Summary
Detaylı bir protokol 48 paralel hücre kültürlerinde bir microbioreactor sisteminde çeşitli koşullar altında eşzamanlı işlem için sunulmaktadır. Hücre kültür süreci, hasat ve sonraki antikor titresi analiz anlatılmıştır.
Abstract
Otomatik microscale Biyoreaktörler (15 mL) hücre kültür mühendisleri için yararlı bir araç olabilir. Onlar potansiyel işlem değişkenlik en aza indirirken çok çeşitli deneysel koşullar eşzamanlı yürütülmesi kolaylaştırmak. Bu yaklaşımın uygulamaları: clone tarama, sıcaklık ve pH vardiya, medya ve ek en iyi duruma getirme. Ayrıca, küçük reaktör birimleri büyük tasarım, çok çeşitli koşulları araştırmak deneyleri için elverişli. Böylece ters yönde süreçleri önemli ölçüde ölçek-up önce optimize nerede deneme daha kapsam zaman ve ekonomik kısıtlamaları nedeniyle sınırlıdır. Otomatik microscale biyoreaktör sistemleri sallamak şişeler veya spinner şişeler gibi hücre kültür birimleri geleneksel küçük ölçekli çeşitli avantajlar sunuyor. Ancak, sırasında pilot ölçek süreç geliştirme önemli bu avantajları gerçekleştirilmektedir sağlamak için özen göstermelidir. Bakım ile çalıştırdığınızda, sistem yüksek düzey Otomasyon etkinleştirebilirsiniz, DOE'nun değişkenleri daha yüksek bir sayı ile çalıştırmak için programlanmış ve örnekleme zamanı azaltabilirsiniz bir besin Analyzer'ı veya hücre sayaç ile entegre. Burada, geçerli otomatik microscale biyoreaktör deneyler ile sunulan uzman kaynaklı heuristics entegrasyonunu anlamlı sonuçlar engel ortak tuzaklar en aza indirebilirsiniz. Aşırı, aksi takdirde burada ortaya konulan ilkelerine uygun pahalı onarım gerektiren ekipman hasar neden olabilir. Ayrıca, microbioreactor sistemleri karakterizasyonu hücre kültür koşulların zorlaştıran küçük kültür birimleri var. Alınan örnekler işlem içi toplu iş modu kültür miktarı ve numarası işletim birimleri 10 mL dalamıyorum gibi sınırlıdır. Bu yöntemin avantajları ve dezavantajları microscale biyoreaktör sistemleri ele alınacak.
Introduction
Monoklonal antikor (mAbs) ilk 19751fare Hibridoma hücrelerde üretildi. O zamandan beri Rekombinant protein üretim geliştirme bir artış artış vivo içinde güvenliği ve etkinliği2,3,4mAbs insancıllaştırmaya yerini almıştır. Rekombinant protein üretim süreçleri çoğu Çin Hamster Over (CHO) hücreleri ile hangi onlar serum boş ortam, doğuştan gelen bir insan için benzer translasyonel modifikasyonlar ile proteinleri üretmek için yeteneklerini için adapte edilebilir kolaylaştırmak için istihdam protein ve onların güvenilirlik ana hücreleri5,6.
Daha hızlı ve tutarlı kalitesi ile daha büyük hasta nüfus için ürün sunmak için artan talebi. Ekonomik faydaları yanı sıra, mAbs tarafından tedavi hastalıkları repertuar, artan şimdi otoimmün hastalıklar, transplantasyon sonrası komplikasyonlar, artrit ve kanser7içerir. Modern ticari mAb üretim hatları için Ortalama verimleri genellikle 5-6 g/L aralığında olan ve5yükselmeye devam ediyor. Kısmen, bu CHO hücre mühendislik ve yüksek üretilen iş Biyoreaktörler8kullanılarak geliştirilmiş üretim hattı tarama tamamlandıktan. Ancak, çoğu protein üretim artış medya optimizasyon, hücre kültür koşulları, gelişmeler de dahil olmak üzere ve stratejileri7,9,10besleme gelişmiş geliştirmeleri, işlemek için isnat. Besin takviyesi sadece uygun hücre büyüme yüksek kaliteli protein verimli üretim için de gereklidir. Ayrıca, hücreleri strateji en iyi duruma getirme6,11beslenmesi için ek anlayış gerektiren belirli besin stokiometrik eklenmesi gerektirir. Geleneksel en iyi duruma getirme yöntemleri tek tek ortam bileşeni titrasyon ve medya karışımı tasarımları ile karıştırma içerir. Ancak, bu yöntemler zaman alıcı, emek yoğun olarak kullanan ve insan hatası12,13ile ilgili riskler içerir.
Medya optimizasyon çalışmaları daha önce sallamak şişeler ve hammadde ve insan sermayesi açısından çok pahalı olabilir 1-2 L Biyoreaktörler dayanıyordu. Mikroplaka da kullanılmıştır ama bu yöntemleri sınırlı ölçeklenebilirlik sağlar. Ayrıca, bu hala neden medya kompozisyon ve beslenme stratejisi14,15,16CQA değişkenlik gizlemektedir toplu iş toplu iş değişkenlik tanıtmak birden çok zaman alıcı çalıştırma gerektirebilir. Böylece, gerek yüksek üretilen iş ve son derece tutarlı paralel biyoreaktör sistemleri ortaya çıktı için17,18,19,20.
