Summary
Un protocole détaillé pour l’opération concurrente 48 parallèle des cultures de cellules dans des conditions variées dans un système de MICROBIOREACTEUR est présenté. Processus de culture cellulaire, la récolte et l’analyse subséquente anticorps titre sont décrites.
Abstract
Bioréacteurs à micro-échelle automatisé (15 mL) peuvent être un outil utile pour les ingénieurs en culture cellulaire. Ils facilitent l’exécution simultanée d’une grande variété de conditions expérimentales tout en minimisant la variabilité potentielle de processus. Les applications de cette approche incluent : clone de blindage, changements de température et le pH, optimisation médias et supplément. En outre, les volumes de petit réacteur sont propices aux grands plans d’expériences qui examinent une vaste gamme de conditions. Cela permet des phénomènes en amont d’optimiser considérablement avant l’intensification où expérimentation est de portée plus limitée faute de temps et de contraintes économiques. Systèmes de bioréacteur de microscale automatisé offrent divers avantages par rapport aux traditionnels à petite échelle unités d’élevage de cellule, tels que flacons agitateurs ou flacons de spinner. Cependant, au cours de l’échelle pilote processus développement significatif il faut pour s’assurer que ces avantages sont réalisés. Lorsque exécuté avec soin, le système peut permettent l’automatisation de niveau élevée, peut être programmé pour exécuter de la Biche avec un plus grand nombre de variables et peut réduire le temps d’échantillonnage lorsqu’elle est intégrée avec un analyseur de nutriments ou compteur de cellules. Intégration de l’heuristique expert dérivés présentés ici, avec des expériences de bioréacteur à micro-échelle automatisé actuel peut réduire au minimum les pièges communs qui nuisent à des résultats significatifs. À l’extrême, ne pas respecter les principes énoncés ici peut entraîner des dommages matériels qui nécessite des réparations coûteuses. En outre, les systèmes de MICROBIOREACTEUR ont des volumes de petite culture complique la caractérisation des conditions de culture cellulaire. Le nombre et la quantité d’échantillons prélevés en cours dans la culture de mode traitement par lots est limité comme volumes d’exploitation ne peut pas tomber au-dessous de 10 mL. Cette méthode discutera les avantages et les inconvénients des systèmes de bioréacteur de microscale.
Introduction
Anticorps monoclonaux (ACM) ont été tout d’abord produites en cellules d’hybridome de souris en 19751. Depuis lors, une augmentation dans le développement de la production de protéines recombinantes a eu lieu à humaniser le mAbs augmentation in vivo la sécurité et l’efficacité2,3,4. La plupart des processus de production des protéines recombinantes emploient des cellules ovariennes de Hamster chinois (CHO) pour la facilité avec laquelle ils peuvent être adaptés aux médias libres sériques, leur capacité à produire des protéines avec des modifications post-traductionnelles semblables à celle d’un être humain inné protéines et leur fiabilité en tant que hôte cellules5,6.
La demande croît de livrer le produit plus rapidement et pour les plus grandes populations de patients avec une qualité constante. En plus des avantages économiques, le répertoire des maladies traitées par le mAbs est en augmentation, qui comprend maintenant des maladies auto-immunes, des complications après la transplantation, l’arthrite et les cancers7. Rendements moyens pour lignes de production de mAb commerciaux modernes sont typiquement de l’ordre de 5 à 6 g/L et continuent d’augmenter de5. En partie, cela a été accompli grâce à l’ingénierie cellulaire CHO et dépistage de ligne de production améliorée à l’aide de bioréacteurs à haut-débit8. Cependant, la plupart des augmentations dans la production de protéines ont été attribuées pour traiter des améliorations, y compris les avancements dans l’optimisation des médias, des conditions de culture cellulaire et amélioré l’alimentation stratégies7,9,10. Supplémentation en nutriments est indispensable non seulement pour la croissance cellulaire appropriée mais aussi pour une production efficace de protéines de haute qualité. En outre, les cellules nécessitent l’ajout stoechiométrique de nutriments spécifiques, nécessitant une compréhension supplémentaire destinés à l’alimentation stratégie optimisation6,11. Méthodes d’optimisation classiques comprennent les supports individuels composant titrage et médias de mélange avec des dessins de mélange. Cependant, ces méthodes sont gourmands en temps, labor et impliquent des risques associés à l’erreur humaine12,13.
Études d’optimisation médias invoqué précédemment flacons agitateurs et bioréacteurs L 1-2 qui peuvent être prohibitifs en termes de matières premières et du capital humain. Plaques de microtitration ont également été utilisés, mais ces méthodes offrent évolutivité limitée. En outre, il faudra encore plusieurs parcours fastidieux qui introduisent des lot de variabilité qui obscurcit la variabilité de l’AQC causée par la composition de médias et alimentation stratégie14,15,16. Ainsi, le besoin de haut débit et très cohérent de bioréacteur parallèle systèmes émergés17,18,19,20.
