Summary
En detaljert protokoll for samtidig bruk av 48 parallelle cellekulturer under ulike forhold i et microbioreactor system er presentert. Celle kultur prosessen, harvest og påfølgende antistoff titer analyse er beskrevet.
Abstract
Automatisert Mikroskala bioreactors (15 mL) kan være et nyttig verktøy for celle kultur ingeniører. De rette samtidig kjøring av en rekke eksperimentelle forhold samtidig som potensielle prosessen variasjon. Anvendelser av denne tilnærmingen inkluderer: klone screening, temperatur og pH SKIFT, media og supplement optimalisering. Videre, liten reaktoren volumene er bidrar til store forsøksplanlegging som undersøke en rekke forhold. Dette gjør at oppstrøms prosesser optimaliseres betydelig før skalere opp der eksperimentering er mer begrenset i omfang på grunn av tid og økonomiske begrensninger. Automatisert Mikroskala bioreactor systemer tilbyr ulike fordeler fremfor tradisjonelle småskala celle kultur enheter, for eksempel riste flasker eller spinner flasker. Men under pilot skala må prosessen utvikling betydelige hensyn tas for å sikre at disse fordelene er realisert. Når kjører med forsiktighet, systemet kan aktivere høy automatisering av lydnivå, kan programmeres til å kjøre does med mange variabler og kan redusere prøvetidspunkt når integrert med en næringsrike analyzer eller cellen teller. Integrering av ekspert-avledet heuristikk presenteres her, med gjeldende automatiserte Mikroskala bioreactor eksperimenter kan minimere vanlige feller som hindrer meningsfulle resultater. I ekstreme, kan unnlatelse av å følge prinsippene fastsatt her føre til skade på utstyret som krever dyre reparasjoner. Videre har microbioreactor systemene små kultur volumer gjør karakteristikk av cellen oppdrettsforholdene vanskelig. Antall og mengde prøver tatt pågår i batch modus kultur er begrenset som opererer volumer ikke kan falle under 10 mL. Denne metoden vil diskutere fordeler og ulemper av Mikroskala bioreactor systemer.
Introduction
Monoklonale antistoffer (mAbs) ble først produsert i mus hybridoma celler i 19751. Siden da har en økning i utviklingen av rekombinant protein produksjon skjedd å humanize mAbs økning i vivo sikkerhet og effekt2,3,4. De fleste av produksjonsprosessen rekombinante proteiner ansette kinesiske Hamster eggstokk (CHO) celler for enkelt som de kan tilpasses serum frie medier, deres evne til å produsere proteiner med lignende post-translasjonell endringer som av en medfødt menneskelig protein og deres pålitelighet som vert celler5,6.
Etterspørselen vokser for å levere produktet raskere og større pasientgrupper med konsistent kvalitet. I tillegg til økonomiske fordelene øker repertoaret av sykdommer behandlet av mAbs, som nå inkluderer autoimmune sykdommer, etter transplantasjon komplikasjoner, leddgikt og kreft7. Gjennomsnittlig avkastning for moderne kommersielle mAb produksjonslinjer er vanligvis mellom 5-6 finans og fortsette å stige5. Delvis er dette oppnådd gjennom CHO celle engineering og forbedret produksjonslinjen screening med høy gjennomstrømming bioreaktorer8. Men har de fleste øker protein produksjon blitt tillagt for å behandle forbedringer, blant annet fremskritt i media optimalisering, celle kultur forhold, og forbedret fôring strategier7,9,10. Næringsstoffet kosttilskudd er viktig ikke bare for riktig cellevekst men også for effektiv produksjon av høykvalitets protein. Videre krever celler stoichiometric tillegg av spesifikke næringsstoffer, krever mer forståelse for fôring strategi optimalisering6,11. Tradisjonelle optimalisering metoder omfatter individuelle medier komponent titrering og media med blanding design. Men disse metodene er tidkrevende, arbeidskraft intensiv, og involverer risiko forbundet med menneskelige feil12,13.
Optimalisering medievitenskap avhengig tidligere riste flasker og 1-2 L bioreaktorer som kan være uoverkommelig dyrt råvarer og menneskelig kapital. Microplates har også blitt brukt, men disse metodene gir begrenset skalerbarhet. Videre er krever dette fortsatt flere tidkrevende kjører som innføre parti til parti variasjon som tilslører den CQA variasjonen skyldes media komposisjon og fôring strategi14,15,16. Dermed behovet for høy gjennomstrømming og svært konsekvent parallelle bioreactor systemer fremkom17,18,19,20.