Geleneksel tezgah ölçekli Biyoreaktörler çalışması ile ilgili önemli masraf ile (0,5-5 M), microbioreactors uyuşturucu türetilmiş üretimi biyolojik olarak değerlendirilmesi için bir maliyet azaltma alternatif sunuyoruz. 21 tezgah ölçekli karıştırılır-tank Biyoreaktörler güvenilir ve duyusal dizileri ile yoğun veri sağlar. Geribildirim kontrol sistemleri kolay işlem gözetimi için izin verir. Ancak, derleme, kalibrasyon, temizlik, işçilik maliyetleri, substrat maliyeti ve sterilizasyon gereksinimleri tezgah ölçekli karıştırılır-tank Biyoreaktörler pahalı ve emek yoğun çalışmasına olun. Shake şişeler ve microtiter plakaları maliyeti azaltın ve daha büyük ölçekli Biyoreaktörler ile ilgili sorunları emek ama bu alternatifleri işleme koşulları zayıf denetim sağlayan ve düşük yoğunluklu veri, genellikle sadece noktalardan ölçümleri üretmek. 22
Alternatif olarak, microbioreactors hücre kültürünü ve ters yönde süreç geliştirme için bir ölçek aşağı yaklaşım sağlamak için küçük bir çalışma birimi kullanmak. Microbioreactor deneyler ölçeğini daha düşük güç, substrat, işçilik, uzay ve yardımcı programları kullanımı ile maliyet hesaplamasını önemli ölçüde düşürebilir. 23 sallamak şişeler onlar onların büyüklüğü nedeniyle kolay, ama onlar geleneksel tezgah ölçekli Biyoreaktörler pH, sıcaklık, onların online geribildirim kontrol avantajları korumak o çözünmüş oksijen ve asit/baz gibi Microbioreactors vardır tüketimi hem de kalite parametrelerini gaz bileşimi gibi onların gerçek zamanlı veri çıkışını. Microbioreactor ölçek klon seçimi ve süreç gelişimi için yararlı olabilir yüksek üretilen iş tarama yeteneği sağlar. 24
Gelişmiş Microscale biyoreaktör CHO hücre kültür işlem karakterizasyonu ve geliştirme18için etkili bir araç olarak gösterilmiştir. Burada, bir otomatik ambr15 sistemi, klasik için karşılaştırılabilir olduğu gösterilmiştir 48 microbioreactors paralel, oluşan tank reaktörler ölçeğinde çalışmalar kadar karıştırılır,25 medya en iyi duruma getirilmiş ön çalışma için benzer bir şekilde kullanılmıştır kompozisyon bir modeli chimeric Igg16üreten bir CHO-DG44 hücre satırı için. Büyüme ve titresi değişen medya şartlar etkileri karşılaştırıldığında ve analiz. Bu yazıda microbioreactor sistemi ve analiz ham medya örnekleri çalıştırmak için genel bir kılavuz sunmuştur.
Protocol
1. tohum genişleme Tren
Not: Bu protokol saklanan 1 mL rekombinant DG44 CHO hücre hisse senetleri yoğunluğu kullanır ~ 3 x 107 hücre/mL. Dilutions ve zaman çizelgeleri bireysel CHO hücre hatları için değişir. Ölçü büyüme eğrileri önceden kullanılan ve buna göre ayarlamak için hücre satırı. Hücreler başlangıçta sallamak şişeler çözdürülen ve daha sonra bir spinner şişesi için transfer. Shake şişeler ve spinner şişe çalıştırılacak microbioreactors ve hedefin yoğunluğu tohum sayısına göre deney için gerekli sayısını belirleyin.
- Hızlı bir şekilde hisse senedi vial(s) CHO hücre bir 37 ° C su banyosunda buz kalır sadece küçük bir kıymık kadar çeker tarafından çözülme. % 70 etanol çözüm ve hav bırakmayan bir doku kullanarak şişe dýþýna dezenfekte etmek. Bir Biyogüvenlik kabini aktarın.
- Hücreleri yukarı ve aşağı pipetting hafifçe tarafından yeniden askıya alma ve 8 mM L-glutamin ve 1 ile 29 mL önceden ısıtılmış ortamı içeren bir steril 125 mL Bacalı sallamak şişesi 1 mL transfer penisilin/streptomisin x.
Not: Aksi belirtilmediği sürece, bu protokolü "medyada" terimi bundan sonra OptiCHO medya tanımlanır. - Yer flask(s) 37 ° C ve % 8 CO2' de tutulan bir kuluçka sallamak. Orbital çalkalayıcı hücreleri, 130 rpm hızında kışkırtmak için kullanın.
- Geçerli hücre yoğunluğu (VCD) aygıt sayma otomatik bir hücre kullanarak her gün izlemek ya da el ile bir hemasitometre ve trypan mavi. Alt kültür (sulu) hücreleri 72 saat sonra aşı taze medya (önceden sıcak 37 ° C ortam her zaman hücrelere eklenmelidir) öyle ki son hacim 125 mL spinner şişesi 100 ml'dir. Spinner kültürler sallamak şişesi kültürler, 70 rpm hızında için kullanılan aynı koşullar, kuluçkaya.
Not: Sonra alt kültür, 0.7-1 x 106 hücre/mL bir yoğunluk hücre olmalıdır. Son yoğunluğu 0,5 106 hücre/mL x altında olmadığından emin olun. 96 spinners aşılama için hedef hücre yoğunluğu ulaştıysanız h sonra alt kültür. - Günde üç inoculum hazırlıklar önce (bir gün), taze, önceden ısıtılmış medya için spinner eklemek-flask(s) ≥ % 90 canlılığı korumak için. 125 mL toplam hacim fazla olamaz. 6
2. otomatik microbioreactor sistemi çalıştıran
Önkoşullar: Kullanıcı uygun eğitim üreticiden almış olmalı ve güvenlik ve sistem için çalışma koşulları konusunda bilgi sahibi olmanız gerekir.