Avec les dépenses importantes liées à l’exploitation de bioréacteurs de laboratoire traditionnel (0.5-5 L), microbioreactors offrent une alternative de la réduction des coûts pour évaluer la production de biologiquement dérivés de médicaments. 21 laboratoire agité-réservoir bioréacteurs sont fiables et fournissent des données par l’intermédiaire de tableaux sensoriels denses. Systèmes de contrôle de rétroaction permettent pour un contrôle facile de fonctionnement. Cependant, montage, étalonnage, nettoyage, coûts salariaux, substrat, les frais stérilisation exigences font laboratoire agité-réservoir bioréacteurs coûteux et forte intensité de travail à exploiter. Flacons agitateurs et plaques de microtitration enlever une partie du coût et du travail des problèmes liés aux bioréacteurs à plus grandes échelle, mais ces solutions de rechange offrent un faible contrôle sur des conditions de transformation et de produisent des données de faible densité, souvent seulement des mesures de point final. 22
Alternativement, les microbioreactors utilisent un petit volume de travail pour offrir une approche d’échelle réduite de lignée cellulaire et le développement de processus en amont. L’échelle d’expériences MICROBIOREACTEUR peut diminuer considérablement le coût de fonctionnement grâce à une utilisation plus faible de puissance, substrat, labor, espace et utilitaires. 23 Microbioreactors sont comme des flacons agitateurs car ils sont faciles à manipuler en raison de leur taille, mais ils conservent les avantages de bioréacteurs de laboratoire traditionnel par le biais de leur commande de rétroaction en ligne du pH, température, dissous l’oxygène et l’acide/base consommation ainsi que leur sortie de données en temps réel des paramètres de qualité, y compris au large de la composition du gaz. MICROBIOREACTEUR échelle permet la capacité de criblage à haut débit, qui peut être utile pour le développement de processus de sélection et clone. 24
Le bioréacteur de Microscale avancé s’est avéré être un outil efficace pour la caractérisation de processus CHO cell culture et développement,18. Ici, un système automatisé ambr15, composé de 48 microbioreactors en parallèle, qui se sont révélées être comparable au classique agité réacteurs de réservoir dans l’échelle des études,25 a été utilisé d’une façon analogue à des travaux antérieurs qui ont optimisé les médias composition pour une lignée de cellules de CHO-DG44 produisant un modèle chimérique IgG16. Les effets de différentes conditions du milieu sur la croissance et de titre ont été comparés et analysés. Dans le présent document présente de manière générale pour exécuter le système MICROBIOREACTEUR et l’analyse d’échantillons de supports bruts.
Protocol
1. semences forment Expansion
Remarque : Ce protocole utilise 1 mL recombinant DG44 CHO cell les stocks qui ont été stockés à une densité de ~ 3 x 107 cellules/mL. Les dilutions et un calendrier pour les différentes lignées de cellules CHO varieront. Mesurer les courbes de croissance de la lignée cellulaire sera utilisé au préalable et ajuster en conséquence. Les cellules sont initialement décongelés en flacons agitateurs et transférés dans une fiole de spinner. Déterminer le nombre de flacons agitateurs et des flacons de spinner nécessaires pour l’expérience basée sur le nombre de microbioreactors qui seront exécutées et la cible, la densité de semis.
- Décongeler rapidement vial(s) stock de cellules CHO en l’immergeant dans un bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que seulement une petite tranche de restes de glace. Décontaminer l’extérieur de la cuvette à l’aide de la solution d’éthanol à 70 % et un tissu non pelucheux. Transférer dans une armoire de sécurité biologique.
- Remettre en suspension les cellules par doucement pipetage de haut en bas et de transférer 1 mL dans une fiole de shake ventilé stérile 125 mL contenant 29 mL de milieu pré chauffé additionné de 8 mM de L-glutamine et 1 x pénicilline/streptomycine.
Remarque : Sauf indication contraire, le terme « médias » dans le présent protocole sera ensuite être défini en tant que média de OptiCHO. - Lieu shake Deutsch dans un incubateur à 37 ° C et 8 % de CO2. Utiliser un agitateur orbital pour agiter les cellules à une vitesse de 130 tr/min.
- Surveiller la densité de cellules viables (VCD) chaque jour à l’aide d’une cellule automatique dispositif de comptage ou manuellement avec un hémocytomètre et le bleu trypan. Repiquage (dilué) les 72 heures suivant l’inoculation dans les supports neufs (préchauffer les médias à 37 ° C chaque fois qu’il convient d’ajouter aux cellules) de cellules telles que le volume final est 100 mL dans une fiole de cône d’hélice de 125 mL. Incuber les cultures spinner dans les mêmes conditions, utilisées pour les cultures fiole agitées à une vitesse de 70 tr/min.
Remarque : Après repiquage, cellules doivent être à une densité de 0,7-1 x 106 cellules/mL. Veiller à ce que la densité finale n’est pas inférieur à 0,5 x 106 cellules/mL. Repiquage après 96 h si la densité des cellules cibles pour l’inoculation dans les filatures n’est pas joignable. - Le troisième jour (un jour avant la préparation de l’inoculum), ajouter des éléments multimédias fraîches, préchauffé à spinner-Deutsch pour maintenir la viabilité ≥ 90 %. Ne pas dépasser le volume total de 125 mL. 6
2. fonctionnement du système de MICROBIOREACTEUR automatique
Configuration requise : L’utilisateur doit avoir reçu la formation appropriée du fabricant et doit se familiariser avec la sécurité et des conditions de fonctionnement pour le système.
