Vi beskriver en metod för att konstruera en retinala vävnaden består av näthinnans pigment epitelial celler från mänskliga pluripotenta stamceller odlade ovanpå mänskliga fostervatten membran och dess förberedelse för ympning i djurmodeller.
Flera sjukdomstillstånd i ögat påverka funktionaliteten eller överlevnaden av retinal pigmentepitel (RPE). Dessa inkluderar vissa former av retinitis pigmentosa (RP) och åldersrelaterad makuladegeneration (AMD). Cellterapi är en av de mest lovande terapeutiska strategier föreslås att bota dessa sjukdomar, med redan uppmuntrande preliminära resultat hos människor. Metoden för beredning av graften har dock en betydande inverkan på dess funktionella utfall i vivo. RPE-celler som ympade som en cellsuspension är faktiskt mindre funktionell än samma celler transplanterade som en näthinnevävnad. Häri, beskriver vi en enkel och reproducerbar metod till ingenjör RPE vävnad och dess förberedelse för en in-vivo -implantation. RPE-celler som härrör från mänskliga pluripotenta stamceller är seedade på en biologisk stöd, mänskliga fostervatten membranet (hAM). Jämfört med konstgjorda byggnadsställningar, har detta stöd fördelen av att ha en basalmembranet som ligger nära den Bruchs membran där endogena RPE-celler är kopplade. Men dess behandlig är inte lätt och vi utvecklat flera strategier för dess korrekt odling och beredning för ympning i vivo.
RPE är avgörande för överlevnad och homeostas av fotoreceptorer som det är tätt associerad1. Flera sjukdomstillstånd ändra dess funktionalitet och/eller överlevnad, inklusive RP och AMD.
RP är en grupp av ärvda monogena mutationer som påverkar funktionerna i fotoreceptorer, RPE-celler eller båda2,3. Det uppskattas att mutationer som påverkar särskilt RPE celler utgör 5% av RP2. AMD är ett annat tillstånd där RPE lagret ändras, ledande slutligen till centrala synbortfall. AMD orsakas av komplexa växelverkan av genetiska och miljömässiga faktorer och påverkar äldre4,5,6. Enligt prognoser kommer AMD vara ett bekymmer för 196 miljoner patienter över hela världen av 20207. För dessa störningar, något effektivt botemedel finns, och en av de strategier som föreslås är transplantation av nya RPE-celler för att kompensera för döda/nonfunctional redan existerande RPE celler8.
Formulering av den slutliga produkten att ympas är avgörande för att säkerställa bästa funktionella resultat. RPE-celler injiceras som en cellsuspension, trots att det är en lätt och okomplicerad metod för leverans, höja oro för deras överlevnad, integration och funktionalitet9,10,11,12 , 13. forskare utvecklar nu mer komplexa formuleringar att leverera konstruerad näthinnevävnad9,13,14,15,16. I detta sammanhang utvecklat vi en originell metod för att generera i vitro RPE vävnad som kan användas för transplantation9.
RPE cellbanker härrör från mänskliga embryonala stamceller (ES) används i detta protokoll. Dock alternativ RPE cell banker från olika cell källor (människans pluripotenta stamceller, primära RPE-celler, etc.) och differentierat med en annan metod är också lämpliga för detta protokoll. Det inkluderar riktad differentiering protokoll med hjälp av cytokiner och/eller små molekyler17,18,19,20,21,22.
För att kunna transplanteras, bör konstruerade vävnaden vara beredd på en byggnadsställning. I de senaste åren, har olika ställningar utvecklats på en polymer eller på en matris av biologiskt ursprung13,23,24. Här det biologiska substrat som används är skinka, men andra substrat, som utblottad Bruch membran, kunde genomföras. Den metod som beskrivs häri har fördelen med att använda en biologisk byggnadsställning som är mer relevant för RPE infödda miljön.