- Başlatılıyor ve hücre Counter için bağlanma
- Yazılım işletim sistemi başlatılamıyor. Yazılım açmadan önce hücre sayaç ( Tablo malzemelerigörmek) ilgili yazılım ile birlikte çalıştığından emin olun. Hücre sayaç sistemi ile entegre edilmiştir.
- Yazılım açmadan önce hücre sayaç uzak bağlantısına takın. Uzak masaüstü simgesine tıklayın ve tıkırtı "Bağlamak üzerinde." Uzak Masaüstü bağlantı kurulduktan sonra hücre sayaç yazılımını açın. Trypan mavi atık ve sistem Başbakan yeni bir reaktif paketi, boş yükleyin.
- Uzak bağlantı en aza indirmek ve yeni bir deneme oluşturmak için şablon olarak varolan bir deney kullanma mikro biyoreaktör yazılımını açın. Adlandırabilir ve deneme Otomatik hücre sayaç yazılım durumu sekmesi altında bağlı olduğundan emin olun. Durumu ayrıca hücre sayaç yazılım üzerinde kontrol edilebilir.
- Plaka tanımlama ve gemilerin yükleme
Not: sarf malzemeleri ve reaktifler kültür istasyonları ve güverte üzerinde yükleme yönlendirmek için Şekil 1 bakınız. Kelepçe plakaları kullanmadan bir yerçekimi (katı malzemeler için kullanılır) döngüsü önce üzerinde autoclaved olmalıdır.- Koşuya başlamadan önce yazılımın kopyalama bölümünde çalışma sırasında kullanılan plakalar tanımlayın. Her plaka kullanılan isim ve microbioreactor kültür İstasyonu güvertede her plakasına atayın.
- 24-şey plaka medya şarj etmek için kullanma ve kültür İstasyonu belirlenen güvertesinde yer. Yer 1 mL ve 4 mL damlalıklı İpucu Şekil 1' de gösterildiği gibi bölümlerde kutuları.
- 24-şey aşı plaka kültür İstasyonu ilgili güvertede yerleştirin. Tek şey 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) plaka X 1 güvertede yerleştirin. Tek şey 1 M NaOH plaka güverte 2 ve güverte 7 ( Şekil 1' de gösterildiği gibi basamak) 24-şey ANTIFOAM tabağa yerleştirin. Güverte numaraları diagrammatically yazılım "Taklit" sekmesi altında gösterilir.
- (Sparger ile donatılmış) kültür damarları emanet dolabı kapağın içinde açmak. On iki steril kültür damarları kültür İstasyonu yerleştirin. Yer autoclaved kelepçe plakaları gemiler üstünde. Tüm karıştırıcı için sağlanan ekler delik daha kolay yerleşim için aynı yönde yüz emin olun.
Not: Kalıcı bir kalem kullanarak, kültür gemiler zaman kazanmak ve hasat zamanında karışıklığı önlemek için kültür merkezinde bunları yerleştirmeden önce kategorize. - Sonra tekrar tekrar ısıyla yıpratmak, bu nedenle dikkatli bir şekilde onları ısıyla her deneme önce önce kontrol için kelepçe plaka O-halkalar ilk parçasıdır. Yedekleme O-ring başarısızlık durumunda olarak steril kelepçe plaka tutulması önerilir.
- Karıştırın tabakları kelepçe plakaları üzerine yerleştirin, her PIN sağlanması güvenli bir şekilde eklenir. Kelepçe plakaları vida ve sağlanan kolları ile güvenli. Onlar el sıkı vardır kadar düğmeleri sıkın. Sol ve sağ düğmeleri alternatif olarak sıkın kelepçe plaka hatta yerleşim için.
Not: Kelepçe yüzeyine karşı aynı hizada değilse ya da düzensiz kelepçe plaka sonundaki vidalar sıkılır, gemilerin çözünmüş oksijen (DO) kontrol problemleri yaşayacaksınız. Bu ayarlamalar yapmak sorun düzeltmezseniz, tabak eksik mühürleme verimsiz kültürünü gaz için yol açabilir gibi O-halkalar kontrol edin.
- Otomatik mikro biyoreaktör yazılımı çalıştıran
Not: kullanım "İşlem adımları" sekmesini düzenlemek veya yeni adımları oluşturmak için. Adımları ayrı ayrı herhangi bir işlemi durdurmak ve başlatmak için programlanmış gerekiyor. Yeni adımlar oluşturmak veya varolan bir adım bu adımı düzenlemek için çift tıklayın için işlem adımları sekmesi altında "Adım Ekle" düğmesini tıklatın. Program adımları on ana bölüme ayrılır: başlangıç, medya şarj, Antifoam ek olarak, / pH denetimi, arka plan Bankası eklemeler, duraklatıldı pH, aşılama, 5 X hücre sayısı, 10 X hücre sayısı, besin Analyzer örnekleme ve kültür İstasyonu kapatma. Çalışma süresi 7-9 gün toplu modunda çalıştırdığınızda genellikle arasındadır.- Sistem başlatır ve uygun gemilerin varlığı için denetler. Kültür gemi ile sağlanan barkod tarama. Aynı barkod boş damarları veya kullanılmayan gemiler ile kültür istasyonları için uygulanabilir.