Med betydelig bekostning forbundet med bruk av tradisjonelle benk skala bioreactors (0,5-5 L), microbioreactors tilbyr et alternativ for å redusere kostnaden vurdere produksjon av biologisk avledet narkotika. 21 benk skala rørt-tank bioreaktorer er pålitelig og gi tett data via sensoriske matriser. Tilbakemeldingssystemer tillate enkel overvåking av operasjonen. Men gjør den montering, kalibrering, rengjøring, lønnskostnader, substrat kostnader og sterilisering krav benk skala rørt-tank bioreaktorer dyrt og arbeidskrevende å operere. Riste kolber og være ferdig innen platene fjerner noen av kostnadene og arbeidskraft problemer forbundet med større skala bioreaktorer, men disse alternativene gir svak kontroll over behandling forhold og produsere lav tetthet data, ofte bare end-point målinger. 22
Eventuelt bruke microbioreactors et lite volum for å gi en skala ned tilnærming til celle linje og oppstrøms Prosessutvikling. Omfanget av microbioreactor eksperimenter kan betydelig redusere kjører kostnadene gjennom lavere utnyttelse av makt, substrat, arbeidskraft, mellomrom og verktøy. 23 Microbioreactors er like riste flasker i at de er lett å håndtere pga sin størrelse, men beholde de fordelene med tradisjonelle benk skala bioreaktorer gjennom online tilbakemeldinger kontrollen med pH, temperatur, oppløst oksygen og syre/base forbruk samt sanntidsdata produksjonen kvalitet parametere inkludert av gass komposisjon. Microbioreactor skala tillater for høy gjennomstrømming screening kapasitet, som kan være nyttig for klone utvalg og prosessen. 24
Den avanserte Mikroskala Bioreactor har vist seg å være et effektivt verktøy for CHO celle kultur prosessen karakterisering og utvikling18. Her, en automatisert ambr15 system, bestående av 48 microbioreactors parallelt, som har vist seg å være sammenlignbare med klassisk rørt tank reaktorer i skala opp studier,25 ble brukt på en måte analog til tidligere arbeid som optimalisert media komposisjon for en CHO-DG44 celle linje produsere en modell chimeric IgG16. Effekten av varierende media forhold på vekst og titer ble sammenlignet, og analysert. I dette papiret presentert en generell retningslinje kan kjøre microbioreactor systemet og analyse av råolje media prøver.
Protocol
1. frø trene utvidelse
Merk: Denne protokollen bruker 1 mL rekombinant DG44 CHO celle aksjer som er lagret på en tetthet av ~ 3 x 107 celler/mL. Fortynninger og tidslinjer for individuelle CHO cellelinjer varierer. Måle vekst kurver av cellen linjen skal brukes på forhånd og justere deretter. Cellene er utgangspunktet tint i riste flasker og senere overført til en spinner kolbe. Bestemme antall riste kolber og spinner flasker nødvendig for eksperimentet basert på antall microbioreactors som skal kjøres og målet seeding tetthet.
- Raskt tine lager vial(s) CHO celler ved å leve i et vannbad 37 ° C til bare en liten sliver av isen. Dekontaminere utsiden av ampullen med 70% etanol løsning og en lofri vev. Overføre til en biosafety kabinett.
- Nytt suspendere celler av forsiktig pipettering opp og ned og overføre 1 mL til et sterilt 125 mL ventilerte riste flasken med 29 mL forvarmes media med 8 mM L-glutamin og 1 x Penicillin/Streptomycin.
Merk: Med mindre annet er angitt, vil begrepet "media" i denne protokollen heretter defineres som OptiCHO media. - Sted riste flask(s) i en inkubator opprettholdt på 37 ° C og 8% CO2. Bruk en orbital shaker Kaishek celler med en hastighet på 130 rpm.
- Overvåke levedyktig celle tetthet (VCD) hver dag på en automatisert celle teller enheten eller manuelt med hemocytometer og trypan blå. Subkultur (fortynnet) cellene 72 timer etter vaksinasjon i friske media (pre varme media 37 ° c hver gang det legges til celler) slik at det siste bindet er 100 mL i en 125 mL spinner kolbe. Inkuber spinner kulturer på samme vilkår brukes for riste flasken kulturer med en hastighet på 70 rpm.
Merk: Etter subkultur, bør celler være en tetthet på 0,7-1 x 106 celler/mL. Kontroller at siste tetthet ikke er under 0,5 x 106 celler/mL. Subkultur etter 96 h hvis målet cellen tettheten for vaksinering i spinnere ikke kan nås. - På dag tre (en dag før inoculum forberedelser), legge til friske, forvarmes medier spinner-flask(s) å opprettholde ≥ 90% levedyktighet. Ikke overstige 125 mL totalt volum. 6
2. kjører automatiserte microbioreactor systemet
Krav: Brukeren må har fått riktig trening fra produsenten, og må være kjent med sikkerheten og forholdene for systemet.
- Initialiserer og koble til celle Counter
- Initialisere systemet opererer programvare. Kontroller at celle telleren (se Tabell for materiale) kjører sammen med de respektive programvaren før du åpner programmet. Cellen telleren er integrert med systemet.
- Koble til celle counter ekstern tilkobling før du åpner. Klikk på fjern desktop-ikonet og klikk på "Connect". Når det fjern desktop er koblet, åpne cellen counter programvare. Installere en ny reagens pakke, tom trypan blå avfall og prime systemet.
- Minimere den eksterne tilkoblingen og åpne mikro bioreactor programvaren bruker et eksisterende eksperiment som en mal til å opprette et nytt eksperiment. Navn og lagre eksperimentet. Kontroller at automatiserte celle telleren er koblet under status-kategorien i programvaren. Statusen kan også kontrolleres på cellen counter programvare.
