléculas pequeñas para guiar la diferenciación18,22. Las células RPE obtenidas de estos protocolos de diferenciación diferentes podrían utilizarse también con este método para ingeniería de tejidos.
Un límite de este método es la estabilidad del tejido embebido a 4 ° C. Como se incluye en gelatina justo antes del envío para el sitio de la cirugía, debe mantenerse a esta temperatura hasta el engraftment. En ese contexto, la cirugía debe realizarse dentro de 48 h.
Este método podría ser fácilmente transferido a la clínica. El tejido RPE en gelatina se conserva a 4 ° C en el CO2-medio independiente. Este medio podría ser sustituido, si es necesario, con otros ya aprobados por la US Food y Drug Administration (FDA) para la conservación de córneas obtenidas post mortem y que se utilizan para trasplantes en seres humanos. Hemos demostrado con éxito la eficacia de esta estrategia para el trasplante en un estudio de prueba de concepto en modelos de roedores9, y actualmente estamos validando el acercamiento quirúrgico en primates no humanos antes de implementar para un ensayo clínico para tratar a pacientes con determinadas formas de RP que afectan al RPE.
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Disclosures
Olivier Goureau es el inventor en espera de patentes relacionadas con la generación de células de la retina de células madre pluripotentes humanas. Otros autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Jérôme Larghero y Valérie Vanneaux (Hôpital Saint Louis, París, Francia) por su aporte durante la puesta en marcha del método descrito aquí.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], la Fundación pour la Recherche Médicale [programa de Bio-ingeniería - DBS20140930777] y de la empresa LABEX revivir [ANR-10-LABX-73] Olivier Goureau y Christelle Monville. Fue apoyado por NeurATRIS, una infraestructura de investigación traslacional (Investissements Avenir) para bioterapias en Neurociencias [ANR-11-INBS-0011] y INGESTEM, la infraestructura nacional (Investissements Avenir) Ingeniería pluripotentes y diferenciadas las células madre [ANR-11-INBS-000] Christelle Monville. Karim Ben M'Barek fue apoyado por becas de DIM Stempole y la empresa LABEX revivir [ANR-10-LABX-73]. Madre es parte del Instituto de bioterapias para enfermedades raras, apoyados por la Association Française contre les Myopathies (AFM)-Téléthon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
| Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
| CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
| 200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
| 1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
| Pipet aid | Drummond | 75001 | |
| +4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Fine scissors | WPI | 501758 | |
| Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
| Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
| Precision balance | Sartorius | CP225D | |
| Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
| Microscope | Olympus | SC30 | |
| Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
| Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
| Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
| plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
| 0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
| Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
| Bottles 250 mL | Dutscher | 28024 | |
| 15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
| 50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
| culture insert | Scaffdex | C00001N | |
| 60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
| 12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3506 | |
| Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
| Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
| PBS 1x (500 mL) | Sigma | D8537 | |
| Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
| KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
| MEM-NEAA (100x) | Invitrogen | 11140-035 | |
| b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
| Gelatin | MERCK | 104078 | |
| human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |
References
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