- L’initialisation et le raccordement au compteur de cellules
- Initialiser le système d’exploitation. Avant d’ouvrir le logiciel, assurez-vous que le compteur de cellules (voir Table des matières) est en cours d’exécution ainsi que les logiciels respectifs. Le compteur de cellules est intégré au système.
- Se connecter à la connexion à distance compteur cellulaire avant d’ouvrir le logiciel. Cliquez sur l’icône du bureau distant et cliquez sur « Se connecter ». Une fois que le Bureau à distance est connecté, ouvrez le logiciel compteur de cellules. Installer un nouveau réactif, vide le bleu trypan déchets et amorcer le système.
- Minimiser la connexion à distance et ouvrez le logiciel de micro bioréacteur utilisant une expérience existante comme modèle pour créer une nouvelle expérience. Nommer et enregistrer l’expérience. Assurez-vous que le compteur de cellules automatisées est connecté sous l’onglet État dans le logiciel. Le statut peut également être vérifié sur le logiciel compteur de cellules.
- Définition de plaques et chargement des navires
Remarque : veuillez vous référer à la Figure 1 pour orienter le chargement des consommables et réactifs sur les stations de la culture et des ponts. Les flasques devraient être stérilisés à l’autoclave sur une gravité cycle (utilisé pour les matériaux solides) à avant utilisation.- Avant de commencer une course, définir les plaques utilisées lors de l’exécution dans l’article synoptique du logiciel. Nommez chaque plaque utilisée et désigner chaque assiette d’un pont sur la station piscicole de MICROBIOREACTEUR.
- Utiliser une plaque 24 puits pour charger les médias et sur la terrasse désignée de la station piscicole. Placez 1 mL et 4 mL embout cases situées dans les sections tel qu’indiqué dans la Figure 1.
- Posez une plaque 24 puits inoculation sur le pont respectif de la station piscicole. Placez le puits 1Ã tamponné phosphate salin (PBS) plaque sur le pont 1. Placer la plaque de NaOH 1 M puits sur le pont 2 et la plaque 24 puits antimousse sur le pont 7 (Positions comme il est indiqué dans la Figure 1). Les numéros de pont sont schématiquement indiquées sous l’onglet « Mimic » dans le logiciel.
- Déballez les récipients de culture (équipés d’AERATEURS) à l’intérieur de la hotte du cabinet de sécurité. Placer des récipients de culture stériles douze par la culture. Place autoclavés fixer les plaques sur le dessus des vaisseaux. Veiller à ce que les trous des insertions prévues les agitateurs de tous face à la même direction pour placement plus facile.
Remarque : À l’aide d’un marqueur permanent, catégoriser les récipients de culture avant de les placer dans la station piscicole de gagner du temps et éviter toute confusion au moment de la récolte. - Plaquette serre joints toriques sont la première partie de porter vers le bas après autoclavage répété, donc soigneusement Vérifiez-les avant l’autoclavage avant chaque expérience. Garder une plaque pince stérile comme back-up en cas de défaillance du joint torique est recommandé.
- Placer les plaques de remuer sur le dessus les flasques, assurant chaque broche est bien insérée. Fixez les plaques de serrage avec des vis et des boutons fournis. Serrez les boutons jusqu'à ce qu’ils sont serrés à la main. Serrer les boutons gauche et droite alternativement pour la même mise en place de la plaque de fixation.
Remarque : Si l’attache n’est pas aligné contre la surface ou si les vis à l’extrémité de la plaque de fixation sont inégalement serrées, les vaisseaux connaîtra des problèmes de contrôle de l’oxygène dissous (DO). Si ces réglages ne corrigent pas le problème, vérifier les joints toriques comme fermeture incomplète des plaques peut conduire à un gazage inefficace de la culture.
- Exécutez le logiciel automatisé bioréacteur Micro
Remarque : utilisation « Étapes » onglet pour modifier ou créer de nouvelles mesures. Il faut être programmés individuellement pour démarrer et arrêter un processus. Cliquez sur le bouton « Insérer une étape » sous l’onglet étapes de processus pour créer de nouvelles mesures ou double-cliquez sur une étape existante pour modifier cette étape. Les étapes du programme sont divisées en dix sections principales : démarrage, charge de médias, antimousse Addition, / pH Control, ajouts de fond de Base, Paused pH, Inoculation, globules de 5 X, 10 X nombre d’éléments, nutriment analyseur d’échantillonnage et Culture mise à l’arrêt. La durée d’exécution est généralement entre 7 à 9 jours lorsqu’il est exécutés en mode batch.- Le système initialise et vérifie la présence des vaisseaux appropriés. Scanner le code-barres fourni avec les récipients de culture. Le même code à barres peut être appliqué pour les stations de culture avec le vide ou bateaux n’étant ne pas utilisés.
- Le système commencera avec le programme conçu après vérification contrôle, gazage et autres connexions.
Remarque : L’utilisateur peut aller de l’avant avec le programme même si une erreur se produit, mais le faire au risque de l’utilisateur et si instance n’endommage pas le système et n’interrompt pas l’expérience. Par exemple, gazage peut être désactivée pour certains bateaux non affectés à l’expérimentation qui apparaîtra comme une erreur, mais peut être contournée.