- Definere plater og lasting fartøy
Merk: se figur 1 å orientere lasting av forbruksvarer og reagenser kultur stasjoner og dekk. Klemme platene skal autoklaveres på en tyngdekraften syklus (brukes for faste stoffer) før bruk.- Før du starter en kjøre, definere platene under løp i etterligne delen av programvaren. Navngi hver plate brukes og angi hver plate til en kortstokk på microbioreactor kultur station.
- Bruk en 24-vel plate media lading og plassere på utpekte dekket av kultur stasjonen. Sted 1 mL og 4 mL Pipetter tips boksene i delene som vist i figur 1.
- Plass en 24-bra vaksinering plate på respektive dekket av kultur stasjonen. Plasserer de single-og 1 X fosfat bufret saltvann (PBS) plate på dekk 1. Plass én-vel 1 M NaOH platen på dekk 2 og 24-vel skumdemper plate på dekk 7 (posisjoner som vist i figur 1). Dekk tallene vises diagrammatically under kategorien "Etterligne" i programvaren.
- Pakk ut kultur fartøyene (utstyrt med sparger) innenfor sikkerhet regjering panseret. Plass tolv steril kultur fartøy per kultur stasjon. Sted autoklaveres klemme plater på fartøyene. Kontroller at hullene i inserts tilgjengelig for stirrers alle møte i samme retning for enklere plassering.
Merk: Med et permanent markør, kategorisere kultur fartøyene før du plasserer dem i kultur-stasjonen for å spare tid og unngå forvirring tid for innhøsting. - Klemme plate o-ringer er den første delen å slites ned etter gjentatte autoklavering, derfor nøye sjekke dem før autoklavering før hvert eksperiment. Holde en steril klemme plate som back-up ved O-ring feil anbefales.
- Plasser rør platene på klemmen platene, sikre hver pin er satt helt inn. Sikre klemme platene med skruer og bryterne. Skru knottene til de er hånd stramt. Stram venstre og høyre knotter alternativt for selv plassering av klemme plate.
Merk: Hvis klemmen ikke er flush mot overflaten eller skruene på slutten av klemme platen er ujevnt strammet, vil fartøyene oppleve oppløst oksygen (DO) problemer. Hvis disse justeringene ikke retter gjør problemet, sjekk på O-ringene som ufullstendig tetting av platene kan føre til ineffektiv gassing kultur.
- Kjører automatiserte mikro Bioreactor programvare
Merk: bruk "prosesstrinn" kategorien for å redigere eller opprette nye skritt. Trinn må programmeres individuelt til å starte og stoppe prosesser. Klikk "Sette skritt" knappen under kategorien prosess trinnene til å opprette nye skritt eller Dobbeltklikk på et eksisterende skritt for å redigere dette trinnet. Programtrinn er delt inn i ti hoveddeler: oppstart, Media lading, Antifoam tillegg, gjør / pH kontroll, bakgrunn Base tillegg, midlertidig stoppet pH, vaksinering, 5 X celletall, 10 X celletall, næringsinnhold Analyzer prøvetaking og kultur stasjon nedleggelse. Kjøre varigheten er vanligvis mellom 7-9 dager når kjøre i satsvis modus.- Systemet initialiserer og ser etter av aktuelle fartøyene. Skann strekkoden med kultur fartøyene. Samme strekkoden kan brukes for kultur stasjoner med tomme kar eller fartøy ikke brukes.
- Systemet vil begynne med programmet designet etter avmerker gjøre kontroll, gassing og andre tilkoblinger.
Merk: Brukeren kan fortsette med programmet selv om en feil oppstår, men gjør det på brukerens egen risiko og hvis du fortsetter fremover ikke skade systemet og vil ikke forstyrre forsøket. For eksempel kan gassing være slått av for visse fartøy som ikke brukes i eksperimentet som vises som en feil, men kan omgås.
- Oppstart og Media lading
- Innstillingen for første dag opp systemet eller media lading dagen angis som 0 kultur.
- I delen oppstart første Last Pipetter tips, både 1 mL og 4 mL tips, som programmert. Hvis allerede plassert, klikk på Fortsett. Plasser media plate, 1 X PBS, 1 M NaOH, skumdemper tallerken, media lading plate og vaksinering plate i utpekte dekk eller hvis allerede plassert, Trykk Fortsett å flytte til neste trinn.
- Som en del av oppstart-protokollen, begynner temperaturkontroll og sette temperaturen til 37 ° C. Slå på omrøring på 1000 rpm og gjøre / pH overvåke.
- Deretter kjøre media lading programmet. Flytende behandlingen av automatiserte microbioreactor systemet vil påføre mediet fra media platen som kultur fartøyene som kartlagt i programmet. Media lagt er OptiCHO med varierende prosessforhold.
Merk: To brønner fra en 24-vel plate er pålagt å fylle en kultur fartøyet kapasitet (13 mL), som hver brønn rommer bare 8 mL av media. Bruk 7-8 mL i hver brønn for å hindre tegning luft når media blir blandet av flytende behandling før lading. - Når media ladestasjonen er gjort, legges 35 µL av Ex-cellers antifoam fra skumdemper platen til kultur fartøyet. Tillat 30 minutter for kultur medium skal blandes godt og optisk gjør / pH sensorer for å være hydrert.
