Summary
Представлен подробный протокол для одновременной работы 48 параллельных клеточных культур в разнообразных условиях в системе microbioreactor. Процесс культуры клеток, урожай и последующих антитела титр анализа описаны.
Abstract
Автоматизированный микромасштабной биореакторов (15 мл) может быть полезным инструментом для инженеров культуры клеток. Они облегчают одновременное выполнение широкого ряда экспериментальных условий при минимизации потенциальных Вариабельность процесса. Применение этого подхода включают в себя: клон скрининг, температуры и рН сдвиги, оптимизации средств массовой информации и дополнения. Кроме того небольшой реактор томов способствуют большие дизайна экспериментов, что расследовать широкий спектр условий. Это позволяет вверх по течению процессам значительно оптимизирован до масштабов, где экспериментов является более ограниченный характер из-за времени и экономических трудностей. Автоматизированных микромасштабной биореактор системы предлагают различные преимущества по сравнению с традиционными мелких клеток культуры единицы, такие как встряхнуть флакон или фляги спиннер. Однако во время пилотного масштаба процесса развития значительные необходимо для обеспечения реализации этих преимуществ. При запуске с осторожностью, систему можно включить высокий уровень автоматизации, могут быть запрограммированы для выполнения Доу в большее количество переменных и может уменьшить время отбора проб при интеграции с питательных анализатор или счетчик соматических клеток. Интеграция Эксперт производные эвристики, представленные здесь, с текущей автоматизированных микромасштабной биореактор экспериментов можно свести к минимуму распространенных ошибок, которые мешают значимые результаты. В крайнем случае неспособность придерживаться принципов, изложенных здесь может привести к повреждению оборудования, которое требует дорогой ремонт. Кроме того в microbioreactor системах имеют небольшие культуры томов, затрудняя характеристика условий культуры клеток. Количество и количество проб, взятых в процесса в пакетный режим культуры ограничен, как эксплуатационные объемы не может опускаться ниже 10 мл. Этот метод будет обсудить преимущества и недостатки систем микромасштабной биореактора.
Introduction
Моноклональные антитела (mAbs) впервые были произведены в клетки hybridoma мыши в 1975 году1. С тех пор увеличение в развитии производства рекомбинантного белка имело место для гуманизации mAbs увеличения в естественных условиях безопасности и эффективности2,3,4. Большинство процессов производство рекомбинантных белков используют клеток яичника китайского хомяка (СНО) для легкости, с которой они могут быть адаптированы к сыворотке свободных средств массовой информации, их способность производить белки с аналогичными столб-поступательные изменения, врожденной человека белков и их надежности как принимающей ячейки5,6.
Чтобы доставить продукт, быстрее и для больших групп пациентов с стабильное качество растет спрос. Помимо экономических преимуществ растет репертуар заболевания mAbs, которая теперь включает в себя аутоиммунных заболеваний, осложнений после трансплантации, артрит и рака7. Средняя урожайность для современных коммерческих МАБ производственных линий, как правило, в диапазоне от 5-6 г/Л и продолжать расти5. Частично это было достигнуто путем Чо клеточной инженерии и улучшения производственной линии скрининга с помощью высокопроизводительного биореакторов8. Однако большинство увеличение производства белка приписываются процесс улучшений, включая прогресс в оптимизации средств массовой информации, условий культуры клеток и улучшено питание стратегии7,9,10. Питательные добавки имеет важное значение не только для роста надлежащего клеток, но и для эффективного производства высококачественного белка. Кроме того клетки требуют стехиометрическим добавления конкретных питательных веществ, требующих дополнительных понимание для кормления стратегия оптимизации6,11. Традиционная оптимизация методы включают в себя компонент титрования отдельных СМИ и СМИ, сливаясь с смесь конструкции. Однако эти методы потребляют много времени, труда и включают риски, связанные с человеческой ошибки12,13.
СМИ оптимизации исследований ранее полагались на 1-2 Л биореакторов, которые могут быть дорогими с точки зрения сырья и человеческого капитала и встряхнуть флакон. Планшет также были использованы, но эти методы предоставляют Ограниченная масштабируемость. Кроме того это все еще может потребоваться несколько трудоемкий запусков, которые вводят изменчивость партии партии, которая скрывает ОКХ изменчивости, вызванные состав средств массовой информации и стратегии кормления14,,1516. Таким образом необходимость возникла систем высокой пропускной способности и высокой согласованностью параллельных биореактор17,18,19,20.