- Démarrage et chargement des médias
- Premier jour établissant le système ou les médias jour de charge est désignée comme jour 0 du temps de la culture.
- En vertu de la section de démarrage, première pipette charge conseils, conseils fois 1 mL et 4 mL, comme programmé. S’il est déjà placé, cliquez sur continuer. Placer la plaque de support, solution PBS 1 X, NaOH 1 M, plaque antimousse, médias charge plaque et plaque l’inoculation dans les ponts désignés ou, s’il est déjà placé, appuyer sur continuer passer à l’étape suivante.
- Dans le cadre du protocole de démarrage, commencer le contrôle de la température et régler la température à 37 ° C. Allumez le brassage à 1000 tr/min et le DO / moniteur de pH.
- Ensuite, exécutez les médias Programme de charge. Le gestionnaire de liquid du système automatisé MICROBIOREACTEUR distribuera les médias de la plaque de support pour les récipients de culture comme mappé dans le programme. Les médias ajoutés sont OptiCHO avec différentes conditions de processus.
Remarque : Deux puits d’une plaque 24 puits sont tenus de remplir un récipient de culture à capacité (13 mL), que chaque puits ne peut accueillir que 8 mL de médias. Utilisez 7 à 8 mL dans chaque puits pour empêcher l’air dessin lorsque le média est mixé par le gestionnaire liquid avant la charge. - Une fois le support de charge est terminé, 35 µL d’antimousse Ex-cellule s’ajouteront de la plaque d’antimousse pour le récipient de culture. Attendre 30 minutes pour le milieu de culture à bien mélanger et l’optique / capteurs pH de s’hydrater.
Remarque : Le même volume d’antimousse est ajouté par intermittence tout au long de la période de culture quand la mousse est détecté. 6 moussant est détecté visuellement et cuves de réacteur sont vérifiées chaque jour pour écumer. Antimousse est ajouté immédiatement lors de la détection. - Le DO / contrôle du pH est alors allumé pour commencer la surveillance et l’enregistrement de l’et le pH du milieu de culture. Permettent du faire pour atteindre le point de consigne de 50 %, ce qui prend au moins 2 h.
- Après équilibration, allumez les ajouts base fond à atteindre un point de consigne pH de 7,1 pour tous les récipients de culture. Permettent et pH s’équilibrer pendant la nuit et de s’hydrater complètement.
- En pause pH - pH 1 jour Offset
- Le lendemain (marqué comme 1er jour), exécuter l’étape de pH en pause par lequel sélectionner culture navires sont analysées et un offset de correction du pH est déterminé.
Remarque : Le nombre de navires de pH à échantillonner pour neutraliser le pH est utilisateur déterminé. Un échantillon de chaque cuve de réacteur n’est peut-être pas nécessaire si vous avez une bonne représentation de la population de bioréacteur. - Placer les plaques de support de tube échantillon sur les ponts désignés et charge micro centrifugeuse tubes avec bouchons ouvert et situé à côté d’eux. Le gestionnaire liquid distribuera 600 µL du milieu de culture cellulaire dans le tube comme mappé dans le programme.
-
Retirer immédiatement le pH d’échantillonnage et de mesure sur un bioanalyzer des éléments nutritifs qui a été étalonné correctement et pour lesquels le QCs ont été exécuté (voir ci-dessous, « Quotidienne Nutrient and Metabolite Analysis »).
Remarque : Les échantillons sont gérés individuellement, immédiatement après le dessin, pour éviter les variations de pH en raison de l’exposition à l’air, comme le dégazage du CO2 à partir de l’échantillon peut provoquer des changements de pH. - Appuyez sur « continuer » après chaque prélèvement, autrement que l’étape suivante ne sera pas exécuté.
- Entrez les valeurs de pH externe, dérivé de FLEX dans le logiciel, « compilation » automatiquement les offsets pour les navires échantillonnés. Manuellement les offsets obtenues pour les navires de l’échantillon en moyenne et entrez le numéro dans la colonne de décalage de pH utilisateur sous l’onglet « bateau ». Le décalage moyen puis s’appliqueraient à tous les navires. Permettre le pH s’équilibrer pendant au moins 2-3 heures, après quoi les récipients de culture peuvent être inoculés.
- Le lendemain (marqué comme 1er jour), exécuter l’étape de pH en pause par lequel sélectionner culture navires sont analysées et un offset de correction du pH est déterminé.
- Inoculation
- Après avoir mesuré les VCD, transférer le contenu de la casserole-Deutsch dans un stérile, 250 mL centrifuger conique tube et pellet cellules par centrifugation pendant 10 min à 140 g x à température ambiante. Décanter les vieux médias et remettre en suspension dans les médias assez fraîches telles que la densité finale doit être de 1 x 106 cellules/mL après avoir ajouté l’inoculum dans le récipient de culture.
- Ajouter les cellules en suspension dans le bien d’une plaque de 24 puits balconnet stérile désigné. Ajouter 3 mL d’inoculum dans chaque puits, dont 2 mL seront supprimé comme inoculum pour chaque récipient de culture.
