Summary
Microbioreactor システムの様々 な条件下での 48 の並列細胞培養の同時操作の詳細なプロトコルが表示されます。細胞培養プロセス、収穫、その後抗体価分析を説明します。
Abstract
自動マイクロ バイオリアクター (15 mL) は、細胞培養技術者のための便利なツールをすることができます。彼らは、潜在的なプロセスの変動を最小限に抑えながら、さまざまな実験条件の同時実行を促進します。このアプローチのアプリケーションが含まれます: 選考、温度や pH の変化、メディア、補足の最適化のクローンを作成します。さらに、小型原子炉ボリュームが条件の広い範囲を調査実験の大きなデザインを助長します。これにより大幅にスケール アップする前に最適化する上流工程、時間と経済的な制約のせいで実験がより限られています。自動マイクロ バイオリアクター システムは従来の小規模で様々 な利点にシェイク フラスコやスピナー フラスコなどの携帯文化単位を提供します。ただし、パイロット スケールの中にプロセス開発重要な注意が必要これらの利点を実現することを確認します。ケアで実行された場合、システム高レベルの自動化を有効にすることができます、変数のより高い数と DOE を実行するようにプログラムできます、サンプリング時間を減らすことができます栄養アナライザーまたは細胞カウンターと統合します。現在自動マイクロ スケール バイオリアクター実験で紹介の専門家から派生したヒューリスティックの統合は、意味のある結果を妨げる共通の落とし穴を最小化できます。極端にここでのレイアウトの原則に従わない場合は高価な修理を必要とする機器の損傷につながることができます。さらに、microbioreactor システムは、培養条件の評価を困難にする小さい文化ボリュームを持ちます。数とバッチ モード文化のプロセスのサンプルの量は、限られた運用ボリュームが 10 mL 以下に落ちることはできません。このメソッドは利点とマイクロ バイオリアクター システムの欠点を説明します。
Introduction
モノクローナル抗体 (Mab) は、マウス 1975年1ハイブリドーマ細胞で初めて作られました。それ以来、組換えタンパク質の生産の開発の増加は増加のvivo で安全および有効性2,3,4に Mab を人間的に開催をされています。組換え蛋白質生産プロセスのほとんどを採用、彼らは血清自由なメディア、生来の人間のそれと同じような翻訳後修飾蛋白質を作り出す能力に合わせることができる容易さのため中国のハムスター卵巣 (CHO) 細胞タンパク質とホスト細胞5,6としてその信頼性。
速くと一貫した品質を持つ大規模患者集団のために製品を提供する需要が高まっています。経済的利益だけでなく自己免疫疾患、移植後合併症、関節炎、癌の7を含む今 Mab で扱われる疾患のレパートリーは増えています。現代商業 mAb 生産ラインの平均収量は 5 6 g/L の範囲で通常、5を上昇し続けます。一部、これが町細胞工学と高スループット バイオリアクター8を使用して改善された生産ラインのスクリーニングを通じて達成されました。ただし、蛋白質の生産の増加はほとんどは、プロセスの改善、メディアの最適化、細胞培養条件の進歩を含むと強化戦略7,9,10を餌に起因しています。高品質の蛋白質の効率的な生産のためにも適切な細胞の成長だけでなく、栄養補給は欠かせません。さらに、細胞化学量論的戦略最適化6,11を供給するために付加的な理解を必要とする特定の栄養素添加が必要です。伝統的な手法には、個々 のメディア コンポーネントの滴定および混合物設計とブレンドするとメディアが含まれます。ただし、これらのメソッドは時間のかかる、労働集約型であり、ヒューマン エラーの12,13に関連するリスクを伴います。
メディア最適化研究は、シェイク フラスコおよび原料および人的資本の点で価があります 1-2 L バイオリアクターの以前していました。マイクロ プレートにも使用されているが、これらのメソッドは、制限された拡張性を提供します。さらに、このメディア組成と供給戦略14,,1516によるみ変動を不明瞭にするバッチ間の可変性を導入する複数の時間のかかる実行必要があります。したがって、高スループットおよび非常に一貫した並列型バイオリアクター システム登場17,18,19,20の必要はありません。