С значительные расходы, связанные с операцией традиционных лабораторных биореакторах (0,5-5 L), microbioreactors предложить альтернативу, сокращению затрат для оценки производства биологически производных препаратов. 21 -лабораторных биореакторах перемешивают танк надежны и плотной данные через сенсорные массивы. Обратная связь системы управления позволяют легко надзора операции. Однако Ассамблея, калибровки, уборка, трудовые затраты, расходы субстрата и стерилизации требования сделать лабораторных биореакторах перемешивают танк дорогим и трудоемким для работы. Встряхните флакон и микротитровальных пластины удалить некоторые из этих расходов и трудовые проблемы, связанные с большего масштаба биореакторов, но эти альтернативы обеспечивают слабый контроль над условия обработки и низкой плотности данных, часто только конечную точку измерения. 22
Кроме того microbioreactors использовать небольшой объем работы для обеспечения уменьшения масштаба подход к линии клеток и вверх по течению процесса развития. Шкала microbioreactor экспериментов можно значительно снизить эксплуатационные расходы через нижний использования мощности, субстрат, труда, пространства и утилиты. 23 Microbioreactors, как встряхнуть флакон в том, что они просты в обращении из-за их размера, но они сохраняют преимущества традиционных лабораторных биореакторах через их обратной связи контроль pH, температуры, растворенного кислорода и кислоты/базы потребления, а также их вывода в реальном времени данных параметров качества, включая покинуть состав газа. Microbioreactor шкала позволяет для высокопроизводительного скрининга потенциал, который может быть полезным для клон отбора и процесса развития. 24
Биореактор Advanced микромасштабной было показано, быть эффективным инструментом для Чо клетки культуры процесс квалификации и развития18. Здесь ambr15 автоматизированная система, состоящая из 48 microbioreactors параллельно, которые показали, чтобы быть сопоставимы с классической перемешивают танк реакторов в масштабе до исследования,25 был использован в аналогично ранее работы, оптимизированное средства массовой информации Композиция для Чо-DG44 клеток линии производства модель химерных IgG16. Эффекты различных СМИ условий на рост и титр были по сравнению и проанализированы. В этом документе были представлены общего руководящего принципа для запуска системы microbioreactor и анализ образцов сырой СМИ.
Protocol
1. Семена поезд расширения
Примечание: Этот протокол использует 1 мл рекомбинантных DG44 Чо ячейку запасов, которые были сохранены на плотность составляет ~ 3 x 107 кл/мл. Разведения и сроков отдельных клеточных линий Чо будет меняться. Измерить кривых роста клеточной линии использоваться заранее и скорректировать соответствующим образом. Клетки первоначально талой в встряхните флакон и позднее переведен в колбу спиннер. Определите количество встряхните флакон и паук колбы для эксперимент, основанный на количество microbioreactors, который будет выполняться и целевой плотности посева.
- Быстро разморозить фондовых vial(s) Чо клеток путем погружать в ванну воды 37 ° C до только небольшой полоске остатков льда. Обеззараживанию вне флакона с помощью 70% этанола раствор и ворса ткани. Передача по биобезопасности кабинета.
- Вновь приостановить клетки, нежно закупорить вверх и вниз и передачи 1 мл стерильного 125 мл вентилируемые трясти колбу, содержащие подогретым СМИ 29 мл с 8 мм L-глютамина и 1 x пенициллина/стрептомицина.
Примечание: Если не указано иное, термин «СМИ» в этом протоколе будут определены далее как OptiCHO средства массовой информации. - Место пожать flask(s) в инкубаторе, в 37 ° C и 8% CO2. Используйте орбитальный шейкер агитировать клетки со скоростью 130 об/мин.
- Контролировать плотность жизнеспособных клеток (VCD) каждый день, с помощью автоматизированных ячейки, подсчет устройство или вручную с Горяева и Трипановый синий. Субкультура (разбавленные) клетки 72 часов после прививки в свежих СМИ (предварительно теплые СМИ до 37 ° C, каждый раз, когда оно должно быть добавлено клетки) таковы, что окончательный объем 100 мл в колбе спиннер 125 мл. Инкубируйте спиннер культур на тех же условиях, используемых для встряхнуть флакон культур со скоростью 70 об/мин.
Примечание: После субкультуры клетки должно быть плотностью 0,7-1 х 106 клеток/мл. Убедитесь, что окончательное плотность не ниже 0,5 х 106 клеток/мл. Субкультура после 96 h, если плотность клеток целевой для прививки в блесны не может быть достигнут. - На третий день (один день до приготовления посевным материалом), добавить свежий, подогретым СМИ спиннер-flask(s) для поддержания жизнеспособности ≥ 90%. Не следует превышать суммарный объем 125 мл. 6
2. Запуск системы автоматизированного microbioreactor
Предпосылки: Пользователь должен получили соответствующую подготовку от производителя и должны быть знакомы с безопасности и оперативных условий для системы.