- Sistem ile tasarlanmış program yapmak kontrolü, gaz ve diğer bağlantıları kontrol ettikten sonra başlayacak.
Not: Bir hata oluşur, ancak kullanıcının risk ve devam etmeden ileri sistem zarar vermez ve deneme kesme değil bunu bile Kullanıcı programı ile devam edebilirsiniz. Örneğin, gaz belirli hata olarak gösterilir ancak atlanabilir deneyde kullanılan değil damarları kapalı açık olabilir.
- Başlangıç ve medya şarj
- Sistem ya da gün şarj medya ilk gün kurma kültür zaman günü 0 olarak belirlenmiştir.
- Başlangıç bölümünde, ilk yük damlalıklı ipuçları, 1 mL ve 4 mL, programlanmış gibi. Zaten girdiyseniz, tıkırtı üstünde devam etmek. Medya plaka, 1 X PBS, 1 M NaOH, ANTIFOAM plaka, medya şarj plaka ve aşı plaka belirlenen güverte yerleştirin veya sonraki adıma geçmek devam zaten girdiyseniz, basın.
- Parçası olarak başlangıç iletişim kuralı, sıcaklık kontrolü başlar ve 37 ° c sıcaklık ayarla 1000 rpm ve DO karıştırma geçiş / pH monitör.
- Ardından, program şarj medya yürütmek. Otomatik microbioreactor sistemi sıvı işleyicisi medya plaka medyadan programda eşlenen kültür damarları dağıtmak olacaktır. Eklendi OptiCHO işlem koşulları farklı ortamıdır.
Not: Her şey sadece medya 8 mL barındırabileceği 24-şey plaka iki kuyu kapasitesi (13 mL), bir kültür damar doldurmak için gereklidir. 7-8 mL her kuyuya zaman medya şarj önce sıvı işleyicisi tarafından karışık çizim hava önlemek için kullanın. - Medya şarj işlem tamamlandıktan sonra eski hücreli antifoam 35 µL ANTIFOAM plaka kültür taşıyıcıyı eklenecektir. Kültürü de karışık olması orta ve optik yapmak için 30 dakika izin / sulu için pH sensörler.
Not: Antifoam aynı hacmi zaman zaman köpük algılandığında kültür zaman eklenir. 6 köpük görsel olarak algılanır ve reaktör gemiler köpük için her gün kontrol edilir. Antifoam hemen algılama eklenir. - DO / pH kontrolü o zaman açık izleme ve kayıt yapmak ve pH kültür ortamının başlatmak için. En az 2 h alır % 50, set noktası ulaşmak yapmak izin.
- 7.1 tüm kültür tekneler için bir pH set noktası ulaşmak için arka plan baz eklemeler yapmak denge sonra açın. Ve pH gecede equilibrate ve tamamen sulu için izin verir.
- Duraklatılmış pH - gün 1 pH ofset
- (1. gün işaretlenmiş) ertesi gün yürütmek sayede seçin kültür damarları duraklatılmış pH adım analiz ve bir pH düzeltme uzaklığı belirlenir.
Not: PH damarları pH mahsup için tatmak için belirlenen kullanıcı sayısıdır. Bir örnek her reaktör gemisinden biyoreaktör nüfusunun iyi bir temsil varsa gerekli olmayabilir. - Örnek boru tutucu aynaları belirlenen güvertelerde yerleştirin ve yük mikro santrifüj tüpleri kapakları açın ve yanlarında sıkışmış. Sıvı işleyicisi hücre kültür sıvı 600 µL programda eşleştirilmiş gibi tüp içine dağıtmak olacaktır.
-
Hemen bir besin bioanalyzer bu düzgün kalibre ve kendisi için QCs ("Günlük besin ve metaboliti Analizi aşağıda," bakın) çalıştırmak edilmiştir üzerinde örnek ve ölçü pH kaldırın.
Not: Örnekleri ayrı ayrı, hemen, CO2 örnekten gaz giderme pH değişiklikler neden olabilir pH değişiklikleri nedeniyle havaya, maruz önlemek için çizdikten sonra çalıştırılır. - "Devam" sonraki adım değil yürütülür her örnek sonra Aksi takdirde vurdu.
- "Uzaklıklar örneklenen tekneler için otomatik olarak derleme" yazılım, dış, FLEX elde edilen pH değerleri girin. El ile uzaklıklar örnek kapları elde edilen ortalama ve altında "Gemi veri" sekmesi altında Kullanıcı pH mahsup sütun numarasını girin. Ortalama uzaklığı sonra tüm gemileri için uygulanır. En az saat 2-3 sonra kültür damarları aşılamak için equilibrate pH izin.
- (1. gün işaretlenmiş) ertesi gün yürütmek sayede seçin kültür damarları duraklatılmış pH adım analiz ve bir pH düzeltme uzaklığı belirlenir.
- Aşı
- VCD ölçme sonra spinner tüm içeriğini transfer-140 x g oda sıcaklığında 10 dakika için centrifuging tarafından bir steril, 250 mL konik santrifüj tüpü ve Pelet hücrelere flask(s). Eski medya dikkatle boşaltmak ve son yoğunluk kültür taşıyıcıyı inoculum ekledikten sonra 1 x 106 hücre/mL olması gerekir öyle ki yeterli taze medyada yeniden askıya alma.
- Askıya alınan hücreler de steril bir tepecikte 24-şey plaka, belirlenen ekleyin. İnoculum 3 mL 2 mL dışarı inoculum için her kültür araç olarak kaldırılacak her şey ekleyin.