- Placer la plaque de l’inoculum sur le pont désigné à l’intérieur de la hotte. Veillez à l’extérieur de la plaque de l’inoculum balconnet de pulvérisation avec de l’alcool 70 % avant de le placer à l’intérieur de la hotte.
- Comptage de cellules à l’aide automatique compteur de cellules
- Après l’inoculation, laissez les récipients de culture équilibrer pendant au moins une heure. Après une heure, exécuter le 5 X cell count étape dans le programme. 5 X indique le facteur de dilution utilisé pour lire le nombre d’éléments.
Remarque : 5 nombre d’éléments de X est utilisé au départ lorsque les cellules sont dans la phase de latence. Lorsque les cellules atteignent leur phase exponentielle le 10 X le nombre de cellules sera utilisé. Basé sur l’échantillon et les volumes diluant l’instrument automatiquement représente le facteur de dilution et ajuste la valeur finale en conséquence. - Le gestionnaire liquid ajoute d’abord 480 µL de solution 1 PBS X à la Coupe du compteur cellulaire suivie par l’ajout de 120 µL du milieu de culture cellulaire du récipient de culture. Le nombre d’éléments est alors lue en utilisant le compteur de cellules automatisées. Cette étape est répétée pour tous les navires.
- Le nombre d’éléments est la dernière étape pour le jour 1 de la période de culture. Avec les données et le pH, le nombre d’éléments données (densité de cellules viables et viabilité) sont également enregistrées quotidiennement par le logiciel.
Remarque : Nettoyez la coupelle de compteur cellulaire au moins deux fois pendant la durée de la course avec 70 % d’isopropanol pour prévenir le colmatage des lignes. Lignes et cellules de circulation sont automatiquement nettoyés après chaque comptage cellulaire.
- Après l’inoculation, laissez les récipients de culture équilibrer pendant au moins une heure. Après une heure, exécuter le 5 X cell count étape dans le programme. 5 X indique le facteur de dilution utilisé pour lire le nombre d’éléments.
- En pause pH - pH jour 2 Offset
- Jour 2 du temps culturel, répétez l’étape « pH en pause » à l’aide de récipients de culture autre que celles qui ont été prélevées lors de l’étape initiale de pH en pause.
Remarque : Échantillonnage de plus de la population de navire pour le pH en pause fournira un meilleur offset pour la correction du pH. Par conséquent, elles n’échantillonnent pas les même aux bateaux affectés aux pH suspendu depuis la veille.
- Jour 2 du temps culturel, répétez l’étape « pH en pause » à l’aide de récipients de culture autre que celles qui ont été prélevées lors de l’étape initiale de pH en pause.
- Aliment quotidien et analyse de métabolite
- Échantillons seront prises pour l’analyse des éléments nutritifs du jour 2 de la culture jusqu'à la fin de l’expérience et analysées à l’aide des éléments nutritifs bioanalyzer.
- Placer les plaques de support de tube échantillon sur les ponts désignés et charge micro centrifugeuse tubes avec bouchons ouvert et situé à côté d’eux. Le gestionnaire liquid distribuera le milieu de culture cellulaire dans le tube comme mappé dans le programme.
Remarque : Pour le départ quelques jours (jours 2-4), la quantité d’échantillon pris dans le récipient de culture est 300 µL. C’est dilué avec 300 µL de PBS de X 1 délivrés par le gestionnaire de liquid. Ceci est fait pour conserver le volume de culture et d’éviter que le niveau de tomber au-dessous de 10 mL. En outre, les valeurs nutritives pour les premiers jours relèvent de la plage de détection instrument après dilution. - Placer les échantillons dans le plateau de l’analyseur pour effectuer l’analyse des éléments nutritifs.
Remarque : Congeler des échantillons qui ne seront pas analysés le jour même.
- Arrêt du système
- Pour terminer la course, tout d’abord désactiver le contrôle de température, suivi par l’agitation. En second lieu, arrêter le DO / ajouts de base de contrôle du pH et fond. En troisième lieu, arrêter tous les autres contrôles. Enfin, arrêter le moniteur système.
- Dévisser le collier et remuer les assiettes et retirer les récipients de culture. Nettoyer l’intérieur de la station piscicole avec un chiffon non pelucheux. Placer les plaques de séchage sur la station piscicole et vissez-les dans.
Remarque : Cycle de séchage est requise pour la version refroidie du système et n’est pas nécessaire pour la version standard du système. - Exécuter le cycle de séchage de 2 heures sur le programme. Nettoyer les plaques de serrage à l’aide de l’eau ultrapure suivie 70 % d’alcool isopropylique (IPA) pour évacuer le liquide condensé possible dans les lignes. Rincer avec de l’air pour enlever tout le liquide résiduel.
- Cliquez sur « Stop » dans le logiciel de bioréacteur une fois le cycle de séchage est terminée.
3. Culture cellulaire
- Transférer le liquide de culture de cellules des vaisseaux de réacteur et granules des cellules à 1 962 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
- Décanter le liquide surnageant. En utilisant un 0,22 µm PVDF filtre filtre stérile le milieu de culture cellulaire décantée.