Merk: Den samme mengden antifoam legges midlertidig gjennom kultur tid når skummende oppdages. 6 Foaming oppdages visuelt og reaktor fartøy kontrolleres hver dag for skummende. Antifoam legges umiddelbart etter oppdagelsen. - DO / pH kontroll er slått på å starte overvåking og gjøre og pH av kultur medium. Kan gjøre nå sett poenget med 50%, som tar minst 2 timer.
- Etter gjør balanse, slå på bakgrunnen base sammentellingene å oppnå et pH settpunkt 7.1 for alle kultur fartøy. Kan gjøre og pH equilibrate over natten og være helt hydrert.
- Midlertidig stanset pH - dag 1 pH forskyvning
- Neste dag (merket som dag 1), kjøre det stoppede pH trinnet der Velg kultur fartøy analyseres og en pH korreksjon forskyvning bestemmes.
Merk: PH fartøy som skal avsøkes for motregning pH er brukeren bestemmes. Et eksempel fra hver reaktor fartøy kan ikke være nødvendig hvis du har en god representasjon av befolkningen bioreactor. - Plass prøven tube holderen på utpekte dekk og laste mikro sentrifuge rør med caps åpne og gjemt ved siden av seg. Flytende behandleren vil påføre 600 µL celle kultur væske inn i røret som kartlagt i programmet.
-
Umiddelbart fjerne prøven og måle pH på en nærings bioanalyzer som er kalibrert riktig og som QCs har blitt kjørt (se nedenfor, "Daglig næringsstoffer og metabolitten analyse").
Merk: Prøvene kjøres, umiddelbart etter tegning, for å unngå pH endringer skyldes eksponering til luft som avgassing av CO2 fra prøven kan føre pH endringer. - Trykk "Fortsett" etter hver prøve, ellers det neste trinnet ikke kjøres.
- Angi eksterne, FLEX-avledet pH-verdier i programvaren, "kompilere" forskyvningene for samplet fartøyene automatisk. Manuelt gjennomsnittlig forskyvningene innhentet for eksempel fartøyene og angi brukeren pH offset kolonnen under kategorien "Fartøyet Data". Gjennomsnittlig forskyvningen vil deretter brukes på alle fartøyene. Tillate pH til equilibrate i minst 2-3 timer, hvoretter kultur fartøyene kan være inokulert.
- Neste dag (merket som dag 1), kjøre det stoppede pH trinnet der Velg kultur fartøy analyseres og en pH korreksjon forskyvning bestemmes.
- Vaksinering
- Etter måling VCD, overføre hele innholdet av spinner-flask(s) i et sterilt, 250 mL konisk sentrifuge rør og pellets celler av sentrifugering i 10 min 140 x g ved romtemperatur. Dekanter gamle media og re avbryte nok frisk media slik at den endelige tettheten bør være 1 x 106 celler/mL etter å legge til inoculum til kultur fartøyet.
- Legge til suspendert cellene i den angitte godt av en steril lidded 24-vel plate. Tilsett 3 mL inoculum hver brønn, hvorav 2 mL fjernes som inoculum for hver kultur fartøy.
- Sted inoculum plate utpekte dekk i panseret. Pass på å spray utsiden av lidded inoculum plate med 70% alkohol før plassere den i panseret.
- Cellen telle ved hjelp av automatisert celle Counter
- Etter vaksinasjon, la kultur fartøyene equilibrate i minst en time. Etter en time, utføre 5 X celle antall trinn i programmet. 5 X angir fortynningsfaktoren lese celletall.
Merk: 5 X celletall brukes først når cellene er i lag fase. Når cellene når deres eksponentiell fasen brukes 10 X celletall. Basert på eksempelet og fortynningsmiddel volumer instrumentet automatisk står for fortynningsfaktoren og justerer den siste verdien tilsvarende. - Den flytende handler først legger 480 µL av 1 X PBS til celle counter cup etterfulgt av tillegg av 120 µL av celle Kultur væsken fra kultur fartøyet. Celletall leses ved hjelp av automatiserte celle telleren. Dette trinnet gjentas for alle.
- Celletall er det siste trinnet for dag 1 av kultur tiden. Sammen med og pH dataene celletall registreres data (levedyktig celle tetthet og levedyktighet) også daglig av programvaren.
Merk: Rengjør celle counter koppen minst to ganger i løpet av varigheten av kjøringen med 70% IPA å forhindre tilstopping av linjer. Linjer og flyt-cellen fjernes automatisk etter hver celletall.
- Etter vaksinasjon, la kultur fartøyene equilibrate i minst en time. Etter en time, utføre 5 X celle antall trinn i programmet. 5 X angir fortynningsfaktoren lese celletall.
- Midlertidig stanset pH - dag 2 pH forskyvning
- På dag 2 av kultur, gjenta "Stoppet pH" trinnet bruker kultur fartøyer enn de som ble valgt ut fra under det første stoppede pH steget.
Merk: Prøvetaking mer av fartøyet befolkningen i stoppet pH vil gi en bedre forskyvning for pH korreksjon. Derfor ikke smake de samme fartøyene som brukes til midlertidig stanset pH fra forrige dag.
