Summary
16S rRNA 配列ベクトル内で微生物の同定と解析を可能にするための次世代シーケンス プロトコルをご紹介します。このメソッドには、DNA 抽出、増幅し、pcr 法によって、フローセルとバイオインフォマティクスをシーケンス処理シーケンス データを系統情報に合わせてサンプルのバーコードが含まれます。
Abstract
最近十年間に媒介性疾患が再登場し、驚くべき速度、かなり罹患率と死亡率の世界の原因で展開します。効果的な広く利用可能なワクチンは、小説病軽減戦略の開発を必要とこれらの疾患の大部分の欠けています。この目的のためには、疾病の有望な道は、ベクトル マイクロバイ、ベクターに棲息する微生物のコミュニティを対象とする場合します。ベクトル マイクロバイ病原体ダイナミクスにおける極めて重要な役割を果たしているし、マイクロバイの操作は、ベクトル耐えられた病気の一握りの減らされたベクトルの豊富なまたは病原体伝送につながっています。ただし、病気、制御アプリケーションにこれらの調査結果を翻訳ベクトル微生物生態学、この分野で十分な技術によって歴史的に制限の徹底理解が必要です。次世代シーケンス アプローチの出現は、多様な微生物の迅速、高並列シーケンスを可能にしました。非常に節約される 16S rRNA 遺伝子をターゲットと変化する生態学的、実験条件の下でベクトル内に存在する細菌の特性を促進しています。この技法が PCR のシーケンス、フローセルに読み込みサンプルによってサンプル バーコード 16S rRNA 遺伝子の増幅とバイオインフォマティクスの系統情報を持つシーケンス データを一致するようにアプローチします。種または複製の高数の属レベルでの識別はこのアプローチにより、検出、解決、および伝統的な培養、顕微鏡、または組織学的染色からの出力の課題を回避通常達成することができます。テクニック。したがって、このメソッドはベクトル微生物多様な条件下での特性評価に最適ですが、現在微生物機能、ベクトル、または抗生物質による治療への応答内の場所に関する情報を提供できません。全体的にみて、16 次世代シーケンサーは、アイデンティティとベクトル病気ダイナミクスにおける微生物の役割を理解強力な手法です。
Introduction
復活と最近十年間に媒介性疾患の広がり世界的な人間と野生動物の健康に深刻な脅威をもたらします。効果的なワクチンは、これらの疾患の大部分の欠けているし、コントロールの努力はベクトルとベクトル ホスト相互作用の複雑な生物学的性質によって妨げられます。これらの課題を回避する新しい戦略の開発のため病原体の感染でベクター内微生物相互作用の役割を理解することができます。特に、ベクター関連微生物共生生物と共生、マイクロバイと呼ばれる病原体の相互作用は、病原体の感染に重要な結果があります。圧倒的な証拠を今、ベクトル マイクロバイ オームおよびライム病1,2,3ジカ、マラリアなどの病気のための能力の間のリンクを示す例とこのアサーションをサポートします。ただし、疾病管理のための戦略にこれらの調査結果を翻訳構造、関数、およびベクター内細菌叢解析の起源のはるかに詳細な理解が必要です。変化する生態学的なおよび実験条件下でのベクトルの微生物コミュニティの同定と解析進むこの分野で重要なパスを構成します。
病原体のベクトルの微生物の居住者を識別するためのプロシージャは、西黒脚ダニセイブクロアシマダニライム病ライム病病原体の媒介種を利用してここで提供されます。ダニは、他の節足動物以上の人間の病原体の種類港中、比較的ティック内細菌叢解析4の生物学およびコミュニティの生態について少し知られています。ダニがウイルス、細菌、菌類、原生動物によって、共生、一過性微生物住民5,4などの多様な配列を抱くことは明らかです。前の仕事は、地理、種、セックス、ライフ ステージ、吸血ソース6,7、8に関連付けられているマダニ内細菌叢解析に強い変化を実証しています。しかし、この変化の基になるメカニズムは不明のまま、起源の調査とこれらの微生物コミュニティのアセンブリの詳細を保証します。ダニは垂直感染微生物を得ることができるホスト、気門、口、アナル孔9を通じて環境から吸収と接触。初期形成とティック マイクロバイの開発の形成要因を理解するには、相対的な上下環境伝送、具体的には目盛りの変化、自然なパターンを理解するために重要ですマイクロバイの多様性と疾患またはベクター コントロールに適用できるの病原体感染中のこれらのコミュニティの対話方法。