- Инициализация и подключение к счетчик соматических клеток
- Инициализация системы программного обеспечения. Перед открытием программного обеспечения, убедитесь, что счетчик соматических клеток (см. Таблицу материалы) работает вместе с соответствующим программным обеспечением. Счетчик клеток интегрирована с системой.
- Подключение к клеток счетчика удаленное подключение перед открытием программного обеспечения. Нажмите на значок удаленного рабочего стола и нажмите на кнопку «Подключиться». После подключения удаленного рабочего стола, откройте программное обеспечение счетчик клеток. Установите новый реагент пакет, пустой Трипановый синий отходов и премьер системы.
- Свести к минимуму удаленного подключения и открыть микро биореактора программного обеспечения, используя существующие эксперимент в качестве шаблона для создания нового эксперимента. Задайте имя и сохраните эксперимент. Убедитесь, что счетчик автоматизированных клеток подключен в программном обеспечении на вкладке статус. Статус может быть также проверен на счетчик программного обеспечения ячейки.
- Определение пластины и погрузка судов
Примечание: обратитесь к рис 1 сориентироваться загрузка расходных материалов и реагентов на станции культуры и палубы. Крепежные пластины должна быть газобетона на тяжести цикл (используется для твердых материалов) до использования.- Прежде чем начать работать, определяют плит, используемых во время выполнения в разделе мимических программного обеспечения. Имя каждой пластины используются и назначить каждой пластины к колода на станции microbioreactor культуры.
- Используйте 24-ну пластины для зарядки СМИ и место на назначенный палубе культуры станции. Место 1 до 4 мл наконечник пипетки коробки в разделах, как указано на рисунке 1.
- Место прививки 24-ну пластины на соответствующих палубе культуры станции. Сингл ну 1 X фосфат буфер солевой (PBS) пластины место на палубе 1. Поместите один Ну 1 M NaOH пластину на палубе 2 и 24-ну пеногасящие пластины на палубе 7 (позиции как указано на рис. 1). Палубе чисел графически отображаются на вкладке «Имитировать» в программном обеспечении.
- Распакуйте культуры судов (оборудован размещенно) внутри вытяжки кабинета безопасности. Место Двенадцать судов стерильные культуры культуры станции. Место газобетона зажим плит на вершине судов. Убедитесь, что отверстия в вставок для мешалки все сталкиваются же направление для размещения легче.
Примечание: С помощью постоянного маркера, классифицировать культуры судов перед помещением их в культуру станции, чтобы сэкономить время и избежать путаницы во время сбора урожая. - Крепежные пластины O-кольца являются первой части носить после неоднократных автоклавирования, поэтому тщательно проверьте их перед автоклавированием перед каждой эксперимент. Рекомендуется хранение стерильного зажима плиты как резервного копирования в случае неудачи уплотнительное кольцо.
- Перемешать пластин на вершине зажим плит, обеспечение каждый штырь надежно вставлен. Закрепите зажим плит с винтами и ручки условии. Затяните ручки, пока они не руки плотно. Затяните левой и правой ручки в качестве альтернативы для даже размещение пластину зажима.
Примечание: Если зажим не заподлицо с поверхностью или если в конце пластины крепежные винты затянуты неравномерно, судов будет испытывать проблемы управления растворенного кислорода (ДУ). Если эти изменения не исправить ДУ, проверьте O-кольца как неполная Герметизация плит может привести к неэффективной газообразования культуры.
- Запуск программного обеспечения автоматизированных микро биореактор
Примечание: использование «Шаги процесса» вкладку, чтобы изменить или создать новые шаги. Шаги должны быть индивидуально запрограммированы для запуска и остановки любого процесса. Нажмите кнопку «Вставить шаг» на вкладке шаги процесса создания новых шагов или дважды щелкните на существующий шаг редактировать этот шаг. Действия программы разделены на десять основных разделов: запуска, зарядки СМИ, пеногаситель дополнение, ДУ / рН контроля, справочная база дополнений, приостановлено рН, прививка, число ячеек 5 X, 10 X число ячеек, питательных анализатора проб и культуры станции Shutdown. Продолжительность выполнения обычно составляет 7-9 дней, когда выполняются в пакетном режиме.- Система инициализирует и проверяет наличие соответствующих судов. Сканирование штрих-кода, с судов культуры. Же штрих-код может применяться для культуры станций с порожним судам или судам не используется.
- Системы начнется с разработанной программе после проверки управления ДУ, дегазации и другие соединения.