- På dag 2 av kultur, gjenta "Stoppet pH" trinnet bruker kultur fartøyer enn de som ble valgt ut fra under det første stoppede pH steget.
- Daglig næringsstoffer og metabolitten analyse
- Vil bli tatt for næringsstoffer analyse fra dag 2 av kultur til slutten av eksperimentet og analysert ved hjelp av nærings bioanalyzer.
- Plass prøven tube holderen på utpekte dekk og laste mikro sentrifuge rør med caps åpne og gjemt ved siden av seg. Flytende behandleren vil påføre celle kultur væske inn i røret som kartlagt i programmet.
Merk: For første er dagene (dager 2-4) mengden prøve tatt fra kultur fartøyet 300 µL. Dette er fortynnet med 300 µL av 1 X PBS utlevert av flytende behandling. Dette gjøres for å bevare kultur volumet og hindre at nivået synker under 10 mL. I tillegg innenfor næringsstoffer verdier for de første dagene rekkevidde av apparatet etter fortynning. - Sett prøvene i analyzer skuffen å utføre næringsstoffer analysen.
Merk: Fryse alle prøver som ikke vil bli analysert på samme dag.
- Systemavslutning
- For å avslutte kjøringen, må du først deaktivere temperaturkontroll etterfulgt av agitasjonen. Andre, stoppe gjør / pH kontroll og bakgrunn base filer. Tredje Stopp alle andre kontroller. Endelig stoppe system monitor.
- Skru utover og rør plater og fjerne kultur fartøy. Rengjør innsiden av kultur stasjonen med en lofri tørke. Sted tørking platene på kultur stasjon og skru dem i.
Merk: Tørking syklus kreves for avkjølt versjon av systemet og kreves ikke for standard-versjonen av systemet. - Kjøre 2 timers tørking syklusen på programmet. Ren etterfulgt klemme platene med ultrapure vann av 70% isopropylalkohol (IPA) fjerne mulig kondensert flytende linjene. Skyll med luft for å fjerne gjenværende væske.
- Klikk på "Stop" i bioreactor programvaren når tørking syklusen er fullført.
3. celle kultur Harvest
- Overføre celle Kultur væsken fra reaktor fartøy og pellets celler 1,962 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Dekanter nedbryting. Bruker et 0.22 µm PVDF filter sterilt filter decanted celle Kultur væsken.
- Aliquot 1 mL steril celle Kultur væsken i 1,5 mL Eppendorf rør for titer analyse. Lagre 1 mL rør på 20 ° C. Rense resten av høstet celle Kultur væsken bruker rask protein flytende kromatografi system. 6
4. måle IgG Titers
Merk: Dette er en overfladisk oversikt over kjører og analysere prøver ved proteinA biosensor systemet. Alle analysen parametere ( f.eks temperatur, Les tid, rpm, etc. ) må avgjøres empirisk for hver eksempel.
- Slå på systemet og tillate å varme opp for minst 1 h. Fjern prøver fra fryseren tine og equilibrate til romtemperatur.
- Systemprogramvaren, satt platen temperaturen til 26 ° C. Pre suge antall Protein A tips skal brukes i prøven matrix (f.eks cellen media) for minst 30 minutter.
Merk: Den optimale temperaturen må bestemmes empirisk. En temperatur på 26 ° C brukes her til å minimere eksempel fordampning lengre analyse tider og at maskinen skal holder en jevn temperatur (ved å være flere grader over omgivelsestemperaturen). Prøver må være pre equilibrated til valgte analysen temperatur før måling av rugende eksempel platen på utvalg scenen for ≥ 10 minutter. - Bygge en protein standardkurve bruker samme antistoffer konsentrert til 10 mg/mL og serielt fortynne i prøven matrix (dvs. media) i området som skal registreres.
Merk: Det er viktig å få en høy konsentrasjon av antistoff å minimere matrix virkninger som følge av fortynning, men det er også viktig å ikke over konsentrere antistoffer og indusere aggregering. Kjører en i-plate standardkurven for hver eksempel plate er å foretrekke. En positiv kontroll må minimal, brukes kontoen for tips til tips og plate-til-plate variasjon. En ny standardkurve må genereres for hver nye mye protein en tips brukes. - Design prøven platen (for eksempel se figur 2). I et protein A kan analysen som bruker gjenfødelse, opptil 80 prøver analyseres, og som inkluderer ukjent kultur prøver, standarder og kontroller. For hver plate analysert, vil et enkelt protein A tips bli brukt til å måle opp til 10 prøver over platen (kolonner 1-10), med en fornyelse syklus mellom hvert utvalg.
Merk: Det anbefales at hele første rad i platen (linje A) brukes som negativ kontroll og referanse. I analysen diskutert her, brukes rader B og C for to positiv kontroller; en lavere og en på den øvre grensen av lineær respons. Dette sikrer hver tipse måler negative og positive kontroller før analysere prøver. Dette oppsettet også forenkler referanse subtraksjon i analyseprogramvare. Gjenværende brønnene brukes deretter for ukjent prøver. Hvis det er et eksempel hull i en av radene, det må være en matrise i det godt for å hindre tørking tips (i.e. brønner A2 gjennom G2 har prøve mens H2 ikke. Sikre H2 inneholder eksempel matrise for å sikre at tips ikke tørke før du fortsetter å prøve H3). Til slutt, ikke eksos tips med ett sett for å analysere flere plater. Bruker en ny, anbefales ikke-regenerert sett for hver plate. - Forberede prøver analyse av forsiktig blanding, enten ved inversjon eller pipettering, etterfulgt av en puls spin å samle prøven på bunnen av røret. For konsentrert prøver, opprette riktige fortynning gjentak fortynne i prøven matrise.