次世代シーケンスなどの強力な分子技術は今微生物を識別するため存在し、多様な環境や実験条件の下でベクトル内細菌叢解析を特徴づけるために用いることができます。これらの高スループット シーケンスのアプローチの出現で、前に微生物の同定は顕微鏡と文化主に依存。顕微鏡検査は迅速かつ簡単な方法が、微生物を識別するための形態学的方法は本質的に主観的な粗と低感度と検出10によって限られました。文化ベースのメソッドは微生物同定のため広く使用されて、薬物治療11微生物の感受性を決定するため使用することができます。ただし、このメソッドも、感度が低いと苦しんで環境微生物の 2% 未満を設定12研究室で培養できることが推定されています。組織の染色方法は、検出し、ベクトル内の特定微生物をローカライズ、ダニの内様々 な分類群の分布の調査を有効にして微生物の相互作用についての仮説を研究に採用されています。ただし、微生物のアイデンティティの知識はこのアプローチを作る微生物の特性と同定適して適切な汚れを選択するため必要です。さらに、組織染色は非常に時間がかかり、骨の折れるプロセスであり大規模なサンプル サイズにも対応していません。シーケンスは、感度と多様な微生物の検出に限られている同様にサンガーなど従来の分子アプローチ。
次世代シーケンサーは、サンプル数が多いから微生物の迅速同定のためことができます。標準的なマーカー遺伝子のデータベースをさらに有効に参照の存在は、属や種のレベルに多くの分類学的解像度を増強しました。リボソームの小サブユニット Rna は、16 s rRNA の遺伝子領域を節約され、変数の存在のために最も一般的である各細菌のユニークな産物と普遍的なプライマーを作成すると、この目標を達成するためによく使用されます。種13,14。このレポートは 16S rRNA 次世代シーケンスをティック マイクロバイのイチイを識別するための手順を詳しく説明します。特に、このプロトコルは、シークエンシングのためのサンプルを準備するための手順を強調します。もっと一般化順序の詳細については、バイオインフォマティクスの手順提供されており、現在利用可能なさまざまなシーケンスのプラットフォームおよび解析プログラムがあるのでそれぞれ豊富な既存ドキュメント。この次世代シーケンサー アプローチの全体的な可能性が主病のベクター内の微生物群集構造アセンブリの調査に適用することによって実証します。
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Protocol
1. マダニ コレクションと表面殺菌
- ダニ ダニ削除ティック関連する生息地の上 1 m2白い布をドラッグしてホスト種に添付またはラボ15,16刻み飼育収集。微細鉗子を使用してダニを操作し、-80 ° C で保存
- 個々 の PCR チューブにダニを置き、15 のボルテックスによって表面の汚染物質を除去を過酸化水素 (H2O2)、70% エタノール、ddH2O を 500 μ l 連続 s
- 新しい PCR チューブにダニを置き、空気乾燥させます。
- このチューブの機械的に乳鉢と乳棒 (本研究で使用される)、ビーズ ビーターの小さなビーズを使用してダニを粉砕してティック組織を中断またはメスと離れて目盛りを切断します。
2. DNA 精製
- 市販 DNA 抽出キットで提供される指示に従って個々 のタイマー刻みから DNA を浄化します。100 μ L の最終巻を溶出します。
注: は、2.2 2.8 の手順の概要については図 1を参照してください。キレート材料20,21抽出やエタノール沈殿物19フェノール-クロロホルム抽出17,18代替抽出方法があります。 - 蛍光光度計や分光光度計を使用して成功の DNA の浄化を確認します。蛍光分析、190 μ L 二本鎖 DNA 分析の DNA のテンプレートの 10 μ L を使用します。予想収量は 0.1 〜 1.0 ng/μ L22。吸光光度法、核酸定量で 1 μ L の DNA のテンプレートを使用します。予想される A260/280 の比率は約 1.823です。