- Aliquote 1 mL du milieu de culture de cellules stériles dans 1,5 mL Eppendorf tubes pour analyse de titre. Stocker les tubes de 1 mL à-20 ° C. Purifier le reste du milieu de culture de cellules récoltées à l’aide du système de chromatographie liquide de protéine rapide. 6
4. mesure IgG titres
Remarque : Il s’agit d’un aperçu rapide de course et d’analyser les échantillons en utilisant le système de biocapteur proteinA. Tous les paramètres d’analyse ( p. ex. température, temps de lecture, tr/min, etc. ) doivent être déterminées empiriquement pour chaque type d’échantillon.
- Allumez le système et laisser la lampe se réchauffer pour les échantillons de supprimer au moins 1 h. du congélateur à décongeler et est proportionnelle à la température ambiante.
- Dans le logiciel système, régler la température de la plaque à 26 ° C. Pré-tremper le nombre de conseils de protéine A pour être utilisée dans la matrice de l’échantillon (par exemple les milieux cellulaires) au moins 30 minutes.
Remarque : La température optimale doit être déterminée empiriquement. Une température de 26 ° C est utilisée ici pour minimiser l’évaporation d’échantillon pendant le temps d’analyse et de permettre à l’instrument maintenir une température constante (en étant plusieurs degrés au-dessus de la température ambiante). Les échantillons doivent être préalablement équilibré à la température d’essai choisi avant la mesure en incubant la plaque d’échantillon sur la scène de l’échantillon pour ≥ 10 minutes. - Construire la courbe d’étalonnage de protéines en utilisant le même anticorps concentré à 10 mg/mL et diluer en série dans la matrice de l’échantillon (c.-à-d. médias) dans la gamme qui doit être détecté.
Remarque : Il est important d’obtenir une forte concentration d’anticorps afin de minimiser les effets de matrice due à la dilution, mais il est également important de ne pas plus se concentrer l’anticorps et provoquer l’agrégation. Exécution d’une courbe d’étalonnage en plaque pour chaque plaque d’échantillon est préférable. Au minimum, un contrôle positif doit servir à rendre compte de la variabilité de la pointe-à-bout et la plaque à l’assiette. Une courbe d’étalonnage de nouveau doit être généré pour chaque nouveau lot de protéine une pointes utilisées. - Conception de la plaque de l’échantillon (par exemple, s’il vous plaît voir la Figure 2). Dans une protéine A qui utilise la régénération, jusqu'à 80 échantillons peut être analysé, y compris les échantillons de culture inconnue, des normes et des contrôles. Pour chaque plaque analysée, une astuce simple protéine A servira à mesurer jusqu'à 10 échantillons de la plaque (colonnes 1 à 10), avec un cycle de régénération entre chaque échantillon.
Remarque : Il est recommandé que la toute première ligne de la plaque (ligne A) servir de référence et le contrôle négatif. Dans l’essai discuté ici, lignes B et C sont utilisés pour les deux contrôles positifs ; un à la basse et l’autre à la limite supérieure de la réponse linéaire. Cela garantit que chaque pointe mesures témoins négatifs et positifs avant d’analyser les échantillons. Ce set-up simplifie également la soustraction de référence dans le logiciel d’analyse. Les puits restants sont ensuite utilisés pour les échantillons inconnus. S’il y a une lacune de l’échantillon dans l’une des lignes, il doit y avoir une matrice dans ce puits afin d’éviter le dessèchement de l’extrémité (c.-à-d. puits A2 par G2 ont échantillon n’est pas le cas de H2. Assurer H2 contient matrice de l’échantillon afin d’assurer la pointe se dessécher avant d’aller déguster H3). Enfin, n’épuisent pas de conseils à l’aide d’un set d’analyser plusieurs plaques. En utilisant un nouveau, non régénérés ensemble pour chaque plaque est recommandé. - Préparer les échantillons pour analyse en mélangeant doucement , par inversion ou par pipetage, suivi d’un essorage impulsion pour recueillir l’échantillon au fond du tube. Pour les échantillons concentrés, créer réplicats de dilution appropriée par dilution dans la matrice de l’échantillon.
Remarque : La gamme linéaire du binding pour un anticorps à la protéine une mesures d’interférométrie (BLI) bio-couche peut varier par l’anticorps, conditions expérimentales et matrice. Cela doit être déterminée empiriquement au préalable pour assurer les dilutions de l’échantillon appropriés sont utilisées. - Préparez les plaques de 96 puits échantillon au plus près les temps de dosage possible. Il n’y a pas de bulles d’air dans l’un des puits. Enlever les bulles d’air avec une pointe de pipette propre ou par centrifugation.
- Plaque de charge dans le système et exécutez le test à l’aide de la valeur par défaut « Haute sensibilité dosage avec régénération » dans le logiciel d’Acquisition de données. Analyser à l’aide du logiciel d’analyse de données HT.
Remarque : Si les plaques doivent être préparées en avance en raison de contraintes, sceller solidement avec le film pour empêcher l’évaporation. Selon les titres attendus, temps et taux d’acquisition peuvent devoir être ajustée. Consulter le manuel d’orientation. - En utilisant le logiciel d’analyse de données, référence soustraire et calculer la concentration des échantillons inconnus à l’aide de la courbe d’étalonnage et de la fonction de la pente initiale (IS) avec un point à point linéaire s’adapter.