- Başlık içinde belirlenen güvertede inoculum tabak koyun. Kapağın yerleştirmeden önce % 70 alkol ile tepecikte inoculum plaka dışına sprey emin olun.
- Hücre sayaç otomatik kullanarak hücre sayımı
- Aşı sonra en az bir saat için equilibrate kültür damarları izin. Bir saat sonra hücre sayısı adım X 5 programda yürütmek. 5 X hücre sayısını okumak için kullanılan seyreltme faktörü gösterir.
Not: gecikme aşamasında hücrelerdir 5 X hücre sayısı başlangıçta kullanılır. Hücreleri onların üssel faz ulaştıktan sonra 10 hücre sayısı X kullanılacaktır. Örnek ve seyreltici birimleri araç otomatik olarak Google hesapları için seyreltme faktörü ve son fiyat uygun şekilde ayarlar temel. - Sıvı ilk 1 X PBS 480 µL hücre kültür sıvı 120 µL eklenmesi tarafından kültür gemisinden izledi hücre sayaç Kupası ekler. Hücre sayısı sonra otomatik hücre sayaç okunur. Bu adım için tüm gemileri yinelenir.
- Hücre sayısı kültür zaman günü 1 için son aşamasıdır. Ve pH verileri hücre sayısı ile birlikte veri (canlı hücre yoğunluğu ve canlılık) aynı zamanda günlük yazılım tarafından kaydedilir.
Not: Hücre sayaç Kupası satırlık tıkanma % 70 IPA ile çalışma süresi sırasında en az iki kez temiz. Çizgiler ve akış hücreli otomatik olarak her hücre sayımı sonra temizlenir.
- Aşı sonra en az bir saat için equilibrate kültür damarları izin. Bir saat sonra hücre sayısı adım X 5 programda yürütmek. 5 X hücre sayısını okumak için kullanılan seyreltme faktörü gösterir.
- Duraklatılmış pH - gün 2 pH ofset
- Günü kültür zaman 2, kültür gemiler ilk duraklatılmış pH adımı sırasında örneklenmiş olanlar dışında kullanarak "pH duraklatıldı" adımı yineleyin.
Not: Daha fazla gemi popülasyon duraklatılmış pH için örnekleme pH düzeltme için daha iyi bir uzaklığı sağlayacaktır. Bu nedenle, önceki günden itibaren duraklatılmış pH için kullanılan aynı gemiler örnek değil.
- Günü kültür zaman 2, kültür gemiler ilk duraklatılmış pH adımı sırasında örneklenmiş olanlar dışında kullanarak "pH duraklatıldı" adımı yineleyin.
- Günlük besin ve metaboliti Analizi
- Örnekleri ve besin bioanalyzer kullanılarak analiz besin analizi için deneme sonuna kadar kültür 2 gün alınacaktır.
- Örnek boru tutucu aynaları belirlenen güvertelerde yerleştirin ve yük mikro santrifüj tüpleri kapakları açın ve yanlarında sıkışmış. Sıvı işleyicisi hücre kültür sıvı programda eşleştirilmiş gibi tüp içine dağıtmak olacaktır.
Not: Başlangıç için kaç gün (gün 2-4) 300 µL kültür gemiden alınan örnek tutardır. Bu sıvı işleyicisi tarafından reçete 1 X PBS 300 µL ile seyreltilmiş. Bu kültür birimi korumak ve düzeyi 10 mL altında bırakarak önlemek için yapılır. Ayrıca, ilk birkaç gün için besin değerleri araç algılama seyreltme sonra aralıkta. - Örnekleri besin analizi yapmak için analyzer tepsisine yerleştirin.
Not: Aynı gün analiz değil herhangi bir örnekleri dondur.
- Sistem kapatma
- Çalıştır sona erdirmek için ilk ajitasyon tarafından takip sıcaklık kontrolü kapatın. İkinci olarak, DO durdurmak / pH kontrolü ve arka plan baz eklemeler. Üçüncü olarak, diğer tüm denetimler durdurmak. Son olarak, Sistem İzleyicisi'ni durdurun.
- Kelepçe sökün ve karıştırın tabakları ve kültür gemileri kaldırın. İçini kültür istasyonunun hav bırakmayan bir bezle temizleyin. Kültür istasyonda kurutma tabak yerleştirin ve onları vida.
Not: Döngüsü kurutma sistemi soğutulmuş sürümü için gereklidir ve sistem standart sürümü için gerekli değildir. - 2 saatlik kurutma döngüsü programa yürütün. Temiz Ultrasaf Su kullanarak kelepçe plakaları % 70 izopropil alkol (IPA) mümkün yoğun sıvı satırları kaldırmak için takip ettim. Artık herhangi bir sıvı kaldırmak için hava ile yıkayın.
- Tıkırtı üstünde "Dur" biyoreaktör yazılım bir kez içinde kurutma döngüsü tamamlandı.
3. hücre kültür hasat
- Hücre kültür sıvı reaktör gemiler aktarmak ve hücreleri 1,962 x g oda sıcaklığında 5 dakika için de cips.
- Süpernatant dikkatle boşaltmak. Bir 0,22 µm PVDF steril filtreyi çıkarmak hücre kültür sıvı kullanarak.