伝統的なベンチ スケール バイオリアクターの操作に関連付けられた重要な費用で (0.5-5 L)、microbioreactors 得られた薬剤の生産の生物学的評価のためにコスト削減の代替を提供しています。21ベンチ スケール撹拌槽バイオリアクターは信頼性の高い感覚アレイ経由で緻密なデータを提供しています。フィードバック制御システム操作の簡単な監視を可能にします。ただし、アセンブリ、校正、洗浄、人件費、基板のコスト、および滅菌要件は高価なベンチ スケール撹拌槽バイオリアクターと動作するように労働集約的にします。シェイク フラスコ、マイクロタイター プレート コストの一部を削除、労働問題より大きいスケール バイオリアクターに関連付けられているが、これらの選択肢弱い制御加工条件を提供し、頻繁にただエンドポイント測定低密度データが生成されます。22
また、microbioreactors は細胞と上流工程の開発にスケール ダウン アプローチを提供する小さな作業ボリュームを利用します。Microbioreactor 実験の規模は、電源、基板、労働、スペース、およびユーティリティの利用率の低下によるランニング コストを減らすことができます。23 Microbioreactors、シェイク フラスコ彼らは彼らのサイズのため扱いやすいが、彼らは pH、温度、そのオンラインのフィードバック制御による伝統的なベンチ スケール バイオリアクターの利点を保持という点で溶存酸素と酸/塩基のような消費だけでなく、ガス組成を含む品質パラメーターのリアルタイム データ出力。Microbioreactor スケールは高スループット スクリーニング機能として、クローンの選択とプロセスの開発に役立つことができることができます。24
高度なマイクロ スケール バイオリアクターは、町細胞培養プロセス特性評価および開発18の効果的なツールであること示されています。ここで、古典に匹敵することが示されている並行して、48 の microbioreactors から成る自動 ambr15 システムは、スケール アップの研究でタンク炉を攪拌、25がメディアに最適化された事前作業と同様の方法で使用されていた生産モデル キメラ IgG16町 DG44 セルラインの組成物。価と成長に及ぼすさまざまなメディア条件は比較され、分析されました。本稿では、microbioreactor システムと原油メディア サンプルの解析を実行する一般的なガイドラインが提示されています。
Protocol
1. 種子鉄道拡張
注:このプロトコルの密度で 1 mL 組換え DG44 町セル在庫を格納されているを使用して 〜 3 × 107セル/mL。希釈と個々 の町のセルラインのタイムラインは、異なります。事前に使用し、それに応じて調整する細胞株の成長曲線を測定します。セルは最初シェイク フラスコに解凍して、後でスピナー フラスコに転送。シェイク フラスコと実行されます microbioreactors と播種密度ターゲットの数に基づいて実験に必要なスピナー フラスコの数を決定します。
- 急速に氷のままほんのわずかだけまで 37 ° C の水浴に浸すことによって CHO 細胞のストックのバイアルを解凍します。70% エタノール溶液と糸くずのティッシュを使用して瓶の外側を消毒します。バイオ セーフティ キャビネットに転送します。
- 再優しく上下にピペッティングにより細胞を中断し、8 mM L グルタミンと補われる 29 mL に予め温めておいたメディアを含む 125 mL の滅菌出されたシェイク フラスコに 1 mL を転送ペニシリン/ストレプトマイシン x。
注:特記されない場合は、このプロトコルでは「メディア」という用語は OptiCHO メディアとして定義以下。 - 場所は、37 ° C および 8% の CO2でインキュベーターで flask(s) を振る。130 rpm の速度で細胞を扇動するために軌道のシェーカーを使用します。
- 監視の実行可能な細胞密度 (VCD) デバイスを数える自動セルを使用して、毎日または手動で検定とトリパン ブルー色素。サブカルチャー (希薄) 細胞 (前 37 ° C にメディアをウォームするたびにセルを追加する必要があります) 新鮮なメディアでの接種後 72 時間最終巻が 125 mL スピナー フラスコ 100 mL になるようです。スピナー文化 70 rpm の速度でシェイク フラスコ培養に使用同じ条件で孵化させなさい。
注:サブカルチャー後、細胞は 0.7 1 x 106セル/ml の密度でする必要があります。最終密度が 0.5 × 106セル/mL 以下ではないことを確認します。スピナーでの接種のターゲット細胞密度に到達できない場合に 96 時間後サブカルチャー。 - 3 日目 (接種準備の前日)、スピナーに新鮮な予め温めておいたメディアを追加-≥ 90% の生存率を維持するために flask(s)。125 mL の容量を超えないようにします。6
2. 自動 microbioreactor システムを実行しています。
