Summary
Ein detailliertes Protokoll für den gleichzeitigen Betrieb von 48 parallel Zellkulturen unter unterschiedlichen Bedingungen in einem Microbioreactor-System wird vorgestellt. Zellprozess Kultur, Ernte und anschließende Antikörper-Titer Analyse werden beschrieben.
Abstract
Automatisierte Microscale Bioreaktoren (15 mL) können ein nützliches Werkzeug für Zelle Kultur Ingenieure sein. Sie ermöglichen die gleichzeitige Ausführung von eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen bei gleichzeitiger Minimierung der möglichen prozessvariabilität. Anwendungen dieses Ansatzes sind: Screening, Temperatur- und pH-Verschiebungen, Medien und Ergänzung Optimierung zu klonen. Darüber hinaus eignen sich die kleinen Reaktor Bände für große Design of Experiments, das eine Vielzahl von Bedingungen zu untersuchen. Dies ermöglicht vorgelagerten Prozesse deutlich vor Skalierung optimiert werden wo Experimente mehr Umfang ist durch Zeit und wirtschaftlichen Zwängen begrenzt. Automatisierte Microscale bioreaktorsystem bieten verschiedene Vorteile gegenüber traditionellen kleinen Kultur Zelleneinheiten, wie Fläschchen schütteln oder Spinner Fläschchen. Allerdings muss im Pilotmaßstab Prozess Entwicklung erhebliche darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass diese Vorteile realisiert werden. Wenn mit Sorgfalt ausführen, das System kann Ebene hochautomatisierung ermöglichen, Damhirschkuh mit einer höheren Anzahl von Variablen ausführen programmiert werden und können Abtastzeit reduzieren wenn mit einem Nährstoff Analyzer oder Zelle Zähler integriert. Integration der hier vorgestellten, mit aktuellen automatisierten Microscale Bioreaktor Experimente Experte abgeleitet Heuristiken kann häufige Fehlerquellen minimieren, die aussagekräftige Ergebnisse zu behindern. Im Extremfall führt die Nichtbeachtung der Grundsätze, die hier gelegt zu Geräteschäden, die teure Reparaturen erfordert. Darüber hinaus haben die Microbioreactor Systeme kleinen Kultur-Bände, die Charakterisierung der Zelle Kulturbedingungen erschwert. Anzahl und Höhe der entnommenen Proben in-Prozess im Batch-Modus Kultur beschränkt sich wie operative Volumen unterhalb von 10 mL nicht herunterfallen können. Diese Methode wird die vor- und Nachteile von Microscale bioreaktorsystem diskutieren.
Introduction
Monoklonale Antikörper (mAbs) wurden erstmals im Hybridom Mauszellen in 19751produziert. Seitdem hat eine Zunahme der Entwicklung der Produktion rekombinanter Proteine zu vermenschlichen mAbs in Vivo erhöhen die Sicherheit und Wirksamkeit2,3,4stattgefunden. Die meisten der rekombinanten Proteins Produktionsprozesse beschäftigen chinesische Hamster Eierstock (CHO) Zellen für die Leichtigkeit, mit der sie an Serum freie Medien, ihre Fähigkeit, Proteine mit ähnlichen Post-translationalen Modifikationen derjenigen eines angeborenen Menschen produzieren angepasst werden kann Protein und ihre Zuverlässigkeit als Host Zellen5,6.
Nachfrage steigt, Produkt schneller und für größere Patientengruppen in gleichbleibender Qualität zu liefern. Neben den wirtschaftlichen Vorteilen steigt das Repertoire von mAbs behandelte Krankheiten, worunter nun Autoimmunerkrankungen, Komplikationen nach Transplantation, Arthritis und Krebserkrankungen7. Durchschnittserlöse für moderne kommerzielle mAb Produktionslinien sind in der Regel im Bereich von 5-6 g/L und5steigen weiter. Dies wurde teilweise durch CHO Zelle Engineering und verbesserte Produktionslinie Screening mit hohem Durchsatz Bioreaktoren8erreicht. Jedoch sind die meisten Erhöhungen der Proteinproduktion zugeschrieben worden, um Prozessverbesserungen, einschließlich Zuführungen in Media Optimierung, Zelle Kulturbedingungen und verbesserte Fütterung Strategien7,9,10. Nährstoff-Supplementierung ist wichtig nicht nur für richtige Zellwachstum, sondern auch für die effiziente Produktion von hochwertigem Eiweiß. Darüber hinaus benötigen die Zellen den stöchiometrischen Zusatz von bestimmten Nährstoffen, erfordern zusätzliche Verständnis für die Fütterung Strategie Optimierung6,11. Traditionellen Optimierungsmethoden gehören einzelne Medien Komponente Titration und Medien mischen mit mischungsversuchspläne. Diese Methoden sind jedoch zeitaufwendig, arbeitsintensiv intensiv, und beinhalten Risiken, die mit menschlichem Versagen12,13.
Optimierung der Medienwissenschaft stützte sich zuvor auf Fläschchen schütteln und 1-2 L-Bioreaktoren, die möglicherweise zu teuer in Bezug auf Rohstoffe und Humankapital. Mikrotiterplatten wurden auch verwendet, aber diese Methoden bieten begrenzte Skalierbarkeit. Darüber hinaus kann noch mehrere zeitaufwändige Durchläufe erforderlich sein, die Variabilität von Charge zu Charge einzuführen, die die Bonitätsbeurteilung Variabilität verursacht durch Medienkomposition und Fütterung Strategie14,15,16verdeckt. Daher die Notwendigkeit für hohen Durchsatz und sehr konsequent parallel Bioreaktor Systeme entstanden17,18,19,20.