- Aliquot 1 mL steril hücre kültür sıvı içine 1,5 mL titresi analiz için Eppendorf tüpleri. -20 ° C'de 1 mL tüpler depolamak Hızlı protein sıvı kromatografi sistemi kullanarak hasat hücre kültür sıvı geri kalanı arındırmak. 6
4. ölçme IgG titreleri
Not: Bu çalışan ve proteinA biyoalgılayıcı sistemi kullanarak örnekleri analiz üstünkörü bir bakıştır. Tüm parametreleri tahlil ( Örneğin sıcaklık, okumak zaman, devir/dakika, vb ) gerekir kararlı ampirik olarak her örnek türü için.
- Sistemde açmak ve çözülme ve oda sıcaklığında equilibrate dondurucu gelen en az 1 h. Kaldır örnekleri için ısınmak lamba sağlar.
- Sistem yazılımı plaka sıcaklık 26 ° C'ye ayarlayın. Örnek matris (Örneğin hücre medya) 30 dakika en az için kullanılmak üzere Protein A ipuçları sayısını önceden ıslatın.
Not: Ampirik olarak belirlenecek optimum sıcaklık ihtiyacı var. 26 ° C sıcaklık burada örnek buharlaşma sırasında uzun analiz süreleri en aza indirmek ve enstrüman (ortam sıcaklığı yukarıda birkaç derece olma tarafından) sabit bir sıcaklık izin vermek için kullanılır. Örnekleri gerekir örnek plaka ≥ için örnek sahnede 10 dakika kuluçka tarafından önceden seçilen tahlil sıcaklık ölçüm önce için dengelenmiş. - 10 mg/mL konsantre aynı antikor kullanarak bir protein standart eğri oluşturmak ve seri olarak algılanması gereken aralıkta örnek matris (yani medya) oranında seyreltin.
Not: Matris etkileri seyreltme nedeniyle en aza indirmek için antikor yüksek konsantrasyon elde etmek önemlidir, ama değil üzerinde antikor konsantre ve toplama ikna etmek önemlidir. Her örnek tabak bir tabak standart eğri çalıştıran tercih edilir. En az, olumlu bir denetim uç uç ve plaka plaka değişkenliği için hesap için kullanılması gerekir. Bir yeni standart eğri gerekir bir ipuçları kullanılan protein her yeni birçok için oluşturulur. - Örnek plaka tasarım (örnek için lütfen bkz: Şekil 2). Bir protein A 80 örnekleri kadar rejenerasyon kullanır tahlil, bilinmeyen kültür örnekleri, standartları ve denetimleri içeren analiz edilebilir. Analiz her plaka için bir tek protein A İpucu plaka (sütun 1-10), her örnek arasında bir yenilenme çevrimi ile arasında en çok 10 örnekleri ölçmek için kullanılır.
Not: Bu ilk satırının tamamını plaka (a satır) negatif kontrol ve referans kullanılması tavsiye edilir. Burada tartışılan assay olarak, B ve C satır iki olumlu denetim için kullanılır; alt ve üst sınırı Dorusal Tepki teker teker. Bu örnekleri analiz daha önce negatif ve pozitif denetimleri her ucu ölçer sağlar. Bu kurulum da başvuru çıkarma analiz yazılımı kolaylaştırır. Kalan kuyu daha sonra bilinmeyen örnekleri için kullanılır. Satırlardan örnek boşluk ise ucu kurutma önlemek için o kadar iyi bir matris olmalıdır (yani Wells A2 G2 aracılığıyla var örnek H2 desteklemez. H2 emin olun ipucu değil kurumasına H3 örnek için geçmeden önce emin olmak için örnek matris içerir). Son olarak, ipuçları yanında istimal bir-birden çok tabak analiz etmek için ayarla egzoz değil. Yeni bir kullanarak, yeniden set her plaka için önerilir. - Yavaşça karıştırma tarafından analiz örnekleri hazırlamak, inversiyon veya pipetting, tüpün dibinde örnek toplamak için bir darbe spin izledi. Konsantre örnekleri için uygun seyreltme çoğaltır örnek matrisinde sulandrarak oluşturmak.
Not: Bağlama için bir antikor protein için doğrusal dizi bir biyo-katman Interferometry (BLI) ölçümleri antikor, tahlil koşulları hem matris tarafından değişir. Bu ampirik olarak önceden uygun örnek dilutions kullanılan emin olmak için tespit edilmelidir. - 96-iyi örnek plakaları tahlil zaman gibi mümkün olduğunca yakın hazır olun. Herhangi bir kuyu yok hava kabarcıkları olduğundan emin olun. Hava kabarcıkları Santrifüjü ya da temiz pipet ucu ile kaldırın.
- Plaka içine belgili tanımlık sistem yük ve tahlil varsayılan "Yüksek hassasiyet tahlil ile yenilenme" veri toplama yazılımı kullanarak çalıştırın. HT veri analiz yazılımı kullanarak analiz.
Not: Eğer plakaları kısıtlamaları nedeniyle önceden hazırlıklı olmak, güvenli bir şekilde tutkal film ile buharlaşma önlemek için. Beklenen titreleri bağlı olarak edinme oranları ve kez ayarlanması gerekebilir. Kılavuzu el kitabına bakın. - Veri analiz yazılımı kullanarak, referans çıkarma ve standart eğri ve ilk eğim (IS) işlevi ile doğrusal bir noktadan noktaya uygun kullanarak bilinmeyen örnekleri konsantrasyonu hesaplayın.