前提条件:ユーザーは製造元から適切な訓練を受けている必要があり、安全性とシステムの動作の状況に精通している必要があります。
- 細胞カウンターへの接続の初期化と
- オペレーティング ソフトウェア システムを初期化します。ソフトウェアを開く前にセル カウンターは、それぞれのソフトウェアと一緒に (材料の表を参照) が実行されていることを確認します。細胞カウンターは、システムに統合されます。
- ソフトウェアを開く前にセル カウンターのリモート接続に接続します。リモート デスクトップ アイコンをクリックし、「接続」をクリックしてくださいリモート デスクトップが接続されたら、携帯カウンター ソフトウェアを開きます。新しい試薬パック、空トリパン ブルーを無駄し、プライム システムをインストールします。
- リモート接続を最小限に抑えるため、テンプレートとして既存の実験を使用して新しいテストを作成するマイクロ バイオリアクター ソフトウェアを開きます。実験に名前を付けて保存します。自動化された細胞カウンターがソフトウェアのステータス タブの下で接続されていることを確認します。細胞カウンターのソフトウェアの状態をチェックすることも。
- プレートを定義して、血管を読み込み
注:消耗品および文化局とデッキに試薬の読み込みの向きは、図 1を参照してください。クランプ プレートを使用する重力 (固体用) サイクル前にオートクレーブにする必要があります。- 実行を開始する前に、ソフトウェアの模倣のセクションの実行中に使用されるプレートを定義します。各プレートの名前し、各 microbioreactor 文化ステーションにデッキ プレートを指定します。
- 24 ウェル プレートを使用して、メディアを充電するため、文化局の指定されたデッキに。場所 1 mL、4 mL ピペットの先端部は、図 1に示すようにセクションでボックスします。
- 文化局のそれぞれのデッキに接種 24 ウェル プレートを配置します。デッキ 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) プレート X 単一ウェル 1 を配置します。2 のデッキとデッキ 7 (位置図 1に示されているように) 24 ウェル消泡プレートに単一ウェル 1 M NaOH プレートを配置します。デッキ番号がダイアグラム ソフトウェアの「模倣」タブの下で表示されます。
- 安全キャビネット フード内側 (リングスパー ジャー装備) 培養容器を梱包から取り出します。文化駅あたり 12 滅菌培養容器を配置します。場所オートクレーブ船の上に板をクランプします。すべてのミキサーのインサートの穴が配置しやすく、同じ方向を向くことを確認します。
注:永久的なマーカーを使用すると、時間を節約し、収穫時の混乱を避けるために文化の駅でそれらを配置する前に培養容器を分類します。 - クランプ プレート O リングは、繰り返しオートクレーブ後消耗、従って慎重に各実験の前にオートクレーブに入れる前にチェックする最初の部分です。O リングの失敗した場合のバックアップとして滅菌クランプ プレートを維持することをお勧めします。
- クランプ プレートの上に攪拌板を置き、安全に挿入されます各ピンを確保します。提供のノブ、ネジとクランプ プレートを固定します。まで、彼らはタイトな手は、ノブを締めます。また左右のノブを締めクランプ プレートの配置のため。
注:クランプが表面に対してフラッシュされていないクランプ プレートの端にネジが均等にきつく締められる場合や、血管が溶存酸素 (DO) 制御の問題が発生します。これらの調整では問題が解決しない場合は、板の不完全なシールが文化の非能率的な毒ガス攻撃につながる可能性として O リングをチェックします。
- 自動マイクロ バイオリアクター ソフトウェアを実行します。
注:使用「工程」タブを編集または新しい手順を作成します。手順は、個別に開始およびプロセスを停止するようにプログラムする必要があります。新しいステップを作成または既存のステップ、ステップを編集するをダブルクリックします。 プロセスの手順タブの下「ステップを挿入」ボタンをクリックしてします。プログラムのステップは 10 の主要なセクションに分かれています: メディア充電、起動系消泡剤添加、DO/pH コントロール、背景ベース追加、一時停止 pH、接種、5 X 細胞数、10 X 細胞数, 栄養アナライザーのサンプリングおよび文化駅シャット ダウン。実行の継続時間は、バッチ モードで実行するとき 7-9 日の間に通常です。- システムを初期化し、適切な血管の有無を確認します。培養容器に付属するバーコードをスキャンします。文化ステーション空の容器または容器の使用されていない、同じバーコードを適用できます。