Примечание: Пользователь может перейти с программой, даже если ошибка происходит, но сделать это на риск пользователя и если разбирательство не наносит вреда системе и не будет прерывать эксперимент. Например газом может быть отключен для некоторых судов, не используемых в эксперименте, который покажет вверх как ошибку, но могут быть пропущены.
- Запуска и зарядки СМИ
- Первый день создание системы или средства массовой информации, зарядки день обозначается как день 0 время культуры.
- В разделе Запуск первой нагрузки накапайте советы, 1 мл и 4 мл советы, как запланировано. Если уже установлен, нажмите на продолжить. Поместите СМИ пластины, ПБС, 1 M NaOH, пеногаситель пластины, СМИ зарядки пластины и прививка пластины в назначенный палубы, или, если уже установлен, нажмите продолжить для перемещения к следующему шагу.
- В рамках запуска протокола начинают контроля температуры и установите температуру до 37 ° C. Переключиться на перемешивание на 1000 об/мин и ДУ / рН монитор.
- Далее выполните зарядки программы средств массовой информации. Обработчик жидкой системы автоматизированного microbioreactor будет обходиться СМИ от СМИ пластины к культуре судов, сопоставленный в программе. Средства массовой информации добавил является OptiCHO с различной условий процесса.
Примечание: Две скважины от 24-ну пластины требуются для заполнения одной культуры судна в емкость (13 mL), как каждой скважины могут разместиться только 8 мл средств массовой информации. Использование 7-8 мл в каждом хорошо для предотвращения рисования воздуха, когда СМИ находится в смеси жидких обработчиком до зарядки. - По завершении зарядки СМИ 35 мкл экс-Cell пеногаситель будут добавлены от пеногасящие пластины на судне культуры. 30 минут для питательной среды для хорошо перемешиваются и оптических ду / рН датчики для быть гидратированных.
Примечание: Такой же объем пеногаситель добавляется с перерывами на протяжении всего времени культуры, при обнаружении пенообразование. 6 пенясь обнаруживается визуально, и реактор судов проверяются каждый день для вспенивания. Пеногаситель добавляется сразу после обнаружения. - ДУ / контроль pH затем переключился начать мониторинг и запись делают и pH питательной среды. Позволяют сделать, чтобы достичь точки набор 50%, которая занимает не менее 2 ч.
- После делать уравновешивания включите фон базового дополнения для достижения рН уставка 7.1 для всех судов, культуры. Позволяют делать и рН сбалансировать на ночь и полностью быть увлажненной.
- Приостановленные рН - 1 день рН смещение
- На следующий день (отмечен как 1 день), выполнить шаг приостановленного рН, whereby выберите культура судов анализируются и определяется смещение коррекции рН.
Примечание: Количество судов рН для выборки для зачета рН является определяется пользователем. Образец из каждого реактора не может быть необходимым, если у вас есть хорошее представление биореактор населения. - Место держателя образца трубки, пластины на назначенный палубы и нагрузки микро пробирок с шапки открыть и заправленные рядом с ними. Обработчик жидкость будет отказаться от 600 мкл жидкости культуры клеток в трубу, сопоставленный в программе.
-
Немедленно удалите образца и измерения pH на питательных веществ bioanalyzer, правильно откалиброван и для которого выполнены бок (см. ниже, «Ежедневного питательных веществ и метаболит анализ»).
Примечание: Образцы выполняются индивидуально, сразу же после нанесения, чтобы избежать изменения рН вследствие воздействия воздуха, как дегазации CO2 из образца может вызвать изменения рН. - Нажмите «продолжить» после каждого образца, в противном случае не будет выполняться следующий шаг.
- Введите значения внешних, FLEX-производные рН в программном обеспечении, «компиляция» смещения для пробы судов автоматически. Средняя смещения, полученные для образца судов и введите число в столбце смещения рН пользователя на вкладке «Данные судна» вручную. Среднее смещение будет применяться ко всем судам. Разрешить рН сбалансировать для по крайней мере 2-3 часа, после чего могут быть привиты культуры судов.
- На следующий день (отмечен как 1 день), выполнить шаг приостановленного рН, whereby выберите культура судов анализируются и определяется смещение коррекции рН.
- Прививка
- После измерения VCD, передавать содержимое счетчика-flask(s) в стерильные, 250 мл конические центрифуги трубки и Пелле клетки центрифугированием 10 мин на 140 x g при комнатной температуре. Декант старые средства массовой информации и вновь приостановить в достаточно свежие СМИ, таким образом, чтобы окончательный плотность должна быть 1 х 106 клеток/мл после добавления посевные культуры судна.