- 増幅にすぐに進むは、-20 ° C で試料を保存されていない場合
3. 16S rRNA 遺伝子増幅
- 27.5 μ L 反応含むで PCR 増幅を設定: 1 μ m; 各プライマーの 5 μ L市販の 12.5 μ L PCR ミックス;5 ng/μ L の濃度で各タイマー刻みから抽出した DNA の 5 μ L。
注: は 16S rRNA 遺伝子13の超可変 V3 V4 領域の拡大のため次のプライマーを使用します。
5 ' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3'
5 ' - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3' - たちのためにプログラムにチューブを移動: 3 分; 95 ° C で初期変性25 サイクル 1) 95 ° C の 30 s、2) 57 ° C、30 秒、3) 72 ° C、30 s;5 分; 72 ° C で最終的な拡張10 ° C で最終開催
- PCR が終わったら、4-6 μ L/1.5% の agarose のゲルにサンプルをロードすることによって PCR の製品を視覚化します。460 でバンドを探す bp の増幅を確認します。
注: 増幅 PCR の製品が表示されない、ゲルのサンプル濃度が低すぎる場合 (< 10 ng)。プライマー二量体の存在は、低濃度のサンプルで共通です。他の非ターゲットのバンドが存在する場合、アニーリング温度を調整またはサイクルの数を減らします。 - 浄化にすぐに進むが 4 ° C で試料を保存されていない場合
4. 16S 私アンプリコン浄化
- 新しい PCR チューブを使用すると、各サンプルの ddH2O 60 μ L の合計を取得すると PCR の製品を組み合わせます。低濃度の DNA サンプルは、増幅バイアスを軽減し、集中するサンプルをプールに 3 通で PCR 増幅を実行します。
- それらを使用する前によく部屋の温度と渦に常磁性ビーズをもたらします。
- 60 μ L のサンプルを常磁性ビーズの 48 μ L を追加し、5 分管磁気ラック ソリューションになるまで 5 分とオフの場所間インキュベートします。上澄みを除去します。
注: このビーズ濃度対象プライマー二量体 (< 60 bp) の除去です。必要な場合は、他の非固有のバンドを削除するビーズ濃度を調整します。 - 磁気ラックにチューブ、出来立ての 80% の 500 μ L を追加江藤。全ての試験管にエタノールを追加した直後に、液体をピペットします。ビーズを削除しないでください。エタノール付加と除去 1 つのより多くの時間を繰り返します。
- 磁気ラック 5 分または小さいひびがビーズで表示されるまでにチューブを開いたままで余分なエタノールを削除するサンプルを風乾します。
- TE バッファーの 20 μ L を追加し、5-10 分の室温で磁石をサンプルをインキュベートします。
- 背面磁石チューブを配置します。一度ビーズと液体を分離、洗浄の PCR の製品を取得する新鮮なチューブに上清を転送します。
- (省略可能)4-6 μ L/1.5% のゲルにサンプルをロードすることによって成功した私アンプリコン浄化を確認する製品を視覚化します。460 bp のバンドは見えるべきであるおよびプライマー二量体はないはず。
- PCR のインデックスにすぐに進んでいない場合のサンプルを格納 4 ° C
5. サンプルのバーコードと浄化
- 前方または逆プライマーまたは市販ライブラリ インデックス キットから、両方を選択して、各サンプルに特異的プライマーの組み合わせを割り当てます。
注: シーケンスの後の微分をラベル見本を一意にできます。キットは通常 96 384 サンプルをシーケンス処理するのに十分なプライマーを提供します。 - デュアル プライマーまたはインデックスを各プライマー (N7xx と S5xx)、12.5 μ L の市販 PCR マスター ミックス、ddH2O、5 μ L、掃除私アンプリコン製品の 2.5 μ L の 2.5 μ L を含む 25 μ L 反応で PCR を行うことでサンプルに添付します。