Mänskliga ES cell-derived RPE-celler odlas i minst 4 veckor för att vara fullt organiserade som en kullersten enskiktslager. I det skedet epitelet erhålls är funktionell och polariserade9. Slutligen, eftersom denna vävnad rynkor lätt, den är inbäddad i ett tunt lager av hydrogel bärare att ge det mer styvhet och elasticitet och skydda den under förfarandet för injektion. Denna produkt är sedan lagras vid 4 ° C tills ympning.
Vi beskrivs en metod för kulturen i RPE-celler på en biologisk byggnadsställning och dess förberedelser för implantation i djurmodeller. En av de kritiska steg i protokollet är underhåll av orientering på skinkan längs förfarandet fram till dess införande i gelatin. Faktiskt det infödda epitelet av membranet tas bort och dess basalmembranet blir exponerade9. RPE-cellerna måste vara seedad ovanpå detta basalmembranet. Vid förberedelse för gelatin inbäddning, är det viktigt att arb…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Jérôme Larghero och Valérie Vanneaux (Hôpital Saint-Louis, Paris, Frankrike) för deras insatser under inrättandet av den metod som beskrivs här.
Detta arbete stöds av bidrag från ANR [GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02], Fondation pour la Recherche Médicale [Bio-engineering program – DBS20140930777] och från LABEX ÅTERUPPLIVA [ANR-10-LABX-73] att Olivier Goureau och Christelle Monville. Den stöddes av NeurATRIS, en translationell forskningsinfrastruktur (Investissements pris) för bioterapier i neurovetenskap [ANR-11-INBS-0011] och INGESTEM, den nationella infrastrukturen (Investissements pris) engineering för pluripotenta och differentierade stamceller [ANR-11-INBS-000] till Christelle Monville. Karim Ben M’Barek stöddes av stipendier från DIM Stempole och LABEX ÅTERUPPLIVA [ANR-10-LABX-73]. Jag-stammen är en del av det bioterapier Institutet för sällsynta sjukdomar som stöds av den Association Française contre les myopatier (AFM)-Téléthon.
Sterile biosafety cabinet | TechGen International | Not applicable | |
Liquid waste disposal system for aspiration | Vacuubrand | BVC 21 | |
CO2-controlled +37 °C cell incubator | Thermo Electron Corporation | BVC 21 NT | |
200 µL pipette: P200 | Gilson | F144565 | |
1 mL pipette: P1000 | Gilson | F144566 | |
Pipet aid | Drummond | 75001 | |
+4 °C refrigerator | Liebherr | Not applicable | |
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Fine scissors | WPI | 501758 | |
Forceps (x2) | WPI | 555227F | |
Water bath | Grant subaqua pro | SUB6 | |
Precision balance | Sartorius | CP225D | |
Centrifuge | Eppendorff | 5804 | |
Microscope | Olympus | SC30 | |
Horizontal Rocking Shaker | IKA-WERKE | IKA MTS 214D | |
Vortex | VWR | LAB DANCER S40 | |
Disposable Scalpel | WPI | 500351 | |
plastic paraffin film | VWR | PM992 | |
0.200 µm single use syringe filter | SARTORIUS | 16532 | |
Syringe without needle 50 mL | Dutscher | 50012 | |
Bottles 250mL | Dutscher | 28024 | |
15 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352097 | |
50 mL sterile Falcon tubes | Dutscher | 352098 | |
culture insert | Scaffdex | C00001N | |
60 mm cell culture disches: B6 | Dutscher | 353004 | |
12 well cell culture plate | Corning | 3512 | |
6-well culture plates | Corning | 3506 | |
Razor blades | Ted Pella, Inc | 121-9 | |
Cyanoacrylate glue | Castorama | 3178040670105 | |
PBS 1X (500 mL) | Sigma | D8537 | |
Thermolysine | Roche | 5339880001 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX | Invitrogen | 61965-026 | |
KSR CTS (KnockOut SR XenoFree CTS) | Invitrogen | 12618-013 | |
MEM-NEAA (100X) | Invitrogen | 11140-035 | |
b-mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350-010 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
CO2-independent medium | GIBCO | 18045-054 | |
Gelatin | MERCK | 104078 | |
human amniotic membrane | Tissue bank St Louis hospital (Paris, France) | Not applicable |