Representative Results
Surveillance des paramètres critiques du procédé et autres paramètres de culture de cellules tout au long de l’opération des cultures cellulaires est un aspect important dans la biotransformation. Le compteur de cellules et l’analyseur en éléments nutritifs ont été utilisés pour quantifier les cinq attributs qui caractérisent la croissance cellulaire, consommation d’éléments nutritifs et la formation de sous-produits. Le nombre de cellules ont été obtenu par jour pour toutes les conditions de culture. La densité moyenne des cellules viables et les viabilités sont à considérer dans la Figure 3 avec leur intervalle de ± 1 SD. Les profils des éléments nutritifs et de sous-produit figurent également avec l’intervalle de SD de ±1 à travers la phase stationnaire des cultures. La pente de ce profil représente les taux de glucose et la consommation de glutamine et la production de lactate, moyens. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent la faisabilité de la surveillance de ces attributs dans le système de MICROBIOREACTEUR ; ainsi que la capacité du système MICROBIOREACTEUR pour maintenir ces paramètres dans une fourchette étroite.
La productivité totale des cultures cellulaires a été quantifiée en utilisant un système de biocapteur de proteinA après que les milieux de culture de cellules récoltées était passé à travers un filtre PVDF 0,22 micron. La productivité spécifique par cellule varie de 0,87 pg/cellule-d à 1,15 pg/cellule-d comme on le voit à la Figure 4. Basé sur ces résultats, un large éventail de troubles peut être étudié pour choisir la composition de médias et alimentation des stratégies qui maximisent la quantité de protéines produites pour un investissement minimal dans les procédures expérimentales.
Figure 1 : Mise en page du système avec 4 stations de culture (CS) ayant chacun 12 cuves de réacteur MICROBIOREACTEUR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Montage de plaque d’échantillon exemple pour un dosage de base avec l’expérience de régénération sur le système de biocapteur proteinA. ligne 1 (rouge « R ») est réservé pour l’échantillon de référence (c'est-à-dire la matrice en l’absence d’analyte) ; rang 2 (aquamarine) est un ensemble de normes (les concentrations sont en µg/mL) ; lignes 3 et 4 (orange) sont des ensembles de hautes et basses des contrôles positifs (« PL » et « PH », respectivement) ; lignes 5 à 10 (violet) contiennent des échantillons inconnus ; lignes 11 et 12 (gris) sont des positions de programme par défaut pour la régénération (« R ») et les tampons de neutralisation (« N »). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : un) profils de densité et de la viabilité de cellules viables en moyenne âgés de plus d’un lot. ± 1 écart-type est également indiqué pour indiquer le contrôle étroit de la croissance cellulaire dans les systèmes MICROBIOREACTEUR. b) moyen profil nutritionnel pour le glucose et glutamine ainsi que le profil de sous-produit moyenne pour le lactate. ± 1 écart-type est également indiqué pour indiquer le contrôle serré de composition de médias dans les systèmes MICROBIOREACTEUR. (N = 3, toutes les conditions ont été exécutées en trois exemplaires). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Représentatif-boîte à moustaches de productivité spécifique moyenne des diverses conditions médias. (N = 3, toutes les conditions ont été exécutées en trois exemplaires) S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Fonctionnant avec le système automatisé de bioréacteur micro correctement et efficacement implique l’exécution en temps opportun de multiples étapes automatisées. Une des parties plus importantes du fonctionnement du système est le logiciel de programmation. S’il y a une erreur lors de l’écriture du programme, il y aura des erreurs graves dans l’expérience qui peut provoquer des changements inattendus dans le processus, stratégie, stratégie d’échantillonnage ou qualité du produit final qui peut infirmer les conclusions de l’étude de l’alimentation. Un autre aspect important du fonctionnement du système est de placer et serrer la bride de plaque correctement afin d’assurer un contrôle adéquat. L’indication plus courante que la plaque de fixation a été resserrée inégalement est inattendues variations mesures bateaux de 1, 6, 7 et 12 (cuves de réacteur de coin). Dans l’ensemble instabilité indique un relâchement des joints sur les lignes d’arrivée de gaz dans les flasques. Ce scénario peut gêner pour atteindre le point de consigne. Un autre écueil commun afin d’éviter quand commencer une expérience est de laisser les cellules s’asseoir trop longtemps au cours de l’étape de l’inoculation, obligeant à s’installer. Le moins de temps que les cellules passent séance, le moins de chance il n’y a que progressivement plus faible nombre de cellules d’inoculum est ajouté par ordre chronologique pour les cuves de réacteur qui peuvent induire des biais importants qu’involontairement nuit aux résultats de l’étude. Il est préférable d’ensemencer en plusieurs étapes, c'est-à-dire ensemencer chaque station piscicole l’un après l’autre avec pas de pause entre les deux, donc les cellules ne sont pas assis dans la plaque de l’inoculation pour plus de 15 minutes.