Mit der erheblichen Aufwand für den Betrieb des traditionellen Tischwaage Bioreaktoren (0,5-5 L), Microbioreactors bieten eine kostensenkende Alternative für Beurteilung der Herstellungsprozess von biologisch Drogen abgeleitet. 21 -Tischwaage gerührt-Tank Bioreaktoren sind zuverlässig und dichten Daten über sensorische Arrays. Regelungstechnik ermöglichen für die einfache Kontrolle der Betrieb. Allerdings machen die Montage, Kalibrierung, Reinigung, Arbeitskosten, substratkosten und sterilisationsanforderungen Tischwaage gerührt-Tank Bioreaktoren teuer und arbeitsintensiv zu bedienen. Fläschchen schütteln und Mikrotiter-Platten entfernen einen Teil der Kosten und Arbeits-Probleme im Zusammenhang mit größeren Maßstab Bioreaktoren, aber diese Alternativen bieten schwach Steuerungsmöglichkeiten Verarbeitungsbedingungen und niedriger Dichte Daten, oft nur Endpunkt Messungen zu produzieren. 22
Alternativ nutzen Microbioreactors eine kleine Arbeitsvolumen um einen Herunterskalieren Ansatz für Zell-Linie und vorgelagerten Prozessentwicklung bieten. Das Ausmaß der Microbioreactor Experimente kann die laufenden Kosten durch niedrigere Auslastung der macht, Substrat, Arbeit, Raum und Dienstprogramme erheblich vermindern. 23 Microbioreactors sind, wie Fläschchen schütteln, sie einfach sind in der Handhabung wegen ihrer Größe, aber sie die Vorteile der traditionellen Tischwaage Bioreaktoren durch ihre Online-Feedback-Kontrolle von pH, Temperatur behalten, Sauerstoff und Säure/Base aufgelöst Verbrauch sowie ihre Daten in Echtzeit Ausgabe der Qualitätsparameter einschließlich Gaszusammensetzung. Microbioreactor Skala ermöglicht für Hochdurchsatz-Screening-Fähigkeit, die nützlich für Auswahl und Prozessentwicklung Klon sein kann. 24
Die erweiterte Microscale Bioreaktor hat gezeigt, ein wirksames Instrument zur CHO Zelle Kultur Prozess Charakterisierung und Entwicklung18sein. Hier eine automatisierte ambr15-System, bestehend aus 48 Microbioreactors parallel, die nachweislich vergleichbar mit klassischen gerührt Tank Reaktoren in Scale-up Studien,25 diente in gewissem Sinne analog zu früheren Arbeiten, die die Medien optimiert Komposition für eine CHO-DG44-Zell-Linie produziert ein Modell Chimären IgG16. Die Auswirkungen der unterschiedlichen Medien Bedingungen auf Wachstum und Titer wurden verglichen und analysiert. In diesem Papier wurde eine allgemeine Richtlinie, führen Sie das Microbioreactor System und die Analyse von Proben, grobe Medien vorgestellt.
Protocol
1. Samen ausbilden Expansion
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet 1 mL rekombinante DG44 CHO-Zelle-Bestände, die gespeichert wurden bei einer Dichte von ~ 3 x 107 Zellen/mL. Verdünnungen und Fristen für die einzelnen CHO Zelllinien variieren. Messen Sie Wachstumskurven der Zelllinie vorher verwendet werden und entsprechend anpassen. Die Zellen sind zunächst aufgetaut in Fläschchen schütteln und später in einem Spinner Kolben übertragen. Bestimmen Sie die Anzahl der Fläschchen schütteln und Spinner Fläschchen für das Experiment basierend auf der Anzahl der Microbioreactors, die ausgeführt werden und das Ziel, die Dichte Aussaat benötigt.
- Tauen Sie schnell Lager Ampulle(n) CHO-Zellen durch Eintauchen in ein Wasserbad von 37 ° C bis nur einen kleinen Splitter von Eis bleibt auf. Die Außenseite der Flasche mit 70 % Ethanol Lösung und einem fusselfreien Tuch zu dekontaminieren. Übertragen Sie auf eine biologische Kabinett.
- Wieder aussetzen Zellen durch sanft auf und ab pipettieren und übertragen 1 mL in eine sterile 125 mL belüfteter schütteln Kolben mit 29 mL vorgewärmten Medien ergänzt mit 8 mM L-Glutamin und 1 x Penicillin/Streptomycin.
Hinweis: Sofern nicht anders angegeben, wird der Begriff "Medien" in diesem Protokoll im folgenden als OptiCHO Medien definiert werden. - Statt schütteln Flask(s) im Brutschrank bei 37 ° C und 8 % CO2gehalten. Verwenden Sie eine Orbitalschüttler, um Zellen mit einer Geschwindigkeit von 130 u/min zu agitieren.
- Überwachen der lebensfähigen Zelldichte (VCD) jeden Tag mit einer automatisierten Zelle Zähleinrichtung oder manuell mit einem Hemocytometer und einem Trypan blau. Subkultur (verdünnte) die Zellen 72 Stunden nach der Inokulation in frische Medien (Vorwärmen der Medien auf 37 ° C jedes Mal, wenn es Zellen hinzugefügt werden muss), dass das endgültige Volumen 100 mL in einem 125 mL Spinner Kolben ist. Inkubieren Sie Spinner Kulturen zu den gleichen Konditionen für Shake Flask Kulturen mit einer Geschwindigkeit von 70 u/min verwendet.
Hinweis: Nach der Subkultur sollten die Zellen bei einer Dichte von 0,7-1 x 106 Zellen/mL sein. Sicherstellen Sie, dass die endgültigen Dichte nicht unter 0,5 x 106 Zellen/mL liegt. Subkultur nach 96 h, wenn die Ziel-Zelldichte zum animpfen in Spinner nicht erreicht werden kann. - Am dritten Tag (einen Tag vor Inokulum Vorbereitungen), Hinzufügen von frischen, vorgewärmten Medien für Spinner-Flask(s), ≥ 90 % Lebensfähigkeit zu erhalten. Überschreiten Sie 125 mL Gesamtvolumen nicht. 6
2. Ausführung des automatisierten Microbioreactor Systems
Voraussetzungen: Benutzer muss vom Hersteller die entsprechende Ausbildung erhalten haben und muss mit der Sicherheit und Betriebsbedingungen für das System vertraut sein.