- Добавьте подвесной клетки в назначенный хорошо из стерильных крышкой 24-ну пластины. Добавьте 3 мл посевным материалом для каждой скважины, из которых 2 мл будут удалены как посевным материалом для каждого судна культуры.
- Место пластину посевным материалом на назначенный палубе внутри вытяжки. Убедитесь, что вы спрей внешней крышкой посевным материалом пластины с 70% спиртом перед его размещением внутри вытяжки.
- Клеток подсчета с помощью автоматизированных счетчик соматических клеток
- После прививки пусть культуры судов сбалансировать для по крайней мере час. После часа выполните 5 X клеток всего шаг в программе. 5 X указывает коэффициент разрежения, используемый для чтения число ячеек.
Примечание: 5 X клеток count используется первоначально когда клетки находятся в стадии ЛАГ. После того, как клетки достичь их экспоненциальной фазе будет использоваться 10 X клеток. На основе образца и разбавителя томов инструмент автоматически учитывает коэффициент разрежения и соответствующим образом изменяет конечное значение. - Сначала жидкость обработчик добавляет 480 мкл ПБС Кубок счетчик клеток, от культуры судна с последующим добавлением 120 мкл жидкости культуры клеток. Число ячеек затем считывается с помощью автоматизированных клеток счетчика. Этот шаг повторяется для всех судов.
- Счетчик клеток является последним шагом на день 1 время культуры. Наряду с ДУ и pH данных число ячеек данных (плотность жизнеспособных клеток и жизнеспособности) также записывается ежедневно от программного обеспечения.
Примечание: Очистите ячейки счетчика Кубок по крайней мере дважды в течение продолжительности выполнения с 70% АПИ для предотвращения засорения линий. Линии и потока ячейки автоматически очищается после каждой ячейки count.
- После прививки пусть культуры судов сбалансировать для по крайней мере час. После часа выполните 5 X клеток всего шаг в программе. 5 X указывает коэффициент разрежения, используемый для чтения число ячеек.
- Приостановленные рН - день 2 рН смещение
- В день 2 время культуры повторите шаг «Приостановлен рН» с помощью культуры судов, за исключением тех, которые были взяты пробы от на этапе первоначальной паузы рН.
Примечание: Выборки населения судна для приостановленного рН будет обеспечивать лучшее смещение для коррекции рН. Следовательно не образец же судов, используемых для приостановленного pH от предыдущего дня.
- В день 2 время культуры повторите шаг «Приостановлен рН» с помощью культуры судов, за исключением тех, которые были взяты пробы от на этапе первоначальной паузы рН.
- Каждодневный рацион и метаболит анализ
- Образцы будут приниматься для питательных анализа от 2 день культуры до конца эксперимента и анализируются с помощью питательных веществ bioanalyzer.
- Место держателя образца трубки, пластины на назначенный палубы и нагрузки микро пробирок с шапки открыть и заправленные рядом с ними. Обработчик жидкость будет обойтись жидкость культуры клеток в трубу, сопоставленный в программе.
Примечание: Для первоначального несколько дней (2-4 дней) выборки взяты из культуры судна составляет 300 мкл. Это смешивается с 300 мкл ПБС обойтись жидкость обработчиком. Это делается для сохранения культуры объем и предотвратить уровень снижается ниже 10 мл. Кроме того питательных значения для первых нескольких дней попадают в диапазон обнаружения документа после разбавления. - Поместите образцы в анализатор лоток для выполнения анализа питательных веществ.
Примечание: Заморозить любые образцы, которые не будут анализироваться в тот же день.
- Завершение работы системы
- Для завершения выполнения, сначала выключить контроль температуры, после чего агитация. Во-вторых, остановить делать / контроль pH и справочная база дополнений. В-третьих прекратить все другие элементы управления. И наконец остановите системный монитор.
- Отвинтите зажим и перемешать пластины и удалить культуры судов. Очистите внутренние станции культуры салфеткой ворса. Место сушки пластин на станции культуры и закрепите их.
Примечание: Сушка цикла требуется для охлаждения версии системы и не является необходимым для стандартной версии системы. - Выполните цикл сушки 2-часовой программы. Очистить пластины зажим ультрачистая вода следуют 70% изопропиловый спирт (IPA), чтобы удалить возможные конденсированной жидкости в линиях. Заподлицо с воздуха для удаления остатков жидкости.
- Нажмите на «Стоп» в биореакторе программного обеспечения после завершения цикла сушки.
3. клетки культуры урожая
- Передача жидкости культуры клеток из сосудов реактора и Пелле клетки на 1,962 x g на 5 минут при комнатной температуре.