- システム設計プログラムは制御、ガス抜き、他の接続を確認した後開始されます。
注:ユーザーは、エラーが発生したユーザーのリスクで進む進むシステムに害のないと実験に割り込まないかどうかこれを行う場合でも、プログラムを続行できます。たとえば、毒ガス攻撃可能性がありますオフに特定の血管のエラーとして表示されますが、無視することができます実験では使用されません。
- 起動とメディアの充電
- システムまたは充電日メディアを最初の日の設定は、培養時間の 0 日として指定されます。
- [スタートアップ] セクションで、最初の負荷ピペットのヒント、1 mL、4 mL のヒントとしてプログラムします。既に配置されている場合、続行するをクリックしています。指定されたデッキでメディア プレート、1 × PBS、1 M 水酸化ナトリウム、消泡板、メディア充電プレートと接種プレートを配置または、プレスが次のステップに移動し続ける既に配置されている場合。
- 起動プロトコルの一部として、温度制御を開始し、37 ° C に温度を設定1000 rpm で行う攪拌スイッチ/pH モニターします。
- 充電プログラム メディアを次に、実行します。自動 microbioreactor システムの液体ハンドラーは、プログラムで対応付けの培養容器に媒体の版からメディアを分配します。追加するメディアは、変化するプロセス条件 OptiCHO です。
注:24 ウェルのプレートから 2 つの井戸は、各井戸のみ 8 mL の培地を収容できる容量 (13 mL) に 1 つの培養器を記入する必要。メディアは充電前に液体ハンドラーによって混合されているときに描画空気を防ぐために、各ウェルに 7-8 mL を使用します。 - メディアの充電が完了すると、元セル系消泡剤の 35 μ L は、培養器に消泡板から追加されます。培地によく混合されると、光の 30 分を許可/pH センサーが水和する。
注:断続的に発泡が検出された場合培養時間系消泡剤の同じボリュームが追加されます。6発泡が、視覚的に検出され、原子炉容器は発泡の毎日がチェックされます。系消泡剤が検出されるとすぐに追加されます。 - DO/pH コントロール監視と記録を行うと培地の pH を開始に切り替えた。少なくとも 2 時間は、50% のセット ポイントに到達することを許可します。
- 平衡後背景基本追加すべての培養容器の 7.1 の pH 設定ポイントを達成するためにオンにします。行うと pH 一晩平衡し、完全に水和されるを許可します。
- 一時停止した pH - 日 1 pH オフセット
- 次の日 (日 1 としてマーク)、実行という選択文化船一時停止 pH ステップが分析され、pH 補正オフセットが決定されます。
注:PH pH を相殺するためにサンプリングされる船の数は、ユーザーです。すべての原子炉からのサンプルは、バイオリアクター人口の良い表現があれば必要なできない場合があります。 - 指定されたデッキのサンプル チューブ ホルダー プレートを配置し、負荷マイクロ遠心チューブ キャップを開き、それらの横に隠れています。液体ハンドラーはプログラムで対応付けチューブに細胞培養液の 600 μ L を分配します。
-
すぐに削除するが正しくキャリブレーションされておりを QCs は (以下、「毎日の栄養と代謝物の分析」を参照) 実行されている栄養バイオアナライザーのサンプルおよび測定 pH。
注:サンプルは、pH の変化を引き起こす可能性が CO2のサンプルからの脱気、空気への暴露による pH 変化を避けるために、描画した後すぐ、個別に実行されます。 - 「継続」をヒット後それぞれのサンプルをそれ以外の場合次の手順は実行されません。
- サンプリング容器のオフセットを自動的に「コンパイル」ソフトウェアの外部、FLEX から派生した pH 値を入力します。手動でサンプル容器のオフセットを平均し、ユーザー pH「船データ」タブの下オフセットの列の下の番号を入力します。平均オフセットし全ての船舶に適用されます。少なくとも 2-3 時間、その後培養容器を接種することができますの平衡に pH を許可します。
- 次の日 (日 1 としてマーク)、実行という選択文化船一時停止 pH ステップが分析され、pH 補正オフセットが決定されます。
- 接種
- VCD を測定した後、スピナーの内容全体を転送-flask(s)、滅菌、250 mL の円錐形遠心チューブ、ペレットによる細胞へ室温で 140 x g で 10 分間遠心分離します。古いメディアを捨て、その最終的な密度は、菌を培養器に追加した後 1 x 106セル/mL をする必要があります十分な新鮮なメディアで再中断します。