- Initialisieren und eine Verbindung zum Cell Counter
- Das System Betriebssoftware zu initialisieren. Vor dem Öffnen der Software, sicherzustellen Sie, dass die Zelle Zähler (siehe Tabelle der Materialien) zusammen mit der entsprechenden Software ausgeführt wird. Die Zelle-Zähler ist in das System integriert.
- Verbinden Sie mit Zelle Zähler remote-Verbindung vor dem Öffnen der Software. Klicken Sie auf das remote-desktop-Symbol und klicken Sie auf "Verbinden". Sobald der remote-Desktop verbunden ist, öffnen Sie die Zelle-Zähler-Software. Ein neues Reagenz Pack, leere Trypan blau verschwenden und prime das System zu installieren.
- Minimieren Sie die remote-Verbindung und öffnen Sie die Mikro-Bioreaktor-Software mit einem bestehenden Experiment als Vorlage erstelle ich ein neues Experiment. Benennen Sie und speichern Sie das Experiment. Stellen Sie sicher, dass der automatisierte Zelle Zähler unter der Registerkarte "Status" in der Software verbunden ist. Der Status kann auch auf der Handy-Zähler-Software überprüft werden.
- Definition von Platten und Schiffe be-
Hinweis: finden Sie in Abbildung 1 , Laden von Verbrauchsmaterialien und Reagenzien auf die Kultur-Stationen und Decks zu orientieren. Klammerplatten sollte auf eine Schwerkraft-Zyklus (verwendet für Feststoffe) vor dem Gebrauch autoklaviert werden.- Definieren Sie bevor Sie beginnen einen Lauf die Platten während des Laufs im mimischen Bereich der Software verwendet. Benennen Sie jede Platte verwendet und benennen Sie jede Platte zu einem Deck auf der Microbioreactor-Kultur-Station zu.
- Verwenden einer 24-Well-Platte zum Laden von Medien und auf dem dafür vorgesehenen Deck der Kultur-Station. Platz 1 mL und 4 mL pipettieren Tip-Boxen in den Abschnitten wie in Abbildung 1dargestellt.
- Legen Sie eine Inokulation 24-Well-Platte auf dem jeweiligen Deck der Kultur-Station. Legen Sie die Single-gut 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Platte auf Deck 1. Platzieren Sie die Single-gut 1 M NaOH Platte auf Deck 2 und die Schaum-24-Well Platte auf Deck 7 (Positionen wie in Abbildung 1dargestellt). Die Deck-Zahlen sind Steuerungsrechner auf der Registerkarte "Mimic" in der Software angezeigt.
- Entpacken Sie die Kulturgefäße (ausgestattet mit Sparger) im Kabinett Schutzhaube. Platzieren Sie zwölf sterile Kulturgefäße pro Kultur Station. Ort autoklaviert Klemmen Platten auf der Oberseite der Schiffe. Stellen Sie sicher, dass die Bohrungen in Einsätze zur Verfügung gestellt für alle Rührwerke gleichsinnig für einfacher Platzierung zeigen.
Hinweis: Mit einem permanent-Marker, kategorisieren Sie die Kulturgefäße bevor man sie in der Kultur-Bahnhof, sparen Zeit und vermeiden Verwirrung zum Zeitpunkt der Ernte. - Klemmplatte O-Ringe sind der erste Teil, nach wiederholten Autoklavieren zermürben, daher sorgfältig überprüfen sie vor dem Autoklavieren vor jedem Experiment. Halten eine sterile Klemmplatte als Back-Up im Falle des Scheiterns der o-Ring wird empfohlen.
- Die rühren Platten auf der Oberseite der Klammerplatten, gewährleisten jedem Pin sicher eingesetzt. Sichern Sie die Klammerplatten mit den Schrauben und Knöpfe zur Verfügung gestellt. Ziehen Sie die Regler, bis sie handfest sind. Ziehen Sie nach links und rechts Knöpfe alternativ auch Platzierung der Klemmplatte.
Hinweis: Wenn die Klemme nicht bündig mit der Oberfläche ist oder wenn die Schrauben am Ende der Klemmplatte ungleichmäßig angezogen werden, werden die Gefäße gelösten Sauerstoff (DO) Kontrollprobleme auftreten. Wenn diese Anpassungen der Problem nicht beheben lässt, überprüfen Sie die O-Ringe da unvollständig Abdichtung der Platten zu ineffizient begasen von Kultur führen kann.
- Betrieb der automatisierten Mikro Bioreaktor-Software
Hinweis: Einsatz "Prozess-Schritte" Registerkarte Bearbeiten oder erstellen Sie neue Schritte. Schritte müssen zum Starten und beenden jeden Prozess individuell programmiert werden. Klicken Sie "Step" Einfügen"auf der Registerkarte Prozess Schritte erstellen Sie neue Schritte oder Doppelklick auf einem vorhandenen Schritt, diesen Schritt zu bearbeiten. Programmschritte werden in zehn Hauptabschnitte unterteilt: Startup, Medien laden, Antischaummittel hinaus / pH Control, Hintergrund Basis Ergänzungen, "angehalten" pH, Impfung, 5 X Zellzahl, 10 X Zellzahl, Nährstoff-Analyzer-Sampling und Kultur Station Herunterfahren. Laufen dauert in der Regel zwischen 7-9 Tage wenn im Batch-Modus ausführen.- Das System initialisiert und überprüft das Vorhandensein der entsprechenden Schiffe. Scannen Sie den Barcode mit der Kulturgefäße zur Verfügung gestellt. Kultur-Stationen mit leeren Schiffe oder Schiffe, die nicht verwendet wird kann die gleiche Barcode beantragt werden.