- Декант супернатант. С помощью 0,22 мкм PVDF стерильные фильтр жидкости культуры отстой клеток.
- Аликвота 1 мл стерильного клетки культуры жидкости в 1,5 мл Eppendorf трубки для анализа титр. Хранение 1 мл трубки при-20 ° C. Очищайте остальнои заготовленных клеток культуры жидкости с помощью жидкостной хроматографии системы быстрого белка. 6
4. Измерение IgG титры
Примечание: Это беглый обзор запуска и анализа образцов с помощью системы биосенсор proteinA. Все анализа параметров ( например , температуры, времени чтения, об/мин, и т.д. ) должны быть определены эмпирически для каждого типа образца.
- Включите систему и дайте лампа для разогрева по крайней мере 1 h. удалить образцы из фризера оттепель и сбалансировать до комнатной температуры.
- В системе программного обеспечения, установите температуру плита на 26 ° C. Предварительно Замочите количество белка А советы для использования в образец матрицы (например , ячейку СМИ) для по крайней мере 30 минут.
Примечание: Оптимальная температура необходимо определить эмпирически. Температура 26 ° C используется здесь для сведения к минимуму образца испарения во время анализа и разрешить инструмент для проведения постоянной температуре (, будучи несколько градусов выше температуры окружающей среды). Образцы должны быть предварительно уравновешенной для выбранной пробирного температуры до измерения инкубации образца пластины на сцену образца для ≥ 10 минут. - Построить белка калибровочной кривой с помощью же антитела, сосредоточено до 10 мг/мл и серийно разбавляют в матрице образца (то есть СМИ) в диапазоне, который необходимо обнаружить.
Примечание: Это важно для получения высокой концентрации антител к минимуму матрица эффектов за счет разрежения, но также важно не над сконцентрировать антитела и побудить агрегации. Запуск калибровочной кривой в пластину для каждой пластины образца является предпочтительным. Минимально положительный контроль должен использоваться для учета изменчивости вершины до основания и плита to-plate. Новый калибровочной кривой, должна создаваться для каждой новой партии белка используется советы. - Дизайн выборки пластины (в качестве примера, пожалуйста, смотрите Рисунок 2). В протеине A assay который использует регенерации, до 80 образцов могут быть проанализированы, которая включает в себя образцы неизвестной культуры, стандарты и контроль. Для каждой пластины проанализированы один белок А отзыв будет использоваться для измерения до 10 образцов через пластину (колонки 1-10), с циклом регенерации между выборками.
Примечание: Рекомендуется, что всю первую строку пластины (ряд А) использоваться в качестве отрицательного контроля и ссылки. В assay, обсуждаемые здесь строк, B и C используются для двух положительных элементов управления; один нижний и верхний предел линейным откликом. Это гарантирует, что каждый Совет мер негативные и позитивные элементы, прежде чем анализировать образцы. Эта настройка также упрощает ссылку вычитания в программное обеспечение для анализа. Затем оставшиеся скважин используются для неизвестных образцов. Если есть образец разрыв в одной из строк, что хорошо для предотвращения высыхания кончика должны быть матрицу (т.е. Уэллс A2 через G2 имеют образец а H2 не. Обеспечить H2 содержит образец матрицы для обеспечения подсказка не высыхает, прежде чем приступить к образцу H3). Наконец не исчерпывают советы, используя один набор для анализа нескольких пластин. Рекомендуется использовать новый, не регенерировать набор для каждой плиты. - Подготовка пробы для анализа, аккуратно смешивая, либо путем инверсии или закупорить, следуют пульс спина для сбора образцов в нижней части трубки. Для концентрированных образцов создайте соответствующие разрежения реплицирует разбавлением в образец матрицы.
Примечание: Диапазона линейной привязки для антитела для белка измерения интерферометрии (BLI) био слой будет зависеть от антител, анализа условий и матрицы. Это должно определяться эмпирически заранее чтобы убедиться, что используется соответствующий образец разведениях. - Подготовьте образец 96-луночных пластины как можно ближе к времени анализа как можно. Обеспечить есть нет пузырьков воздуха в любом из скважин. Удаление пузырьков воздуха с наконечником чистой пипетки или центрифугированием.
- Загрузить пластины в систему и запустить пробирного, используя значения по умолчанию «Высокая чувствительность Assay с регенерации» программное обеспечение для сбора данных. Анализ, используя программное обеспечение для анализа данных ХТ.
Примечание: Если плиты должны быть подготовлены досрочно из-за ограничений, надежно печать с пленкой для предотвращения испарения. В зависимости от ожидаемого титры приобретение ставок и время может потребоваться скорректировать. Обратитесь к руководству для руководства. - С помощью программного обеспечения для анализа данных, Справочник вычесть и рассчитать концентрацию неизвестных образцов, с использованием стандартной кривой и функция первоначальный наклон (IS) с линейной point-to-point подходят.