- 浮遊細胞を無菌ふた 24 ウェル プレートの指定に追加します。うちの 2 mL を各培養器の感染源として削除されます、各ウェルに接種の 3 mL を追加します。
- フード内の指定されたデッキに接種プレートを配置します。蓋接種プレートの外側を 70% アルコールでボンネット内に配置する前にスプレーしてください。
- 細胞数を使用して自動細胞計数
- 接種後少なくとも 1 時間の平衡培養容器をしましょう。時間後、プログラムで X のセル数ステップ 5 を実行します。5 X では、細胞数を読み取るために使用希釈倍率を示します。
注:セルが遅れ位相で、5 X 細胞数は当初使用します。セルの指数のフェーズに到達した後、細胞数 × 10 が使用されます。サンプルや希釈ボリューム計測器は自動的に希釈倍率のアカウントし、最終的な値をそれに応じて調整されますに基づいています。 - 液体ハンドラーはまず培養器から細胞培養液の 120 μ l 加え、続いてセル カウンター カップに 1x PBS の 480 μ L を追加します。細胞数は自動化された細胞カウンターを使用して、読み取られます。この手順は、すべての船舶に対して繰り返されます。
- 細胞数は、培養時間の 1 日目の最後のステップです。細胞数と pH のデータと共にデータ (実行可能な細胞の密度と生存率) も記録されます毎日ソフトウェアによって。
注:ラインの目詰まりを防ぐために 70 %ipa で実行の期間中に少なくとも二回細胞カウンター カップをきれいに。線と流体セルはすべてのセルのカウントの後自動的にクリーンアップします。
- 接種後少なくとも 1 時間の平衡培養容器をしましょう。時間後、プログラムで X のセル数ステップ 5 を実行します。5 X では、細胞数を読み取るために使用希釈倍率を示します。
- 一時停止した pH - 日 2 pH オフセット
- 培養時間の 2 日、初期一時停止 pH 段階からサンプリングされたもの以外の培養容器を使用して「pH の休止」手順を繰り返します。
注:一時停止した pH の容器の人口の多くをサンプリング、pH 補正の良いオフセットを提供します。したがって、前の日から一時停止した pH 用同じ血管をサンプリングしません。
- 培養時間の 2 日、初期一時停止 pH 段階からサンプリングされたもの以外の培養容器を使用して「pH の休止」手順を繰り返します。
- 毎日の栄養や代謝物分析
- サンプル実験終了時まで 2 日目文化栄養分析のため撮影され、栄養バイオアナライザーを使用して分析します。
- 指定されたデッキのサンプル チューブ ホルダー プレートを配置し、負荷マイクロ遠心チューブ キャップを開き、それらの横に隠れています。液体ハンドラーは、プログラムで対応付けチューブに細胞培養液が調剤されます。
注:最初の数日 (日 2-4) 文化容器から採取したサンプルの量は 300 μ L です。これは 300 μ L の液体ハンドラーによって調剤 1x PBS で希釈されています。これは文化ボリュームを節約し、レベルの 10 mL 以下のドロップを防ぐのためです。さらに、最初の数日間の栄養値は希釈後器械の検出範囲に収まります。 - 栄養分析を実行アナライザー トレイにサンプルを配置します。
注:同じ日の分析はない任意のサンプルを凍結します。
- システムのシャット ダウン
- 実行を終了、最初動揺続く温度制御オフにします。第二に、DO を停止/pH コントロールと背景ベースの追加。第三に、他のすべてのコントロールを停止します。最後に、システム モニターを停止します。
- クランプをネジし、プレートを攪拌培養容器を削除します。-リントフリー文化局の内側をきれいに。文化ステーションの乾燥プレートを置きにそれらを台無しにします。
注:乾燥周期システムの冷却のバージョンに必要なシステムの標準的なバージョンの必要はありません。 - プログラムで 2 時間乾燥サイクルを実行します。きれいな純水を用いたクランプ板 70% イソプロピル アルコール (IPA) 行で可能な限り凝縮液を削除する後。任意の残留液体を除去する空気とフラッシュします。
- バイオリアクター ソフトウェアを一度で「停止」をクリックして乾燥サイクルを終了しました。
3 細胞培養収穫
- 原子炉容器から細胞培養液を転送し、室温で 5 分間 1,962 x g で細胞のペレットします。
- 上清をデカントします。0.22 μ m PVDF フィルター滅菌フィルター デカントし細胞培養液を使用しています。
- 1.5 mL に無菌細胞培養液の分注 1 mL エッペン チューブ価分析のため。-20 ° C で 1 mL 管を格納します。タンパク質の高速液体クロマトグラフィーを用いた収穫された細胞培養液の残りの部分を浄化します。6