- Das System beginnt mit dem gestalteten Programm nach der Prüfung Kontrolle, Vergasung und andere Verbindungen.
Hinweis: Die Benutzer kann mit dem Programm fortfahren, selbst wenn ein Fehler auftritt, aber tun dies auf Gefahr des Nutzers und wenn Sie fortfahren vorwärts nicht, das System schadet aber und das Experiment unterbricht. Z. B. möglicherweise Begasung deaktiviert für bestimmte Schiffe in das Experiment die wird als Fehler angezeigt, aber kann umgangen werden nicht verwendet.
- Start und Medien laden
- Der erste Tag einrichten das System oder die Medien laden Tag bezeichnet man als Tag 0 der Kulturzeit.
- Abschnitt "Startup" erste Last pipettieren Tipps, 1 mL und 4 mL Tipps, wie programmiert. Wenn bereits platziert, klicken Sie auf Weiter. Legen Sie die Medien-Platte, 1 X PBS, 1 M NaOH, Schaum-Platte, Medien Tischladestation und Impfung Platte in den dafür vorgesehenen Decks oder wenn bereits platziert, drücken Sie auf Weiter, um mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Im Rahmen des Start-Protokolls Temperaturregler, Temperatur sich 37 ° C. Schalten Sie das Rühren bei 1000 u/min und die DO / pH-Wert überwachen.
- Als nächstes führen Sie die Medien Ladeprogramm. Die liquidere Handler des automatisierten Microbioreactor Systems wird die Medien von der Medien-Platte, die Kulturgefäße wie abgebildet in das Programm verzichtet. Das Medium hinzugefügt ist OptiCHO mit variierenden Prozessbedingungen.
Hinweis: Zwei Brunnen von einer 24-Well-Platte sind verpflichtet, einem Kulturgefäß Kapazität (13 mL) füllen, da jede Vertiefung nur 8 mL Medien unterbringen kann. Verwenden Sie ca. 7-8 mL in jede Vertiefung Zeichnung Luft zu verhindern, wenn Medien vom liquid Handler vor Befüllung gemischt wird. - Sobald die Medien Aufladung erfolgt, wird 35 µL des Ex-Cell-Antischaummittel von der Schaum-Platte das Kulturgefäß hinzugefügt werden. Warten Sie 30 Minuten Nährmedium gut gemischt werden und der optischen DO / pH-Sensoren, hydratisiert werden.
Hinweis: Die gleiche Menge an Antischaummittel wird zeitweise im gesamten Kulturzeit hinzugefügt Wenn Schäumen erkannt wird. 6 Schäumen wird visuell erkannt und Reaktordruckbehälter überprüft täglich zum Schäumen. Antischaummittel wird sofort bei Erkennung hinzugefügt. - Die DO / pH Regelung dann um zu starten, Überwachung und Aufzeichnung der und pH-Wert des Kulturmediums eingeschaltet ist. Lassen Sie die tun, um den Sollwert von 50 % zu erreichen, die mindestens 2 h dauert.
- Schalten Sie nach Gleichgewichtherstellung Hintergrund Basis Ergänzungen, einen pH-Sollwert von 7.1 für alle Kultur-Schiffe zu erreichen. Ermöglichen Sie und pH-Wert, über Nacht equilibrate und vollständig hydratisiert werden.
- Angehaltene pH - Tag1 pH Offset
- Am nächsten Tag (gekennzeichnet als Tag 1), Ausführen der angehaltenen pH Schritt, wobei Kultur wählen Sie Schiffe, analysiert und ein pH-Korrektur-Offset bestimmt.
Hinweis: Die Zahl der pH Schiffe zu untersuchenden zum Ausgleich des pH-Wertes ist Benutzer bestimmt. Eine Probe von jeder Reaktorbehälter möglicherweise nicht erforderlich, wenn Sie eine gute Darstellung der Bioreaktor Bevölkerung haben. - Platzieren der Probenhalter Rohr Platten auf bestimmten Plattformen und Last Mikro-Zentrifuge Röhren mit Kappen öffnen und neben ihnen versteckt. Die liquidere Handler wird 600 µL der Zellflüssigkeit Kultur in das Rohr wie abgebildet in das Programm verzichtet.
-
Umgehend entfernen den Probe und Messen pH-Wert auf einen Nährstoff Bioanalyzer richtig kalibriert worden und wofür die QCs ausgeführt wurden (siehe unten, "Tägliche Nährstoff und Metabolit Analyse").
Hinweis: Beispiele sind einzeln ausgeführt, unmittelbar nach Zeichnung, zur Vermeidung von pH-Wert-Änderungen aufgrund der Exposition gegenüber Luft, Entgasung von CO2 aus der Probe pH-Veränderungen führen kann. - Drücken Sie "weiter" nach jeder Probe, sonst der nächste Schritt nicht ausgeführt wird.
- Geben Sie die externe, FLEX-abgeleitete pH Werte in der Software "kompilieren" die Offsets für die Stichprobe Schiffe automatisch. Manuell im Durchschnitt die Offsets für die Probe-Schiffe erhalten und geben Sie die Nummer unter der Spalte "Benutzer pH Offset" unter dem Reiter "Schiffsdaten". Der durchschnittliche Abstand würde dann auf alle Schiffe angewendet werden. Lassen Sie den pH-Wert auf mindestens 2-3 Stunden, equilibrate nach denen die Kulturgefäße geimpft werden können.
- Am nächsten Tag (gekennzeichnet als Tag 1), Ausführen der angehaltenen pH Schritt, wobei Kultur wählen Sie Schiffe, analysiert und ein pH-Korrektur-Offset bestimmt.
- Inokulation
- Nach dem Messen VCD übertragen Gesamtinhalt Spinner-Flask(s) in eine sterile, 250 mL konische Zentrifuge Rohr- und Pellet Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 140 X g bei Raumtemperatur. Dekantieren Sie die alten Medien zu und neu in genügend frische Medien auszusetzen Sie, so dass die endgültige Dichte 1 x 106 Zellen/mL sein sollte, nachdem Sie das Kulturgefäß das Inokulum hinzugefügt.