- たちのためにプログラムにチューブを移動: 3 分; 95 ° C で初期変性8-14 サイクル 1) 95 ° C の 30 s、2) 55 ° C、30 s、30 ° C、3) 72 s;5 分; 72 ° C で最終的な拡張10 ° C で最終開催
- PCR が終わったら、4-6 μ L/1.5% の agarose のゲルにサンプルをロードすることによって PCR の製品を視覚化します。550 でバンドを探す bp の増幅を確認します。
注: インデックス PCR の循環状態を通知するための可視化結果を使用します。非特異的結合を緩和したり、サンプルごとに目に見えるバンドを取得するサイクル数を増やすサイクル数を下げます。 - 手順 4 に記載されている、クリーンアップ手順を繰り返します。クリーンアップ中に希釈を避けるためには、重複してインデックスの PCR を実行し、プールをここの製品。
- いない場合はライブラリの定量化と正規化にすぐに進むの 4 ° C でサンプルを格納
6. ライブラリの定量化と正規化
- ステップ 5.5 蛍光光度計や分光光度計を使用して各精製、バーコード製品の濃度を推定 (手順 2.2 参照)。約 13 の濃度を得るために TE バッファーでサンプルを希釈します。
注: ライブラリ定量化試料シーケンス プラットフォームの推奨濃度を達成するために必要です。ライブラリの定量化、qPCR、によって達成されるが、qPCR 前サンプル濃度試薬と時間の節約します。13 濃度を定量キット24qPCR 基準の濃度の平均値は、このライブラリ定量の精度を最大限に推奨します。 - QPCR マスター ミックス (ライブラリ定量キット) から、ddH2O、2.0 μ L、サンプルまたは標準の 2.0 μ L の 6.0 μ L を含む 10 μ L 反応の qPCR を実行します。各サンプルと標準より高い精度と精度の 3 通を実行します。3 つ以上の希釈レベルで各サンプルを実行 (e.g。、12:01、1 pm、および推定開始濃度 22) 定量の正確さを確保するため。
注: 指定されたプライマーと基準の詳細については、使用数量キットによって異なります、製品テクニカル データ シートで利用できます。本研究で用いた定量キットの材料表を参照してください。 - QPCR プレートまたはチューブのプログラム リアルタイム PCR 機器に移動: 95 ° C、5 分; の初期変性35 サイクル 1) 95 ° C の 30 s の 45 ° C、2) 60 s;解離ステップ 1) 95 ° C、15 s、2) 60 ° C、30 s、および 3) 95 ° C、15 s。
- QPCR の結果から得られた定量値と使用サンプルの希釈レベルを使用して、各サンプルの濃度を始めて平均を計算します。
注: たとえば、サンプル希釈 1: 100,000 の 14 の平均濃度が得られます 200 の元の開始濃度 nM。定量化結果が正確にできない場合があります標準曲線の範囲内である特定のサンプルの希釈レベルのいずれもしないする場合その場合は、希釈を調整し、再 qPCR を実行します。 - 4 各精製、バーコード サンプルを希釈ステップ 7.5 で計算された平均濃度を用いた TE バッファーで nM。
注: たとえば、平均サンプル濃度 200 nM、希薄、サンプル 1:50 で TE バッファー 4 nM 濃度を達成するために。正確なサンプル濃度は使用されるシーケンス システムと試薬キットによって異なります。推奨濃度のシーケンス システムのユーザー ガイドを参照してください。 - 単管に等しいボリューム (通常 5-10 μ L) を追加することによってすべての個々 のライブラリの結合されたライブラリを作成します。
注: すべてのサンプルは 4 nM 濃度にする必要があります等しいボリュームの追加プールされたライブラリのすべてのサンプルの等しい濃度を実現しています。 - 6.2 6.4 4 nM 濃度を確認するため結合されたライブラリの手順を繰り返します。
- 結合されたライブラリの濃度を計算して希釈または再 4 を達成するために必要に応じて Tris バッファーを使用して、プールに最終的なライブラリを構成する nM。