4. 測定 IgG 抗体
注:これは、実行と proteinA バイオ センサー システムを用いた試料の分析の大まかな概要です。すべてのアッセイのパラメーター (例えば温度、読み取り時、rpm、等) は、サンプルの種類ごとに経験的決定必要があります。
- システムをオンにし、ランプを解凍し、室温に釣り合うに冷凍庫から少なくとも1 h. 削除サンプルのウォーム アップ。
- システム ソフトウェアでプレート温度を 26 ° C に設定します。前 30 分に少なくともサンプル マトリックス (携帯メディアなど) で使用する蛋白質 A のヒントの数を浸しなさい。
注:最適な温度は、経験的に決定する必要があります。26 ° C の温度はここで解析時間は長く中にサンプルの蒸発を最小限に抑え、(周囲温度数度であること) によって一貫性のある温度を保持するために楽器が許可されます。≥ のサンプル ステージ 10 分サンプル プレートをインキュベートしてで事前測定前に選ばれたアッセイ温度平衡なければサンプルする必要があります。 - 10 mg/mL に集中して同じ抗体を用いたタンパク質標準曲線を構築し、直列を検出できる必要がある範囲でサンプル マトリックス (すなわちメディア) で希釈します。
注:高濃度、希釈のためのマトリックスの影響を最小限に抑えるための抗体を得ることが重要だもない以上抗体を集中し、凝集を誘導する重要です。各サンプル プレートのプレートに標準曲線を実行することをお勧めします。最小限、先端にチップとプレートの変動を考慮する肯定的なコントロールを使用する必要があります。ヒントが使用される蛋白質の各の新しい多くの生成、新しい標準カーブする必要があります。 - サンプル プレートをデザイン (例については、図 2を参照)。タンパク質 A、未知の文化のサンプル、標準、およびコントロールを含む、最大 80 のサンプルの再生を使用してアッセイを分析できます。各プレートは分析の単一蛋白質チップはプレート (列 1-10)、各サンプル間に再生成サイクルの最大 10 個のサンプルを測定に使用されます。
注:プレート (A 行) の最初の行全体がネガティブ コントロールと参照として使用することをお勧めします。ここで説明のアッセイで B と C の行を使用して、2 つの肯定的なコントロールの1 つの下で一度に 1 つ線形応答の上限。これにより、各チップのサンプルを分析する前に正と負のコントロールを測定します。この設定には、解析ソフトウェアで参照減算も簡略化されます。残りの井戸は、未知のサンプルの使用されます。先端の乾燥防止のためよくで行列する必要があります、行の 1 つのサンプルのギャップがある場合 (すなわち井戸 A2 G2 からサンプルを持っている H2 がないです。確実 H2 には先端が H3 をサンプルする前に、の乾燥しませんようにサンプル マトリックスが含まれています)。最後に、複数の板を分析する設定の 1 つを使用してヒントを排出しません。新しいを使用して、すべての板の非再生セットを推奨します。 - ゆっくり混合することによって分析用サンプルを準備する、管の下部にサンプルを収集するためにパルス スピン反転またはピペットによって続きます。集中のサンプル、サンプル マトリックスで希釈することによって適切な希釈複製を作成します。
注:タンパク質の抗体のバインドの線形範囲バイオ層干渉 (結合) 測定は抗体、アッセイ条件とマトリックスの両方によって異なります。これを決めておく経験的な適切なサンプルの希釈液を使用します。 - 測定時間をできるだけ近くに 96 ウェル サンプル プレートを準備します。井戸のいずれかの中に気泡がないことを確認します。きれいなピペット チップまたは遠心分離によっての空気の泡を削除します。
- システムにプレートを読み込み、「再生と高い感度分析」データ集録ソフトウェアの既定の設定を使用して分析を実行します。HT データ解析ソフトウェアを使用して分析します。
注:プレートを事前の制約のために準備する場合は、蒸発を防ぐためにフィルムを確実にシールします。期待される抗体によっては、集録速度や時間を調整する必要があります。マニュアルの説明を参照してください。 - データ分析ソフトウェアを使用すると、参照は減算し、合う線形ポイント ツー ポイントと標準曲線と初期傾斜 (IS) 機能を使用して未知試料の濃度を計算します。
Representative Results