- Die suspendierten Zellen in den dafür vorgesehenen gut von einem sterilen Lidern 24-Well-Platte hinzufügen. Fügen Sie 3 mL des Inokulums in jede Vertiefung, davon 2 mL als Inokulum für jedes Kulturgefäß entfernt wird.
- Platzieren Sie die Inokulum-Platte auf dem dafür vorgesehenen Deck in der Kapuze. Achten Sie auf die Außenseite der Platte Lidern Inokulum mit 70 % Alkohol zu sprühen, bevor sie im Inneren der Haube platziert.
- Automatisierte Zellzählung mit Cell Counter
- Lassen Sie nach der Inokulation die Kulturgefäße für mindestens eine Stunde equilibrate. Führen Sie nach einer Stunde die 5 X Zelle zählen Schritt im Programm. 5 X zeigt den Verdünnungsfaktor verwendet, um die Zellzahl zu lesen.
Hinweis: 5 X-Zellzahl dient zunächst, wenn die Zellen in der Lag-Phase sind. Nachdem die Zellen ihre exponentielle Phase erreichen wird 10 X Anzahl der Zellen verwendet werden. Basierend auf die Probe und Verdünnungsmittel Bände, die das Instrument automatisch den Verdünnungsfaktor entfallen und den endgültigen Wert entsprechend anpasst. - Die liquidere Handler verleiht der Zelle-Zähler-Cup gefolgt durch die Zugabe von 120 µL der Zellflüssigkeit Kultur aus dem Kulturgefäß zuerst 480 µL 1 X PBS. Die Zellzahl wird dann gelesen mit der automatisierten Zelle Zähler. Dieser Schritt ist für alle Schiffe wiederholt.
- Die Zellzahl ist der letzte Schritt für Tag 1 der Kultur. Zusammen mit den Daten tun und pH-Wert der Zellzahl ist Daten (tragfähige Zelldichte und Lebensfähigkeit) auch täglich von der Software erfasst.
Hinweis: Reinigen Sie die Zelle Zähler Tasse mindestens zweimal während der Dauer der Ausführung mit 70 % IPA, Verstopfung der Leitungen zu verhindern. Linien und Flow-Zellen werden automatisch nach jeder Zellzahl gereinigt.
- Lassen Sie nach der Inokulation die Kulturgefäße für mindestens eine Stunde equilibrate. Führen Sie nach einer Stunde die 5 X Zelle zählen Schritt im Programm. 5 X zeigt den Verdünnungsfaktor verwendet, um die Zellzahl zu lesen.
- Angehaltene pH - Tag2 pH Offset
- Am 2. Tag der Kulturzeit wiederholen Sie die "Angehalten pH" mit Kulturgefäße als diejenigen, die während der anfänglichen angehaltenen pH Schritt entnommen wurden.
Hinweis: Probenahme der Schiff-Bevölkerung für angehaltene pH bieten einen bessere Offset für pH-Korrektur. Probieren Sie daher nicht die gleichen Schiffe zur angehaltenen pH-Wert vom Vortag.
- Am 2. Tag der Kulturzeit wiederholen Sie die "Angehalten pH" mit Kulturgefäße als diejenigen, die während der anfänglichen angehaltenen pH Schritt entnommen wurden.
- Täglichen Nährstoff- und Metabolit-Analyse
- Proben bis zum Ende des Experiments für Nährstoff-Analyse von Tag2 der Kultur genommen werden und mit Nährstoffen Bioanalyzer analysiert.
- Platzieren der Probenhalter Rohr Platten auf bestimmten Plattformen und Last Mikro-Zentrifuge Röhren mit Kappen öffnen und neben ihnen versteckt. Liquidere Handler wird in das Rohr wie abgebildet in das Programm der Zellflüssigkeit Kultur verzichten.
Hinweis: Für die ersten ist paar Tage (2-4 Tage) die Menge an das Kulturgefäß entnommene Probe 300 µL. Dies wird mit 300 µL 1 X PBS von liquid Handler verzichtet verdünnt. Dies geschieht, um zu sparen das kulturvolumen und verhindern, dass die Ebene fallen unterhalb von 10 mL. Darüber hinaus fallen Nährwerte für die ersten Tage im Erfassungsbereich Instrument nach Verdünnung. - Legen Sie die Proben in das Analysegerät Fach, die Nährstoffe-Analyse durchzuführen.
Hinweis: Fixieren Sie alle Proben, die nicht am gleichen Tag analysiert werden.
- Herunterfahren des Systems
- Um den Lauf zu beenden, müssen Sie zuerst die Temperaturregelung, gefolgt von der Agitation deaktivieren. Zweitens, stoppen die DO / Kontrolle des pH-Werts und Hintergrund base Ergänzungen. Drittens, stoppen Sie alle anderen Steuerelemente. Zu guter Letzt den System-Monitor zu stoppen.
- Schrauben Sie die Klammer und rühren Sie Platten und entfernen Sie Kulturgefäße zu. Reinigen Sie das Innere der Kultur-Station mit einem fusselfreien Tuch. Die Kultur-Station setzen Sie die Trocknung Platten auf und verschrauben Sie diese.
Hinweis: Trockenzyklus ist erforderlich für die gekühlte Version des Systems und für die standard-Version des Systems ist nicht erforderlich. - Führen Sie die 2-stündige trocknenden Zyklus auf dem Programm. Sauber mit Reinstwasser Klammerplatten gefolgt von 70 % Isopropylalkohol (IPA), mögliche kondensierte Flüssigkeit in den Zeilen zu entfernen. Spülen Sie mit Luft, Restflüssigkeit zu entfernen.
- Klicken Sie auf "Stop" in der Bioreaktor-Software einmal hat der Trocknungsvorgang beendet.