Merk: Lineær rekke bindingen for et antistoff for protein en bio-lags interferometry (BLI) målinger varierer både antistoff, analysen forhold og matrise. Dette bør fastsettes empirisk på forhånd for å sikre riktig utvalg fortynninger brukes. - Forberede 96-brønns eksempel platene så nær analysen tid som mulig. Sikrer det ikke finnes noen luftbobler i noen av brønnene. Fjerne luftbobler med ren pipette tips eller sentrifugering.
- Laste inn platen i systemet og Kjør analysen ved hjelp av standard "Høy følsomhet analysen med gjenfødelse" i datainnsamling programvaren. Analysere med HT dataanalyse programvare.
Merk: Hvis platene skal være forberedt på forhånd på grunn av begrensninger, sel sikkert med film å hindre fordampning. Avhengig av forventet titers må oppkjøp priser og ganger justeres. Se i håndboken for veiledning. - Ved hjelp av dataanalyse programvare, referanse trekker og Beregn konsentrasjonen av ukjent prøvene med standardkurve og funksjonen første skråningen (IS) i en lineær point-to-point passer.
Representative Results
Overvåking kritisk prosess parametere og uteffekt celle kultur gjennom cellekulturer operasjon er en viktig del i bioprocessing. Cellen counter og næringsstoffer analyzer ble brukt å kvantifisere fem attributtene som karakteriserer cellevekst, næringsstoffet forbruk og biprodukt formasjon. Celletall ble innhentet daglig for alle kultur-forhold. Den gjennomsnittlige levedyktig celle tettheter og viabilities er som vist i Figur 3 sammen med ±1 SD intervallet. Næringsstoffer og biprodukt profilene vises også med ±1 SD intervallet stasjonære fasen av kulturer. Skråningen av denne profilen representerer gjennomsnittlig glukose og glutamin forbruk og laktat produksjon, priser. Samlet sett viser disse resultatene muligheten for overvåking disse attributtene i microbioreactor systemet; og evnen til å microbioreactor systemet å opprettholde disse parametrene innen et tett område.
Totalt produktiviteten til cellekulturer ble kvantifisert bruker proteinA biosensor system etter høstet celle kultur media var gått gjennom et 0.22 mikron PVDF filter. Bestemt produktiviteten per celle varierte fra 0.87 pg/celle-d til 1,15 pg/celle-d som vist i Figur 4. Basert på disse resultatene en rekke forhold kan undersøkes for å velge media komposisjon og fôring strategier som maksimerer mengden av protein produsert for en minimal investering i eksperimentell prosedyrer.
Figur 1 : Oppsettet av microbioreactor system med 4 kultur stasjoner (CS) har 12 reaktor fartøy hver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Eksempel eksempel plate oppsett for en grunnleggende kvantifisering med gjenfødelse eksperiment på proteinA biosensor systemet. rad 1 (rød "R") er reservert for referanse prøven (i.e. matrix fraværende analytt); rad 2 (aquamarine) er et sett med standarder (konsentrasjoner er i µg/mL); linje 3 og 4 (oransje) er sett med lav og høy positiv kontroller ("PL" og "PH", henholdsvis); rader 5 til 10 (lilla) inneholder ukjent prøver; rad 11 og 12 (grå) er programmet er standard posisjoner for gjenfødelse ("R") og nøytralisering ("N") buffere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : en) gjennomsnittlig levedyktig celle tetthet og levedyktighet profiler over en alder av en satsvis jobb. ± 1 SD vises også angi tett kontroll av cellevekst i microbioreactor systemer. b) gjennomsnittlig næringsstoffer profil for glukose og glutamin samt gjennomsnittlig biprodukt profilen for laktat. ± 1 SD vises også angi stram kontroll over media komposisjon i microbioreactor systemer. (N = 3, alle forhold var kjøre tre eksemplarer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant for-handlingen i gjennomsnittlig bestemt produktiviteten til ulike medier forhold. (N = 3, alle forhold var kjøre tre eksemplarer) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Kjører automatiserte mikro bioreactor systemet riktig og innebærer effektivt betimelig kjøring av flere automatiserte trinn. En av de viktigste delene av kjører systemet er programmering programvare. Hvis det er noen feil mens du skriver programmet, vil det være alvorlige feil i forsøket som kan resultere i uventede endringer i prosessen, fôring strategi, prøvetaking strategi eller endelige produktkvalitet som kan ugyldiggjøre resultatene av studien. En annen viktig del av kjører systemet er å plassere og stramme klemmen platen riktig for å sikre riktig gjøre kontroll. Den vanligste indikasjonen at klemme plate har blitt strammet ujevnt er uventet variasjoner i gjøre målinger for fartøy 1, 6, 7 og 12 (hjørne reaktor fartøy). Samlet angir gjør ustabilitet en løsner pakninger på gass innløp linjene i klemme platene. Dette scenariet kan hindre nå gjøre sett punktet. En annen vanlig fallgruve å unngå når du starter et eksperiment er å la cellene sitte lenge under inokulasjon skritt, forårsaker dem til å avgjøre. Jo mindre tid cellene bruke sittende, skader jo mindre sjanse er det at gradvis lavere inoculum celletall legges kronologisk til reaktor fartøy som kan indusere betydelig skjevhet som uforvarende studere resultatene. Det er bedre å vaksinere i flere stadier, vaksinere dvs hver kultur stasjon etter hverandre med pause trinnene i mellom så cellene ikke sitter i inoculation platen i lengre enn 15 minutter.