重要なプロセス パラメーターと細胞培養の操作を通して他の携帯文化のパラメーターを監視する条件で重要な側面です。細胞カウンターと栄養のアナライザーは、細胞の成長、栄養の消費と副産物の形成を特徴付ける属性を 5 つを定量化する使用されました。細胞数は、培養条件を毎日得られました。平均実行可能なセル密度と目が、± 1 SD 間隔と共に図 3に見られるようにです。栄養物および副産物のプロファイルも文化の固定相を ± 1 SD の間隔で示されます。このプロファイルの斜面は、平均ブドウ糖とグルタミンの消費量と乳酸生産率を表します。全体的にみて、これらの結果は、microbioreactor システムのこれらの属性を監視の可能性を実証します。タイトな範囲内でこれらのパラメーターを維持する microbioreactor システムの機能だけでなく、
細胞培養の総合的な生産性収穫の細胞培養媒体は 0.22 ミクロン PVDF フィルターを通して渡された後、proteinA バイオ センサー システムを用いて定量化。0.87 pg/ニ 〜 1.15 pg/セル-d図 4に見られるようにセルごとの特定の生産性。基づくこれらの結果、メディア構成を選択する条件の広い配列を調べることができます、実験手順の最小限の投資の生産供給の蛋白質の量を最大化する戦略。
図 1:4 文化局 (CS) 各 12 の原子炉容器を持つ microbioreactor システムのレイアウト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:ProteinA バイオ センサー システムの再生実験と基本的な定量分析の例サンプル プレート設定します。参照サンプル (検体欠席、すなわち行列); 行 1 (赤"R") を予約します。基準 (濃度が μ g/mL) のセットは、行 2 (アクアマリン)行 3 と 4 (オレンジ)、低、高のポジティブ コントロールのセット ("の PL"と"PH"それぞれ);行 5 ~ 10 (紫) を含む不明なサンプルです。行 11 および 12 (グレー) は、("R") の再生と ("N") の中和バッファー プログラム デフォルトの位置です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:は) 歳以上バッチの実行可能な細胞の密度と生存率のプロファイルの平均します。± 1 SD も、microbioreactor 系における細胞増殖のタイトなコントロールを示すに表示されます。ブドウ糖とグルタミンと乳酸の平均副産物プロファイル b) 平均栄養プロファイル。± 1 SD も、microbioreactor システムのメディア組成を厳密に制御を示すに表示されます。(N = 3、すべて条件実行された 3 通)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:種々 のメディア条件の平均特定の生産性の代表的なボックス プロットします。(N = 3、すべて条件実行された 3 通)この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
自動マイクロ バイオリアクター システムを正しく実行して効率的にタイムリーに複数の自動化された手順の実行が含まれます。ソフトウェアのプログラミング システムを実行する最も重要な部分の 1 つです。プログラムの書き込み中にエラーがある場合、戦略、サンプリング戦略や、研究の調査結果が無効になる最終製品の品質を供給プロセスで予期しない変更があります実験で重大なエラーがあるなります。システムを実行する別の重要な側面は、配置し適切な DO 制御を確実にクランプ プレートを正しく締です。そのクランプ プレートが厳しくない均等に最も一般的な徴候は容器 1、6、7、12 (角容器) は測定で予期しないバリエーションです。全体的には不安定性は、クランプ プレートのガス入口行でガスケットの緩みを示します。このシナリオは、かセット ポイントに到達を妨げる可能性があります。細胞実験を開始させる、ときを避けるためにもう一つの一般的な落とし穴は、接種手順では、それらを解決するための原因の中にあまりにも長い座っています。セルを座って過ごす時間が短く、少ないチャンスに徐々 に低い菌細胞数が、無意識のうちに重要なバイアスを引き起こすことができる容器に年代順に追加検討結果に害を与えます。すなわち細胞が 15 分以上接種プレートに座っていないので、一時停止の手順を 1 つの別の後各文化ステーションの接種を間に、複数の段階で接種することをお勧めです。