Representative Results
Мониторинг критических технологических параметров и другие параметры культуры клеток на протяжении всей операции клеточных культур является важным аспектом в биотехнологии. Счетчик клеток и питательных анализатор были использованы для количественной оценки пяти атрибутов, которые характеризуют рост клеток, питательных потребления и побочный эффект формирования. Счетчики клеток были получены ежедневно для всех условий культуры. Средняя жизнеспособных клеток плотности и коммуникации, как показано на рисунке 3 , наряду с их ±1 SD интервала. Питательных веществ и побочный продукт профили также показано с интервалом SD ±1 через стационарной фазы культур. Наклон этот профиль представляет средний глюкозы и глютамин потребления и производства молочной кислоты, ставки. В целом эти результаты демонстрируют возможности мониторинга эти атрибуты в системе microbioreactor; а также системы microbioreactor возможность сохранить эти параметры в узком диапазоне.
Общая продуктивность культур клеток была количественно с помощью системы биосенсор proteinA после заготовленных клеток культуры средств массовой информации был передан через фильтр PVDF 0,22 мкм. Конкретные производительности в клетку, варьировались от 0.87 ПГ/мобильный d до 1,15 ПГ/мобильный d как показано на рисунке 4. Основываясь на эти результаты могут быть исследованы широкий спектр условий для выбора состава СМИ и кормления стратегии, которые максимальное количество белка производится для минимальных инвестиций в экспериментальной процедуры.
Рисунок 1 : Схема системы microbioreactor с 4 станции культуры (CS), имея 12 сосуды реактора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Пример пример плита настройки для основной количественный регенерации эксперимент в системе биосенсор proteinA. Строка 1 (красный «R») зарезервирован для эталонного образца(в матрице отсутствуют аналита); строка 2 (Аквамарин) представляет собой набор стандартов (концентрации находятся в мкг/мл); строки 3 и 4 (оранжевый) являются наборы низких и высоких положительных элементов управления («PL» и «PH», соответственно); строки 5-10 (фиолетовый) содержат неизвестных образцов; Программа-по умолчанию позиции для регенерации («R») и нейтрализации («N») буферов строки 11 и 12 (серый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : ) средняя плотность и жизнеспособности профили жизнеспособных клеток в возрасте старше партии. SD ± 1 показано также для обозначения жесткий контроль роста клеток в microbioreactor системах. b) средняя питательных профиль для глюкозы и глютамин, а также средняя субпродукт профиль для молочной кислоты. SD ± 1 показано также для обозначения жесткий контроль над СМИ композиция в microbioreactor системах. (N = 3, все условия были запущены в трех экземплярах). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представитель коробки участок средней производительности конкретных условий различных СМИ. (N = 3, все условия были запущены в трех экземплярах) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Запуск автоматизированных микро биореактор системы должным образом и эффективно предполагает своевременное выполнение нескольких автоматизированных шагов. Одним из наиболее важных частей системы это программирование, программное обеспечение. Если есть любые ошибки при написании программы, будет существовать серьезные ошибки в эксперимент, который может привести к неожиданным изменениям в процессе кормления стратегия, стратегия выборки или качества конечного продукта, который может сделать недействительными результаты исследования. Еще одним важным аспектом работы системы – на место и затяните крепежные пластины правильно для обеспечения надлежащего управления ДУ. Наиболее распространенными указание, что плита зажим был ужесточен неравномерно — неожиданные вариации в делать измерения для судов 1, 6, 7 и 12 (угол реактора судов). Общая нестабильность ду указывает, ослабление прокладки на линиях впуска газа в зажим плит. Этот сценарий может препятствовать достижения уставки. Другой типичной ошибкой избежать при начиная эксперимент, давая клетки сидеть слишком долго на этапе прививка, заставляя их урегулировать. Меньше времени, клетки проводят сидя, тем меньше шансов, есть что постепенно нижней посевным материалом клеток добавляются хронологически сосуды реактора, которые могут вызвать значительный уклон, что невольно вредит результаты исследования. Это лучше прививать в несколько этапов, т.е. инокуляции каждой культуры станции один за другим с паузы шаги между ними, так что клетки не сидят в пластину прививка не более 15 минут.