- サンプル ロードにすぐに進むは、-20 ° C で試料を保存されていない場合損失や貯蔵中の DNA 濃度への変更を最小限に抑えるための定量化の直後に実行シーケンスを実行します。
7. ライブラリ変性および希釈、およびシーケンスを実行 (同じ日に実行)
- 4 ステップ 6.9 naoh から nM 結合されたライブラリを変化させなさい。
メモ: 最後のライブラリの準備手順は、シーケンス システムごとに異なります。詳細かつ最新のプロトコル シーケンス システムのユーザーズ ガイドを参照してください。新しいユーザーは、シーケンス処理プラットフォームの使用に関するトレーニングを受ける必要があります。 またはコア シーケンス処理施設を自分たちのライブラリを送信可能性があります。 - シーケンス試薬キット (材料表) で指定されたバッファーを使用して必要な読み込み濃度変性ライブラリを希釈します。
注: 最適な読み込み濃度はシーケンス システムと通常 1 250 午後25からの範囲によって異なります。 - 変性し、シーケンス制御を希釈します。
注: はシーケンス制御を追加する低多様性ライブラリから生じるシーケンス処理の問題を修正します。NaOH を使用してシーケンス制御を変化させなさいし、ライブラリと同じ濃度に希釈します。 - ライブラリとシーケンス制御を組み合わせます。
注: ライブラリの多様性とシーケンス システムを使用すると、結合されたライブラリに、シーケンス制御の比率によって異なりますが、それは通常の 1:1 の26。 - 結合されたライブラリを読み込み、シーケンス フロー セルにシーケンス制御混合します。
8. 私アンプリコン シーケンス解析
- 使用シーケンス システムに対応するクラウド コンピューティング環境で実行の指標を調べることによって実行の全体的な成功を評価します。
注: 配列読み取りの数など、実行のメトリックは使用されるプラットフォームと試薬キットをシーケンスに基づいて異なります。一般的なシーケンス システムの目標値は、表 1に表示されます。 - 生シーケンス データをダウンロードし、必要なバイオインフォマティクスのオープン ソース ソフトウェア、微生物生態学 (QIIME)27または Mothur28に量的な洞察力。
注: 両方 QIIME と Mothur、オープン ソースと無料でダウンロードします。これらのプログラムを使用しての詳細についてはオンライン見つけることができ、初めてユーザーの詳細が十分に。以下の手順は、QIIME で実施したバイオインフォマティクス パイプラインの広範な概要を提供します。Python に精通している必要はありませんが、以下のスクリプトの実装を容易にします。 - 作成し、QIIME の"validate_mapping_file.py"のスクリプトを使用してマッピング ファイルを検証します。
注意: マッピング ファイルには、サンプル ID、私アンプリコンのプライマー シーケンス サンプルの説明など、データ分析を実行に必要なすべてのメタデータが含まれています。検証手順は、すべての必要なデータを適切な形式で入力されていることを確認します。 - デマルチプレックスして"split_libraries.py"のスクリプト (図 1) を使用してシーケンスをフィルター処理します。
注: このスクリプトを割り当てるバーコード読み取りインデックス プライマーの組み合わせに基づいてサンプル サンプル Id で入力してマッピング ファイル。また、いくつかの品質が最低限の品質スコア、シーケンスの長さ、および終了トリミング カットのトレードオフをユーザー定義に基づいてエラーのシーケンス制御の手順をフィルタ リングを実行します。 - 運用分類単位 (OTUs) を"pick_open_references_otus.py"のスクリプトを使用してシーケンスに割り当てます。
注: この手順のシーケンス id (通常 97%) のしきい値に基づいて参照シーケンスのコレクションに対してクラスター化されています。参照シーケンスのコレクションと一致しない読み取りは互いに対してクラスター化します。・ デ ・ ノボと終了参照乙ピッキング オプションも用意していますが、QIIME の開発者によって開く参照ピッキングお勧め。 - "Alpha_rarefaction.py"または"normalize_table.py"のスクリプトを使用して乙テーブルを正規化します。