Representative Results
Kritik süreç parametreleri ve diğer hücre kültür parametreleri hücre kültürleri işlemi boyunca izleme bioprocessing içinde önemli bir yönüdür. Hücre sayaç ve besin analyzer hücre büyümesi, besin tüketimi ve yan ürün oluşumu karakterize beş öznitelikleri ölçmek için kullanılmıştır. Hücre sayısı her gün için tüm kültür koşulları elde edilmiştir. Ortalama canlı hücre yoğunluğu ve viabilities onların ±1 SD aralığı ile birlikte Şekil 3 ' te görüldüğü gibi vardır. Besin ve yan ürünü profilleri de ±1 SD aralığı kültürlerin sabit faz üzerinden ile gösterilir. Bu profil eğimi ortalama glikoz ve glutamin tüketim ve laktat üretim oranları temsil eder. Genel olarak, bu sonuçlar bu öznitelikleri microbioreactor sistemi izleme fizibilite göstermek; Bu parametreler dar bir Aralık içinde korumak yeteneği microbioreactor sisteminin yanı sıra.
Hücre kültürleri toplam verimlilik hasat hücre kültür medya 0,22 mikronluk PVDF filtreden geçtikten sonra proteinA biyoalgılayıcı sistemini kullanarak sayısal. 1.15 pg/hücre- Şekil 4' te görüldüğü gibi d 0,87 pg/hücre-d değişmekteydi hücre başına belirli verimlilik. Bu sonuçlara koşulları geniş bir dizi medya kompozisyon seçmek için soruşturma olması ve deneysel prosedürler minimal bir yatırım için üretilen protein miktarı en üst düzeye çıkarmak stratejileri besleme.
Resim 1 : Microbioreactor sistemi ile 12 reaktör gemiler sahip 4 kültür istasyonları (CS) yerleşimini. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Örnek örnek plaka koymak-yukarıya rejenerasyon deney proteinA biyoalgılayıcı sistemi ile temel bir Nefelometri için. satır 1 (kırmızı "R") örneği (yani matris analit yok); için ayrılmıştır satır 2 (aquamarine) (konsantrasyonları µg/mL) standartları kümesidir; satır 3 ve 4 (turuncu) düşük ve yüksek pozitif denetimleri kümesi vardır ("PL" ve "PH" sırasıyla); satır 5 ile 10 (mor) bilinmeyen örnekleri içeriyor; satırlar 11 ve 12 (gri) rejenerasyon ("R") ve nötralizasyon ("N") arabellekleri programı varsayılan konumları edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : bir) bir toplu iş yaş üzerinde ortalama canlı hücre yoğunluğu ve canlılığı profilleri. ± 1 SD de hücre büyümesini sıkı kontrolü microbioreactor sistemlerinde belirtmek için gösterilir. b) glikoz ve glutamin aynı zamanda ortalama yan ürünü profil için laktat ortalama besin profili. ± 1 SD de medya kompozisyon üzerinde sıkı kontrol microbioreactor sistemlerinde belirtmek için gösterilir. (N = 3, tüm koşulları nüsha çalıştırılan). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Çeşitli medya koşullardan ortalama belirli verimlilik temsilcisi kutu arsa. (N = 3, tüm koşulları nüsha çalıştırılan) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Otomatik mikro biyoreaktör sistemi düzgün çalışan ve verimli bir şekilde zamanında yürütülmesini birden çok otomatik adımları içerir. Sistem çalışan en önemli parçalarından biri yazılım programlama nedir. Program yazarken herhangi bir hata varsa orada-ecek var olmak ciddi hatalar denemede bu strateji, örnekleme strateji veya çalışma bulguları geçersiz kılabilir nihai ürün kalitesini besleme işleminin beklenmedik değişiklikler neden olabilir. Sistem çalışan bir başka önemli yönü yerleştirin ve kelepçe plaka doğru düzgün yapmak kontrolü sağlamak için sıkın etmektir. Kelepçe plaka düzensiz sıkılır en yaygın göstergesidir tekneler 1, 6, 7 ve 12 (köşe reaktör gemiler) için ölçümlerde oluşabilecek beklenmeyen değişiklikleri. Genel olarak istikrarsızlık contalar kelepçe tabak gaz giriş satırlarında, gevşeme gösterir. Bu senaryo ayar noktası ulaşan engelleyebilir. Bir deney başlangıç hücreleri izin veriyor önlemek için başka bir ortak hatadır aşı adım sırasında çok uzun süre onları çözmek neden, otur. Hücreleri oturma, harcama daha az zaman daha az şansı olduğunu giderek daha düşük inoculum hücre sayımları hangi önemli önyargı bu farkında olmadan tetikleyebilir reaktör gemiler kronolojik olarak eklenen çalışma sonuçları zarar verir. Birden çok aşamalı olarak aşılamak iyidir, yani aşılamak her kültür istasyonla birbiri ardına Duraklat adımları arasında hücreleri aşılama plaka 15 dakika daha uzun süre oturmuş değil bu yüzden.
Günlük kullanım, kısırlık Bakımı ile ilgili hayati önem taşımaktadır. Biyolojik Emanet kabine sistemi olmasına rağmen kısırlık başlık içinde ve dışında sık hareketi nedeniyle garanti edilmez. Sonuç olarak, mahallede her şeyi % 70 IPA ile püskürtülür gerekir. İkinci olarak, en az köpük kültür sırasında gerçekleşmesini sağlamak için önemlidir; Medya gazlama yapışmasına neden olabilir ve kelepçe plaka ve hatta çekirdek bileşenleri aşağıdaki zarar vermek için önde gelen satırları, egzoz. Koruyucu anti-köpük ek herhangi bir mikro biyoreaktör program tasarımında önemli adımlardır. Bir "köpük" durumunda bu protokolü temizlik üreticileri takip etmek faydalı olacağını ve kelepçe plakaların kalıcı hasar engel olabilir. Alternatif olarak, hacim oranı daha yüksek yüzeye düz bir sparger eksikliği ile verimli oksijen sağlar gibi toplu modunda çalışırken sigara sparged damarları kullanımı veya daha düşük cep yoğunlukları için yararlı olabilir. Baş alan oksijen tüketimi artan kültürler ile yetişmek yetersiz olarak ancak, Sigara sparged gemiler yüksek hücre yoğunluğu veya perfüzyon kültürleri için yararlı olabilir.