3. Kultur Zellernte
- Transfer der Zellflüssigkeit Kultur aus dem Reaktordruckbehälter und pellet-Zellen auf 1.962 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
- Den überstand abgießen. Mit Hilfe einer 0,22 µm PVDF Filter Sterilfilter die abgegossenen Zellflüssigkeit Kultur.
- Aliquoten 1 mL der sterilen Kultur der Zellflüssigkeit in 1,5 mL Röhrchen Eppendorf für Titer Analyse. Speichern Sie die 1 mL Röhrchen bei-20 ° C. Reinigen Sie den Rest der geernteten Kultur Zellflüssigkeit mit schnellen Protein Flüssigchromatographie-System. 6
4. Messung IgG Titer
Hinweis: Dies ist einen kursorischen Überblick über Ausführung und Analyse von Proben mit dem ProteinA Biosensor-System. Assay alle Parameter ( z.B. Temperatur, lesen Sie mal, u/min, etc. ) muss für jede Probe empirisch ermittelt werden.
- Schalten Sie das System und lassen Sie die Lampe für mindestens 1 Stunde entfernen Proben aus dem Gefrierschrank zu tauen und equilibrate auf Raumtemperatur Aufwärmen.
- In der System-Software soll die Platte Temperatur 26 ° C. Pre-genießen Sie die Anzahl der Protein A-Tipps in Probenmatrix (z. B. Zelle Media) für mindestens 30 Minuten verwendet werden.
Hinweis: Die optimale Temperatur muss empirisch bestimmt werden. Eine Temperatur von 26 ° C wird hier zur Probe Verdunstung während des längeren Analysenzeiten minimieren und erlauben das Instrument um eine Konstante Temperatur zu halten, (indem Sie einige Grad über der Umgebungstemperatur). Durch Inkubation Probenteller auf der Probe-Bühne für ≥ 10 Minuten werden Proben müssen vorab äquilibriert auf die gewählten Assay-Temperatur vor der Messung. - Bauen Sie eine Protein-Standardkurve unter Verwendung der gleichen Antikörpers konzentrierte sich auf 10 mg/mL und seriell verdünnen in der Probenmatrix (d. h. Medien) im Bereich, der muss erkannt werden.
Hinweis: Es ist wichtig, eine hohe Konzentration des Antikörpers, Matrix-Effekte durch Verdünnung zu minimieren zu erhalten, aber es ist auch wichtig, nicht über die Antikörper zu konzentrieren und Aggregation zu induzieren. Läuft eine Standardkurve in Platte für jede probenplatte ist vorzuziehen. Minimal, muss eine Positivkontrolle verwendet werden, um die Spitze zu Spitze und Platte-Platte-Variabilität ausmachen. Eine neue Standardkurve müssen generiert werden für jede neue Charge des Proteins eine Spitzen verwendet. - Design-Probenteller (Beispiel siehe Abbildung 2). In einem Protein A kann Assay, der Regeneration, bis zu 80 Proben verwendet analysiert werden, worunter unbekannten Kultur Proben, Standards und Kontrollen. Für jede Platte analysiert wird ein einzelnes Protein A-Tipp verwendet werden, um bis zu 10 Proben über die Platte (Spalten 1-10), mit einem Regenerationszyklus zwischen jeder Probe zu messen.
Hinweis: Es wird empfohlen, dass die gesamte erste Zeile der Platte (Reihe A) als Negativkontrolle und Referenz verwendet werden. Im hier beschriebenen Test Reihen B und C für zwei Positivkontrollen verwendet werden; jeweils die untere und eine an der oberen Grenze der linearen Antwort. Dies stellt sicher, dass jede Spitze negativ-und Positivkontrollen misst vor der Analyse der Proben. Dieses Set-up vereinfacht auch Referenz Subtraktion in der Analysesoftware. Die verbleibenden Brunnen werden dann für unbekannte Proben verwendet. Wenn eine Probe-Lücke in den Reihen vorhanden ist, muss eine Matrix in so gut um zu verhindern, Trocknen der Spitze (d. h. Wells A2 durch G2 haben Probe H2 jedoch nicht. Gewährleisten H2 enthält Probenmatrix dafür Spitze trocknet nicht aus, bevor Sie fortfahren, H3 zu probieren). Zu guter Letzt nicht erschöpft Tipps mithilfe einer voraussichtlich mehrere Platten zu analysieren. Mit einem neuen, nicht regeneriert Set für jede Platte wird empfohlen. - Proben für die Analyse durch das Mischen von sanft vorbereiten, entweder durch Inversion oder pipettieren, gefolgt von einen Puls-Spin, Probe an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Erstellen Sie für konzentrierte Proben entsprechende Verdünnung Wiederholungen durch Verdünnung in Probenmatrix.
Hinweis: Des linearen Bereichs der verbindlich für einen Antikörper für Protein werden ein Bio-Interferometrie (BLI) Messungen sowohl die Antikörper Assay-Bedingungen und Matrix variieren. Dies sollte empirisch im Voraus bestimmt werden, um sicherzustellen, dass entsprechende Probe Verdünnungen verwendet werden. - Bereiten Sie 96-Well Musterplatten so nah an der Assay-Zeit wie möglich vor. Sicherzustellen, gibt es keine Luftblasen in einem der Brunnen. Entfernen Sie Luftblasen mit einer sauberen PIPETTENSPITZE oder durch Zentrifugieren.
- Laden Sie Platte in das System und führen Sie Assay Verwendung des standardmäßigen "Hohe Empfindlichkeit Assay mit Regeneration" in der Datenerfassung Software aus. Analysieren Sie mit HT Datenanalyse-Software.
Hinweis: Wenn Platten sind vor der Zeit aufgrund von Einschränkungen bereit sein, sicher versiegeln Sie mit Film um Verdunstung zu verhindern. Je nach erwarteter Titer Erfassungsraten und Zeiten müssen möglicherweise angepasst werden. Finden Sie im Handbuch zur Orientierung. - Mit der Datenanalyse-Software Referenz subtrahieren und berechnen Sie die Konzentration der unbekannten Proben mit Standardkurve und die erste Steigung (IS)-Funktion mit einer linearen Punkt passen.