Concernant l’utilisation au quotidien, maintien de la stérilité est vital. Bien que le système soit dans une armoire de sécurité biologique, la stérilité n’est pas garantie en raison de fréquents mouvements dans et hors de la hotte. Par conséquent, tout ce qui se passe dans la hotte doit être vaporisé avec 70 % d’isopropanol. Deuxièmement, il est essentiel de veiller à ce qu’écumant minimale se produit au cours de la culture ; médias peuvent obstruer le gazage et épuiser les lignes, menant aux dommages du flasque et même des éléments de base ci-dessous. Mesures préventives anti-mousse addition sont critiques dans n’importe quelle conception du programme micro bioréacteur. Dans le cas d’une mousse « out », il serait bénéfique de suivre les protocole de nettoyage des fabricants et peut prévenir des dommages permanents des flasques. Alternativement, utiliser des navires non-barboté peut être bénéfique pour les plus faibles densités cellulaires ou lors de l’exécution en mode batch comme surface supérieur à rapport volumétrique permet à oxygène efficace même avec le manque d’un camion-citerne. Toutefois, les navires non-barboté peuvent s’avérer utiles pour des cultures cellulaires haute densité ou perfusion comme l’espace de tête ne suffit pas à rattraper les cultures en croissance de la consommation d’oxygène.
Il y a nombreux avantages fournis par le système de MICROBIOREACTEUR, car elle permet de multiples cultures contrôlées être exécuté en parallèle à une petite échelle avec un plus grand contrôle que secouer les flacons. 17 c’est pourquoi, le système facilite l’exécution des études, fait, clone haut débit et des études de transfection de dépistage. Manipulation de liquides automatique réduit également analyste-à-analyste variabilité tout en réduisant simultanément un travail fastidieux et beaucoup de temps pour personnel qualifié. Bien qu’il y a plusieurs avantages pour le système, il y a plusieurs inconvénients essentiels qui devraient être considérés. Tout d’abord, un volume de culture de 15 mL limite considérablement dans le processus d’échantillonnage et de matériel de récolte finale bioréacteurs à plusieurs alternatives à petite échelle (jusqu'à 500 mL) sont récemment devenus disponibles. Une récente promotion au système est l’intégration du bioréacteur microscale automatisé avec l’analyseur BioProfile FLEX 2 de Nova biomédicale, qui atténue le problème de processus d’échantillonnage en réduisant le volume de l’échantillon pour analyse de densité et d’éléments nutritifs des cellules . Avantages peuvent inclure la configuration rapide et pratiquement aucun nettoyage conduisant à des économies opérationnelles, mais le coût des unités jetables doit être considéré pour les projets à long terme comme il peut être plus coûteux d’acheter les parts que les systèmes conventionnels réutilisables.
La méthode décrite dans cet article est principalement adaptée pour la culture cellulaire mode traitement par lots, mais peut être modifiée selon les besoins de l’utilisateur. Chaque station piscicole a un contrôle indépendant de la température, tandis que l’et le pH peuvent varier au niveau des cuves de réacteur individuels. Sartorius propose également DoE logiciel spécialement conçu pour permettre des expériences de planification doit être adaptée pour le système de micro bioréacteur. Études de DoE à grande échelle en utilisant le nouveau logiciel DoE fourni par le fabricant peuvent aider dans les médias et supplément d’optimisation. Bien que ne pas utilisé ici, le système MICROBIOREACTEUR permet également aux études fed-batch. Le système n’a pas encore été optimisé pour les cultures de cellules de perfusion. Cependant, il y a des études limitées et essais pour imiter les opération de culture de cellule perfusion dans le système actuel de bioréacteur micro. 26 cette méthode peut être modifiée pour imiter les cultures de perfusion de haute densité par la cellule de décantation. En faisant varier la hauteur à laquelle la pipette est insérée dans le réacteur et en optimisant le temps, les médias peuvent être enlevés et réapprovisionnés en mode miroir profusion de culture. Il existe des nouveaux produits dans ce domaine en développement qui fonctionne mieux que le système présenté ici si vous désirez mode de perfusion de la culture.
En résumé, cette étude illustre l’utilisation de micro-bioréacteurs automatisés et associés analytique pour les opérations de culture de cellules CHO à produire et à caractériser un anticorps Monoclonal IgG1 de modèle. Il met l’accent sur le rôle à petite échelle micro-bioréacteurs jouent dans la fabrication de bioprocédés et leur impact sur le développement de la culture des cellules et contrôle des médias. Bien qu’il y a plusieurs avantages à utiliser un système automatisé à petite échelle, afin de réaliser pleinement leurs prestations de compréhension des processus et caractérisation analytique est impérative. Cette étude fournit à l’utilisateur avec une ligne directrice pour utiliser un système de réacteur microscale automatisé, qui peut être développé et amélioré par les besoins de recherche individuelles.
Disclosures
AVERTISSEMENT : Cette publication reflète les opinions de l’auteur et ne doit pas être interprétée pour représenter les vues ou les politiques de la FDA.
Acknowledgments
Les auteurs aimeraient remercier Scott Lute pour l’appui analytique, qu'ils ont fourni. Partielle de financement interne et le soutien pour ce travail a été fourni par le programme du chemin critique CDER (CA #1-13). Ce projet a été soutenu en partie par une nomination pour le programme de Participation de stage/recherche au Bureau des produits de la biotechnologie, US Food and Drug Administration, administré par l’Institut d’Oak Ridge, aux sciences et à travers un accord interinstitutions entre le U.S. Department of Energy et de la FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