注: この手順を修正列合計の変化かモダンなシーケンス テクノロジーに起因するサンプルあたり合計シーケンスを読み取ります。従来の真空を使用して正規化を実行することができますまたは累積合計スケーリングなどの代替方法。 - いくつかのアルファ多様性、ベータ多様性と"core_diversity_analysis.py"のスクリプトを使用して、一度に分類群組成多様性解析を実行します。
注: また、これらの解析実行できる個々 のスクリプトを使用して個別 (など、"alpha_diversity.py")。
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Representative Results
3 つの独立した卵から 42 タイマー刻みの合計クラッチし、0 と土中では、2 週間の 2 つの環境曝露期間マイクロバイ シーケンスの処理されました。各治療のグループ、1 つのクラッチと露出時間、6-8 目盛りサンプルの複製が含まれていると見なされます。これらの処理されたダニの抽出は次世代シーケンサーに読み込まれ、フィルターを渡す 12,885,713 のペアエンド リードをもたらした。この実行に含まれて抽出の手順で (前のカウントに含まれる) 211,214 読み取りの合計 3 ネガティブ コントロールをいた。さらに各メトリックに対して最適な値と共に実行の品質基準は表 2に詳細な。シーケンスの深さや数 1 サンプルあたりの一意のシーケンスを読み取ります 2,129 読み取りのこと十分に微生物群集 (多様性をキャプチャするための十分な示されたサンプルあたり OTUs の数に関連してシーケンス努力希薄曲線図 2)。真空レベルはサンプルの種類によって異なり、各シーケンスの実行を個別に決定する必要があります。この深さに rarefying 後、1,714 OTUs は 1 サンプルあたり 93.3 ± 4.3 OTUs の平均のすべてのサンプルに識別されました。下流解析を避けるためにまれな一般的なカテゴリに疎行列からすべて OTUs ≥ 1% 豊富で少なくとも 1 つのサンプルでは見つからない潜在的な汚染物質を削除して発生する問題を集めた。さらに、r decontam パッケージ OTUs 実サンプルを基準として否定的なコントロールで表現を識別するために利用し、これら OTUs は下流の分析から削除されました。
QIIME 多様性解析ワークフローを使用してアルファ多様性、ベータ多様性と単純なバイオインフォマティクスのパイプラインを使用して生成された分類組成多様性出力の種類を示す社会生態解析を行った。たとえば、加重と加重 Unifrac 主座標分析は、"core_diversity_analyses.py"のスクリプトを使用して作り出された、クラッチ id (図 3) に基づくマダニ幼虫の空間クラスター化を明らかに。ひげの乙は、時間 (図 4) をかけてマイクロバイ種多様性の違いを示す回もこのスクリプトによって生成された環境の露出を変にカウントします。これらのアルファおよびベータ多様性解析、マッピング ファイルに示されたユーザー定義のカテゴリに基づいて実行されますが、数字と一般的な分類についての統計情報は、すべてのサンプル (図 5) も生成されます。
図 1:マイクロバイ シーケンス ワークフロー 。マイクロバイ シーケンス ワークフローの主な手順は、ライブラリの準備とシーケンス解析手順のコールアウトで表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: シーケンスの膨張曲線カウント正規化します。希薄曲線、ダニの各コホートには、努力をサンプリングする観測乙カウントを関連付けます。誤差範囲がレプリケート サンプル各クラッチ内に存在ため存在し、彼らは 1 つの標準偏差を示します。OTUs 最大限の多様性を適切にキャプチャする安定した曲線になるポイント以降に、シーケンス処理深さを選択必要があります。