Representative Results
Überwachung kritischer Prozessparameter und andere Zelle Kultur Parameter während der Zellkulturen Operation ist ein wichtiger Aspekt bei bioprocessing. Die Zelle Zähler und Nährstoff Analyzer wurden verwendet, um fünf Attribute zu quantifizieren, die Zellwachstum, Nährstoff Verbrauch und Nebenprodukt Bildung charakterisieren. Die Zellzahlen wurden täglich für alle Kulturbedingungen erhalten. Die durchschnittliche tragfähige Zelldichten und künstliche sind wie in Abbildung 3 dargestellt, zusammen mit ihre ±1 SD-Intervall. Die Nährstoff- und Nebenprodukt Profile sind auch mit dem ±1 SD Intervall durch die stationäre Phase der Kulturen gezeigt. Die Neigung dieses Profils repräsentiert Durchschnittssätze Glukose und Glutamin Verbrauch und Laktat-Produktion. Diese Ergebnisse zeigen insgesamt, die Machbarkeit der Überwachung dieser Attribute in das Microbioreactor-System; sowie die Fähigkeit des Microbioreactor Systems, diese Parameter innerhalb eines engen Bereiches pflegen.
Die Gesamtproduktivität der Zellkulturen wurde quantifiziert mit einem ProteinA Biosensor-System, nachdem die geernteten Zellkulturmedien 0,22 µm PVDF Filter durchlaufen wurde. Die spezifische Produktivität pro Zelle reichten von 0,87 Pg/Zelle-d bis 1,15 Pg/Zelle-d, wie in Abbildung 4dargestellt. Basierend auf diesen Ergebnissen eine Vielzahl von Bedingungen untersucht werden kann, um Medienkomposition auszuwählen und für eine minimale Investition in experimentellen Verfahren produziert Fütterungsstrategien, die die Menge an Protein zu maximieren.
Abbildung 1 : Layout des Microbioreactor Systems mit 4 Kultur Stationen (CS) mit 12 Reaktordruckbehälter. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Beispiel Probe Teller Set-up für eine grundlegende Quantifizierung mit Regeneration Experiment auf dem ProteinA Biosensor-System. Zeile 1 (rot "R") ist reserviert für Referenzprobe (d.h. Matrix abwesend Analyten); Zeile 2 (Aquamarin) ist ein Satz von Standards (Konzentrationen sind in µg/mL); Zeilen 3 und 4 (Orange) sind Sätze von niedrigen und hohen positiven Kontrollen ("PL" und "PH", beziehungsweise); Zeilen 5 bis 10 (lila) enthalten unbekannte Proben; Zeilen 11 und 12 (grau) sind Programm-Standardpositionen für Regeneration ("R") und Neutralisation ("N") Puffer. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : ein) durchschnittliche lebensfähigen Zelle Dichte und Lebensfähigkeit Profile über das Alter eines Stapels. ± 1 SD zeigt sich auch an die strenge Kontrolle des Zellwachstums in den Microbioreactor-Systemen. (b) durchschnittliche Nährwertprofil für Glukose und Glutamin sowie das durchschnittliche Nebenprodukt Profil von Laktat. ± 1 SD zeigt sich auch an strenge Kontrolle über Medienkomposition in den Microbioreactor-Systemen. (N = 3, waren alle Bedingungen in dreifacher Ausfertigung laufen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Repräsentative Boxplot der durchschnittliche spezifische Produktivität der verschiedenen Medien Bedingungen. (N = 3, waren alle Bedingungen ausgeführt werden in dreifacher Ausfertigung) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Die automatisierte Mikro bioreaktorsystem ordnungsgemäß ausgeführt und effizient beinhaltet die termingerechte Ausführung von mehreren automatisierten Schritten. Eines der wichtigsten Teile der Ausführung des Systems ist die Software programmieren. Wenn es ein Fehler beim Schreiben des Programms, werden schwerwiegende Fehler in das Experiment, das unerwartete Veränderungen im Prozess, Fütterung, Strategie, Probenahmestrategie oder Qualität des Endprodukts, die die Ergebnisse der Studie entkräften kann führen kann. Ein weiterer wichtiger Aspekt für den Betrieb des Systems ist es, und ziehen die Klemmplatte korrekt um ordnungsgemäße Kontrolle zu gewährleisten. Die häufigste Indikation der Klemmplatte ungleichmäßig angezogen worden ist unerwartete Variationen in Messungen für Schiffe 1, 6, 7 und 12 (Ecke Reaktordruckbehälter). Alles in allem zeigt Instabilität eine Lockerung der Dichtungen am Einlass Gasleitungen in der Klammerplatten. Dieses Szenario kann behindern die-Sollwert zu erreichen. Ein weiterer Fallstrick zu vermeiden, wenn ein Experiment starten die Zellen lässt sitzen zu lange während der Impfung Schritt, wodurch sie zu begleichen. Weniger Zeit die Zellen sitzen, schadet desto geringer die Chance gibt, dass immer niedrigere Inokulum zellenzahlen chronologisch die Reaktordruckbehälter hinzugefügt werden die deutliche Tendenz, dass unwissentlich induzieren kann Studienergebnisse. Es ist besser, in mehreren Stufen zu impfen, d.h. impfen jede Kultur-Station mit Pause Schritte dazwischen, so dass die Zellen nicht in der Impfung Platte länger als 15 Minuten sitzen.