Daglig bruk, opprettholde sterilitet er avgjørende. Selv om systemet er i en biologisk sikkerhet regjering, er sterilitet ikke garantert på grunn av hyppige bevegelser av panseret. Følgelig må alt som går i panseret sprayes med 70% IPA. Dernest er det viktig å sikre at minimal skummende skjer under kultur; mediet kan tette gassing og eksos linjene, fører til skade av klemme plate og selv kjernekomponentene nedenfor. Forebyggende anti-skum tillegg trinnene er avgjørende i alle mikro bioreactor programdesign. I tilfelle en "skum ut" det ville være fordelaktig å følge produsentene rengjøring protokollen og kan hindre permanent skade av klemme plater. Alternativt, bruk av ikke-sparged kan være gunstig for lavere celle tettheter eller når du kjører i batch-modus som høyere overflaten volumkontrollen kan effektiv oksygen selv med mangel på en sparger. Men, ikke-sparged fartøy kan ikke være nyttig for høy tetthet eller perfusjon cellekulturer hodet plassen er nok til å holde tritt med kulturer økende forbruk av oksygen.
Det er mange fordeler som tilbys av det microbioreactor systemet, som gjør at flere kontrollert kulturer kjøres parallelt på en liten skala med mer kontroll enn riste flasker. 17 derfor systemet muliggjør kjøring av screening studier, har, høy gjennomstrømning klone studier og transfection studier. Automatisert flytende behandling reduserer også analytiker-til-analytiker variasjon samtidig samtidig minimere kjedelig og tidkrevende arbeid for opplært personale. Mens det er flere fordeler med å systemet, er det flere viktige ulemper som bør vurderes. Først et kultur-volum på 15 mL grenser betydelig pågår prøvetaking og endelige harvest materiale, og flere alternative småskala bioreactors (opptil 500 mL) har nylig blitt tilgjengelig. Ett nytt fremskritt i systemet er integrering av den automatiske Mikroskala bioreactor med BioProfile FLEX 2 analyzer fra Nova biomedisinske, noe som begrenser i prosessen-prøvetaking problemet ved å redusere utvalget volumet for celle tetthet og næringsinnhold analyse . Fordeler kan inkludere hurtigoppsett og nesten ingen rengjøring fører til operative sparing, men kostnaden for disponible enheter bør vurderes for lang sikt prosjekter som det kan være dyrere å kjøpe enheter enn gjenbrukbare konvensjonelle systemer.
Metoden diskutert i denne artikkelen er hovedsakelig egnet for satsvis modus cellekultur, men kan endres avhengig av behovene til brukeren. Hver kultur stasjon har uavhengig kontroll av temperatur, mens gjøre og pH kan endres på nivået av individuelle reaktor fartøy. Sartorius tilbyr også DoE planlegging programvare utviklet spesielt for å tillate eksperimenter å være skreddersydd for mikro bioreactor systemet. Storskala DoE studier med den nye DoE programvaren levert av produsenten kan hjelpe i media og supplere søkemotoroptimalisering. Selv om ikke brukt her, kan microbioreactor systemet også lei-batch studier. Systemet har ennå ikke blitt optimalisert for perfusjon cellekulturer. Imidlertid har det vært begrenset studier og forsøk å etterligne perfusjon celle kultur operasjonen i dagens mikro bioreactor system. 26 denne metoden kan endres for å etterligne høy tetthet perfusjon kulturer celle settling. Varierende høyde som Pipetter settes inn i reaktoren og optimalisere bosetting tid, kan media fjernet og fornyet til speilet overflod modus kultur. Det er nye produkter i dette området som kan fungere bedre enn system presenteres her hvis perfusjon modus kultur.
I sammendraget, denne studien viser bruk av automatiserte mikro-bioreactors og tilhørende analytisk for CHO celle kultur operasjoner å produsere og karakterisere en modell IgG1 monoklonalt antistoff. Det understreker småskala mikro-bioreactors rollespill i bioprocess produksjon og deres innvirkning på celle kultur utvikling og media screening. Mens det er mange fordeler med å bruke en automatisert småskala system, for å realisere fordelene behandle forståelse og analytisk karakteristikk er viktig. Denne studien gir brukeren en retningslinje for å bruke en automatisert Mikroskala reaktoren system, som kan bli utviklet og forbedret per individuelle behov.