Şişeler sallamak daha fazla kontrol ile küçük bir ölçekte paralel olarak çalıştırılacak birden çok kontrollü kültürü kullanmasına olanak tanır microbioreactor sistem tarafından sağlanan çok sayıda avantajı vardır. 17 bu nedenle, tarama çalışmaları, mu, yüksek işlem hacmi klon çalışmaları ve transfection çalışmalar yürütme sistemi kolaylaştırır. Otomatik sıvı işleme da aynı anda sıkıcı ve zaman yoğun emek için eğitimli personel en aza indirerek analisti analisti değişkenliği azaltır. Sisteme çeşitli yararları olmakla birlikte, düşünülmesi gereken birkaç önemli dezavantajları vardır. İlk olarak, 15 mL kültür hacmi önemli ölçüde işlem dışı örnekleme ve son hasat malzeme ve birden fazla alternatif küçük ölçekli Biyoreaktörler sınırlar (ilâ 500 mL) son zamanlarda kullanılabilir hale gelmiştir. Bir son gelişme sisteme otomatik microscale biyoreaktör Nova biyomedikal, hücre yoğunluğu ve besin analiz için numune hacmi azaltarak içinde işlem örnekleme sorunu azaltır BioProfile FLEX 2 Çözümleyicisi ile bütünleşmesidir . Satınalma birimleri yeniden kullanılabilir geleneksel sistemleri daha costlier olabilir gibi tek kullanımlık birim maliyetini uzun vadeli projeler için düşünülmesi gereken ancak faydaları hızlı kurulum ve operasyonel tasarruf için hemen hemen hiçbir temizlik önde gelen dahil edebilirsiniz.
Bu yazıda ele yöntemi öncelikle toplu iş modu hücre kültürü için uygundur, ancak kullanıcı gereksinimlerine bağlı olarak değiştirilebilir. Her kültür İstasyonu, sıcaklık, bağımsız denetim sahipken ve pH bireysel reaktör gemiler düzeyinde çeşitlendirilebilir. Sartorius özellikle deneyler izin vermek için tasarlanmış yazılım planlama DoE olabilir uyarlanmış için mikro biyoreaktör sistemi sunuyor. Büyük ölçekli DoE çalışmalar yeni DoE yazılım üreticisi tarafından sağlanan kullanarak medya yardım ve en iyi duruma getirme ek. Burada kullanılmaz, ancak microbioreactor sistem beslenen-toplu çalışmalar da sağlar. Sistem henüz perfüzyon hücre kültürleri için optimize edilmiş değil. Ancak, sınırlı çalışmaları ve perfüzyon hücre kültür işlemi geçerli mikro biyoreaktör sistemini taklit etmek için denemeler olmuştur. 26 yüksek yoğunluklu perfüzyon kültürler yerleşme hücre tarafından taklit etmek için bu yöntemi değiştirilebilir. Hangi reaktöre damlalıklı eklenir yükseklik değişen ve halledilmesi zaman en iyi duruma getirme, medya kaldırıldı ve kültür ayna bolluk moduna doldurulan. Perfüzyon modu kültürünün isteniyorsa burada sunulan sistem daha iyi çalışabilir bu gelişmekte olan alanda yeni ürün bulunmaktadır.
Özet olarak, bu çalışmada üretmek ve bir modeli Igg1 monoklonal antikor karakterize CHO hücre kültür işlemleri için analitik ilgili ve otomatik mikro-Biyoreaktörler kullanımını gösterir. Bu rol küçük ölçekli mikro-Biyoreaktörler Biyoproses imalat ve hücre kültür gelişimi ve medya tarama üzerindeki etkilerini vurgulamaktadır. Bir otomatik küçük ölçekli sistem kullanarak pek çok avantajı olmakla birlikte, tam olarak gerçekleştirmek için kendi yararları anlama süreci ve analitik karakterizasyonu zorunludur. Bu çalışmada geliştirilen ve bireysel araştırma ihtiyaçlarını gelişmiş bir otomatik microscale reaktör sistemiyle için bir kılavuz ile kullanıcıya sunar.
Disclosures
Yasal Uyarı: Bu yayın yazarın görüşlerini yansıtan ve FDA'ın sayısı veya ilkeleri gösterecek yorumlanmamalıdır.
Acknowledgments
Yazarlar Scott Lute verilen analitik destek için teşekkür etmek istiyorum. Kısmi iç finansman ve destek bu iş için sağlanan CDER kritik yolu Program tarafından (CA #1-13). Bu projenin kısmen bir randevu için staj/araştırma katılım programı Office biyoteknoloji ürünleri, ABD Gıda ve İlaç İdaresi, bilim ve eğitim yoluyla Oak Ridge Enstitüsü tarafından yönetilen tarafından desteklenen bir ABD Enerji Bakanlığı ve FDA arasında kurumlararası anlaşma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