に関する日常的な使用、無菌性を維持することが重要です。システムは、生物学的安全キャビネットでは、フード、頻繁な出入りのため不妊は保証されません。その結果、70% の IPA でフードに行くすべて散布されること。第二に、それはカルチャーの中に最小限の泡が発生するようになってメディアは、毒ガス攻撃を詰まらせるし、クランプ プレートともコア コンポーネント下の損傷につながるラインを排気できます。予防対策フォーム追加の手順、あらゆるマイクロ バイオリアクター プログラム設計で重要です。うちの「泡」が発生した場合それはプロトコルを洗浄メーカーに有益であろうし、クランプ プレートの永久的な損傷を防ぐことができます。また、容積の比率に高い表面により、ほとんどの欠如とも効率的な酸素をバッチ モードで実行しているとき、非通気の容器の使用が細胞密度が低い、または有益な可能性があります。ヘッド スペースは成長する酸素の消費文化に追いつくために十分なしかし、非散布しました船は高細胞密度または灌流培養の役に立ちません。
それにより、フラスコを振るよりもより詳細に制御で小規模で並列に実行する複数の制御された文化として microbioreactor システムによって提供される多くの利点があります。17したがって、システム スクリーニングは、高スループットのクローン研究・遺伝子研究の実行を容易にします。自動液体ハンドリングも同時に訓練された人員のための退屈な時間のかかる労働を最小限に抑えながらアナリストのアナリストの変動が減少します。システムにいくつかの利点がありますが、考慮すべきいくつかの重要な欠点があります。15 mL の培養量最初に、プロセスでサンプリングと最後の収穫材料と複数の代替小規模バイオリアクターが大幅に制限 (最大 500 mL) 最近利用可能になっています。システムに 1 つの最近の進歩はノヴァ生物医学、細胞密度や栄養分析のための試料量を減らしてのプロセス サンプリング問題が緩和されるから BioProfile FLEX 2 アナライザー自動マイクロ バイオリアクターの統合.利点は、再利用可能な従来のシステムよりもユニットを購入するより高価なことがありますよう、長期的なプロジェクトのため使い捨てのユニットのコストを考慮する必要があります迅速なセットアップと運用コスト削減を事実上クリーニング先頭を含めることができます。
本稿で説明する方法は主にバッチ モード細胞培養に適していますが、ユーザーのニーズに応じて変更することができます。各文化ステーションと pH は、個々 の容器のレベルで変えることができる間、温度を独立に制御しています。縫は、マイクロ バイオリアクター システムに応じて変更する DoE 計画実験をできるように特別に設計されたソフトウェアを提供しています。製造元によって提供される新しい DoE のソフトウェアを使用して大規模な DoE 研究や最適化を補うメディアのに役立ちます。ここで使用していませんが、microbioreactor システムは、フェッド バッチ研究もできます。システムが灌流培養に最適化されていません。しかし、限られた研究と現在のマイクロ バイオリアクター システムで灌流細胞培養操作を模倣する試みがあった。26細胞沈降によって高密度灌流文化を模倣するようにこのメソッドを変更できます。原子炉にピペットを挿入されている高さを変化させることで、整定時間を最適化することにより、メディアを削除し、文化の豊富さミラーモードに補充することができます。文化の灌流モードが必要な場合ここで紹介システムより動作がありますこの発展途上地域に新製品があります。
要約すると、この自動マイクロ バイオリアクターの使用に示しますとの関連を生成し、モデル IgG1 モノクローナル抗体を特徴付ける町細胞培養操作の分析。ロールプレイ小規模マイクロ バイオリアクター バイオ製造とその細胞培養技術開発とメディア審査への影響を強調しています。自動化された小規模なシステムを使用する多くの利点がありますが、その利点プロセスに関する理解を完全に実現するために、分析特性が不可欠です。本研究は、開発および個々 の研究ニーズごとに改善できる自動マイクロ原子炉システムを使用するためのガイドラインとユーザーを提供します。
Disclosures
免責事項: この出版物は著者の見解を反映しているし、FDA のビューまたはポリシーを表す解釈すべきではないです。
Acknowledgments
著者は、スコット リュートの分析の支援を感謝したいです。内部資金の一部とこの仕事のためのサポートは、品評クリティカル パス プログラム (CA #1-13) によって提供されました。このプロジェクトは、バイオ テクノロジー製品のオフィス、米国食品医薬品局、科学および教育のオークリッジ国立研究所によって管理でインターンシップ/研究参加プログラムに予約制で一部サポートされていた、米国エネルギー省と FDA の省庁間の契約。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