Zum täglichen Gebrauch, die Aufrechterhaltung der Sterilität ist von entscheidender Bedeutung. Obwohl das System in einem biologischen Sicherheitsschrank ist, garantiert Sterilität nicht durch häufige Bewegung innerhalb und außerhalb der Haube. Daher muss alles, was in der Haube geht mit 70 % IPA gesprüht werden. Zweitens ist es wichtig, um sicherzustellen, dass minimal Schäumen während der Kultur auftritt; Medien können verstopfen, Vergasung und Auspuff Linien, führt zur Beschädigung der Klemmplatte und sogar Kernkomponenten unten. Präventive Anti-Schaum-Zusatz Schritte sind in jedes Mikro Bioreaktor Programmdesign entscheidend. Im Falle einer "Schaum," es wäre von Vorteil, die Hersteller Reinigung Protokoll zu folgen und kann bleibende Schäden der Klammerplatten verhindern. Alternativ kann Einsatz nicht sparged Schiffe von Vorteil sein für geringeren Zelldichten oder wenn im Batch-Modus ausgeführt, da höhere Oberfläche zu Volumen-Verhältnis effiziente Sauerstoff auch mit Mangel eine Sparger ermöglicht. Jedoch nicht sparged Schiffe nicht nützlich für hohe Dichte oder Perfusion Zellkulturen möglicherweise der Kopfraum zu halten mit den wachsenden Verbrauch von Sauerstoff Kulturen nicht ausreicht.
Es gibt zahlreiche Vorteile des Microbioreactor-Systems, da mehrere kontrollierte Kulturen in einem kleinen Maßstab mit mehr Kontrolle als Fläschchen schütteln parallel ausgeführt werden können. 17 darum, das System erleichtert die Ausführung von screening-Studien, tut, Hochdurchsatz-Klon und Transfektion Studien. Automatisierte Handhabung von Flüssigkeiten reduziert auch Analyst-Analyst Variabilität bei gleichzeitiger Minimierung gleichzeitig mühsame und zeitintensive Arbeit für geschultes Personal. Zwar gibt es das System hat mehrere Vorteile, gibt es einige wesentliche Nachteile, die berücksichtigt werden sollten. Erstens ein kulturvolumen von 15 mL wesentlich einschränkt, Inprozess-Probenahme und Schlussernte Material und mehrere alternative kleinen Bioreaktoren (bis zu 500 mL) haben vor kurzem vorhanden geworden. Eine aktuelle Weiterentwicklung des Systems ist die Integration von automatisierten Microscale Bioreaktor mit dem BioProfile FLEX 2-Analyzer aus Nova Biomedizin, die im Prozess-Sampling-Thema mildert durch Reduzierung Probenvolumen für Dichte und Nährstoff Zellanalyse . Vorteile können schnelle Einrichtung und praktisch keine Reinigung führt zu Einsparungen, aber die Kosten für die verfügbaren Einheiten für langfristige Projekte berücksichtigt werden sollten, wie es die Einheiten als die herkömmlichen Mehrwegsystemen kaufen teurer sein kann.
In diesem Artikel beschriebene Methode eignet sich in erster Linie für die Zellkultur Batch-Modus, aber kann je nach den Bedürfnissen des Benutzers geändert werden. Jede Kultur Station hat unabhängige Steuerung der Temperatur, während auf der Ebene der einzelnen Reaktordruckbehälter und pH-Wert variiert werden können. Sartorius bietet auch DoE Planungssoftware speziell für die Experimente ermöglichen für die Mikro bioreaktorsystem angepasst werden. Groß angelegte DoE Studien mit der neuen DoE-Software des Herstellers können helfen in Medien und Optimierung zu ergänzen. Obwohl hier nicht verwendet, kann das Microbioreactor-System auch fed Batch Studien. Das System hat noch nicht für Zellkulturen Durchblutung optimiert. Allerdings gab es begrenzte Studien und Tests, Perfusion Zelle Kultur Betrieb im aktuellen Mikro bioreaktorsystem zu imitieren. 26 diese Methode kann geändert werden, um high-Density Perfusion Kulturen durch die Zelle, die Abrechnung zu imitieren. Durch Variation der Höhe das Pipettieren in den Reaktor eingefügt ist und durch die Optimierung der Einschwingzeit können die Medien entfernt und wieder aufgefüllt, Fülle Spiegelmodus Kultur. In diesem dritten Bereich, die möglicherweise besser als das System hier vorgestellten funktionieren Wunsch Perfusion Modus der Kultur gibt es neue Produkte.
Zusammenfassend lässt sich sagen diese Studie veranschaulicht die Verwendung von automatisierten Mikro-Bioreaktoren und verbundenen analytischen für CHO Zelle Kultur Operationen charakterisieren einen Modell IgG1 monoklonalen Antikörper zu produzieren. Er betont die Rolle kleinen Mikro-Bioreaktoren im Bioprozess Fertigungs- und ihre Auswirkungen auf die Zellentwicklung Kultur und Medien-Screening. Zwar gibt es viele Vorteile bei der Verwendung einer automatisierten kleinen Systems, um in vollem Umfang realisieren ihre Vorteile Prozessverständnis und analytische Charakterisierung ist zwingend erforderlich. Diese Studie bietet dem Benutzer eine Richtlinie für die Verwendung eines automatisierten Microscale Reaktor-System, das entwickelt und pro einzelnen Forschungsbedarf verbessert werden kann.
Disclosures
Disclaimer: Diese Veröffentlichung spiegelt die Meinung des Autors und darf nicht zur FDA Ansichten oder Richtlinien verstanden werden.
Acknowledgments
Die Autoren möchten Scott Lute für die analytische Unterstützung danken, die sie zur Verfügung gestellt. Teilweise interne Finanzierung und Unterstützung für diese Arbeit wurde von dem CDER kritische Pfad Programm bereitgestellt (CA #1-13). Dieses Projekt wurde teilweise unterstützt durch einen Termin, um das Praktikum/Teilnahme Forschungsprogramm an der Biotechnologie Büroartikel, US Food and Drug Administration, verwaltet vom Oak Ridge Institut für Wissenschaft und Bildung durch eine Interinstitutionelle Vereinbarung zwischen dem U.S. Department of Energy und FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