Касающихся повседневного использования, поддержания стерильности имеет жизненно важное значение. Хотя система находится в биологической безопасности кабинета, стерильность не гарантируется из-за частых движения и капот. Следовательно все, что идет в капюшоне должны быть распылен с 70% IPA. Во-вторых важно обеспечить, чтобы минимальная вспенивание происходит во время культуры; средства массовой информации может засорить газообразования и магистрали, ведущие к повредить крепежные пластины и даже основных компонентов ниже. Шаги превентивного пеногасителя дополнение критически важны в любой дизайн программы микро биореактора. В случае «пена,» было бы полезно следовать производителей, очистки протокол и может предотвратить повреждение зажим плит. Кроме того использование не орошают судов может быть полезным для более низких плотностей ячейки или при запуске в пакетном режиме, как выше поверхности соотношение объема позволяет эффективно кислорода даже с отсутствием размещенно. Однако-орошают судов не может быть полезным для плотности или перфузии культур высокой клеток, как глава пространства недостаточно, чтобы идти в ногу с культурами растущее потребление кислорода.
Есть многочисленные преимущества, предоставляемые системой microbioreactor, поскольку он позволяет несколько контролируемых культур будет работать параллельно в небольшом масштабе больший контроль, чем встряхнуть флакон. 17 таким образом, эта система облегчает выполнение скрининговых исследований, делает, высокая пропускная способность клон исследований и исследований transfection. Автоматизированной обработки жидких также снижает изменчивость аналитик аналитик одновременно минимизируя утомительно и времени интенсивного труда для квалифицированного персонала. Хотя есть несколько преимуществ к системе, существует ряд ключевых недостатков, которые следует учитывать. Во-первых, значительно ограничивает культуры объемом 15 мл, в процесс отбора проб и окончательный урожай материал и несколько альтернативных малых биореакторах (до 500 мл) недавно стали доступны. Один последние улучшения в системе является интеграция автоматизированной микромасштабной биореактор с анализатором BioProfile FLEX 2 от Nova биомедицинских, которая снижает опасность в процесс отбора путем уменьшения объема выборки для анализа плотности и питательных веществ клеток . Преимущества могут включать быстрой установки и практически без очистки ведущих оперативные экономии, однако стоимость одноразовые единиц должны рассматриваться в долгосрочной перспективе проектов как это может быть дорогостоящим для приобретения единиц, чем многоразовые обычных систем.
Метод, рассматриваемых в настоящем документе в первую очередь подходит для пакетного режима клеточной культуры, но может быть изменен в зависимости от потребностей пользователя. Каждая культура станция имеет независимый контроль температуры, в то время как делать и рН может изменяться на уровне отдельных реактор судов. Портняжная также предлагает Доу, планирование программное обеспечение, разработанное специально для того, чтобы позволить эксперименты специально для системы микро биореактора. Крупномасштабные DoE исследования с использованием нового программного обеспечения Доу, предоставляемых производителем может помочь в средствах массовой информации и дополнения оптимизации. Хотя здесь не используется, microbioreactor система также позволяет кормить Пакетная исследования. Система еще не был оптимизирован для культур клеток перфузии. Однако были ограниченные исследования и испытания, чтобы имитировать операцию культуры клеток перфузии в текущей системе микро биореактора. 26 этот метод может быть изменен для имитации высокой плотности перфузии культур клеток урегулирования. Различной высоты, к которому накапайте вставляется в реакторе и оптимизации времени усадки средства массовой информации можно снять и пополняется зеркало изобилие режим культуры. Есть новые продукты в этой развивающейся области, которая может работать лучше, чем системы, представленные здесь, если режим перфузии культуры.
Таким образом это исследование демонстрирует использование автоматизированных микро биореакторов и связанных аналитических операций культуры клеток Чо производить и характеризуют модель IgG1 моноклональные антитела. Это подчеркивает микро биореакторов роли малого масштаба в Биопроцесс производства и их влияние на развитие культуры клеток и СМИ скрининга. Хотя есть много преимуществ в использовании системы автоматизированной малого масштаба, в полной мере реализовать свои преимущества процесса понимания и аналитических характеристик важно. Это исследование предоставляет пользователю с ориентиром для использования автоматизированных микромасштабной реактора системы, которые могут быть разработаны и улучшены в отдельных исследовательских потребностей.
Disclosures
Отказ: Эта публикация отражает мнение автора и не должно быть истолковано как отражают взгляды или политику FDA.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Скотт лютни аналитическую поддержку, которую они предоставили. Частичное внутреннее финансирование и поддержка этой работы была представлена программой критического пути CDER (CA #1-13). Этот проект частично поддержали назначение при управление биотехнологической продукции, США продовольствия и медикаментов, ведении Окриджская институт науки и образования через участие программы стажировки/исследования межучрежденческое соглашение между министерства энергетики США и FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