Disclosures
Ansvarsfraskrivelse: Denne publikasjonen gjenspeiler synspunktene til forfatteren og bør ikke tolkes som representerer FDAS synspunkter eller politikken.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Scott Lute for analytisk støtten de ga. Delvis intern finansiering og støtte for dette arbeidet ble levert av CDER kritiske banen programmet (CA #1-13). Dette prosjektet ble støttet delvis av en avtale til Internship/forskning deltakelse programmet på bioteknologi kontorartikler, US Food and Drug Administration, administrert av Oak Ridge Institutt for vitenskap og utdanning gjennom en Interagency avtale mellom US Department of Energy og FDA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
| ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
| ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
| 1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
| 5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
| 24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
| 1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
| Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
| EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
| CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
| 200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
| 100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
| 125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
| 125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
| 250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
| TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| 10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
| BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
| Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
| Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
| Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256, 495-497 (1975).
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Current Opinion in Pharmacology. 12 (5), 615-622 (2012).
- Jakobovits, A. Production of fully human antibodies by transgenic mice. Current Opinion in Biotechnology. 6 (5), 561-566 (1995).
- Maksimenko, O. G., Deykin, A. V., Khodarovich, Y. M., Georgiev, P. G. Use of Transgenic Animals in Biotechnology: Prospects and Problems. Acta Naturae. 5 (1), 33-46 (2013).
- Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W., Yap, M. G. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chemical Engineering Progress. 103 (10), 40 (2007).
- Velugula-Yellela, S. R., et al. Impact of media and antifoam selection on monoclonal antibody production and quality using a high throughput micro-bioreactor system. Biotechnology Progress. , (2017).
- Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127 (22), 2222-2230 (2013).
- Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
- Altamirano, C., Paredes, C., Cairo, J., Godia, F. Improvement of CHO cell culture medium formulation: simultaneous substitution of glucose and glutamine. Biotechnology Progress. 16 (1), 69-75 (2000).
- Selvarasu, S., et al. Combined in silico modeling and metabolomics analysis to characterize fed-batch CHO cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 109 (6), 1415-1429 (2012).
- Seth, G., Ozturk, S., Zhang, C. Cell Culture Bioprocess Engineering. Hu, W. -S. , Wei-Shou Hu. Ch. 4 97-126 (2012).
- McKeehan, W. M. K., Ham, R. The Growth Requirements of Vertebrate Cells In vitro. Ham, R., Waymouth, C., Chapple, P. , Ch. 223 223-243 (1981).
- Jordan, M., et al. Cell culture medium improvement by rigorous shuffling of components using media blending. Cytotechnology. 65 (1), 31-40 (2013).
- Castro, P. M. L., Hayter, P. M., Ison, A. P., Bull, A. T. Application of a statistical design to the optimization of culture medium for recombinant interferon-gamma production by Chinese hamster ovary cells. Applied Microbiology and Biotechnology. 38 (1), 84-90 (1992).
- Liu, C. -H., Chu, I. M., Hwang, S. -M. Factorial designs combined with the steepest ascent method to optimize serum-free media for CHO cells. Enzyme and Microbial Technology. 28 (4-5), 314-321 (2001).
- Parampalli, A., et al. Developement of serum-free media in CHO-DG44 cells using a central composite statistical design. Cytotechnology. 54 (1), 57-68 (2007).
- Hsu, W. -T., Aulakh, R. P., Traul, D. L., Yuk, I. H. Advanced microscale bioreactor system: a representative scale-down model for bench-top bioreactors. Cytotechnology. 64 (6), 667-678 (2012).
- Janakiraman, V., Kwiatkowski, C., Kshirsagar, R., Ryll, T., Huang, Y. -M. Application of high-throughput mini-bioreactor system for systematic scale-down modeling, process characterization, and control strategy development. Biotechnology Progress. 31 (6), 1623-1632 (2015).
- Kim, B. J., Diao, J., Shuler, M. L. Mini-scale bioprocessing systems for highly parallel animal cell cultures. Biotechnology Progress. 28 (3), 595-607 (2012).
- Legmann, R., et al. A predictive high-throughput scale-down model of monoclonal antibody production in CHO cells. Biotechnology and Bioengineering. 104 (6), 1107-1120 (2009).
- Schäpper, D., Alam, M. N. H. Z., Szita, N., Lantz, A. E., Gernaey, K. V. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
- Hegab, H. M., ElMekawy, A., Stakenborg, T. Review of microfluidic microbioreactor technology for high-throughput submerged microbiological cultivation. Biomicrofluidics. 7 (2), 021502 (2013).
- Rameez, S., Mostafa, S. S., Miller, C., Shukla, A. A. High-throughput miniaturized bioreactors for cell culture process development: Reproducibility, scalability, and control. Biotechnology Progress. 30 (3), 718-727 (2014).
- Xu, P., et al. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnology Progress. 33 (2), 478-489 (2017).
- Delouvroy, F., et al. Evaluation of the advanced micro-scale bioreactor (ambr™) as a highthroughput tool for cell culture process development. BMC Proceedings. 7 (6), 1-3 (2013).
- Kelly, W., et al. Optimizing performance of semi-continuous cell culture in an ambr15 microbioreactor using dynamic flux balance modeling. Biotechnology Progress. , (2017).