ここでは、2,000 の読み取りの順序深度が適切な表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:主クラッチによる分析を調整します。加重 Unifrac 主座標分析 (PCoA) は、異なるクラッチと大人から幼虫のタイマー刻み間マイクロバイ組成の変化を示しています。各データ ポイントは、個々 の目盛りを表します。この図は、QIIME"core_diversity_analyses.py"のスクリプトによって自動的に生成されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 露光時間によってアルファ多様性ひげ。乙を描いたひげを時間をかけて微生物多様性の環境曝露グループ ショーの変化のカウントします。この図は、QIIME"core_diversity_analyses.py"のスクリプトによって自動的に生成されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 1 つクラッチの門レベル微生物同定します。門レベルで個々 の目盛り 1 つクラッチからサンプルのマイクロバイ構成が表示されます。この図では、下位の分類学的レベルでの要約情報と同様は、QIIME"core_diversity_analyses.py"のスクリプトを自動的に生成されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| メトリック | 定義 | 私たちの結果 (MiSeq V3) | MiSeq V3 に最適 | HiSeq 急速モードに最適 | |
| 読み取り PF | 貞操フィルターを渡す読み取りシーケンスの数。読み取りフィルターを渡すは、base 以上 1 の呼び出しは、まず 25 サイクル貞操値が 0.6 を下回る場合 | 12,885,713 | 1400 万 | 6 億 | |
| 誤り率 | PhiX コントロールに配置の読み取りに基づくサイクル、中に正しく呼ばれる塩基対の割合 | 3.28 に対してプラス マイナス 0.10 | その他のメトリックの値に依存しています。 | その他のメトリックの値に依存しています。 | |
| ≥Q30% | 基本コール精度 99.9% を示す Q スコア ≥ 30、脚部の割合 | 68.94 | > 70% | > 80% | |
| クラスター PF (%) | クラスター貞操フィルターを渡すの割合です。 | 85.61 ±0.81 | 90% | 90% | |
| 密度 | フローセル - データの品質と出力の重要な基準上のクラスター密度 | 552 ± 35 クラスター/mm ^2 | 1200-1400 クラスター/mm ^2 | 850-1000 クラスター/mm ^2 | |
表 1:NGS 出力の性能パラメーターをキーします。ユーザー データとターゲット値に基づいて報告本の研究 (材料表) とシーケンス制御に加えて、25% で使用されるシーケンス プラットフォームと試薬キットです。
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Discussion
16S rRNA の次世代シーケンシング、微生物同定のための標準的なアプローチになるし、病原体の感染に影響を与えるベクトル内細菌叢解析の研究。ここで説明したプロトコル詳細I. スルメライム病の媒介種の微生物コミュニティ アセンブリを調査するこのメソッドを使用してただし、他のカチカチ種または節足動物媒介種勉強に簡単に適用することができます。
確かに、蚊、諸、ツェツェ バエ29,30,31などベクトルの内細菌叢解析を勉強するマイクロバイ解析の 16S rRNA 配列を広く使用されています。ベクトル内の微生物の同定に使用できる他の方法は、顕微鏡検査、培養、および組織染色に含まれます。これらのメソッドは、目標識別し新規微生物 (顕微鏡検査) を記述する、抗菌薬 (文化) の効果を評価 (組織染色) ベクター内の特定、既知の微生物をローカライズしたりする場合のシーケンスよりもより適切かもしれない。ただし、これらのメソッド低特異性、検出、およびスケーラビリティ、苦しむ、従ってベクトル内の微生物の完全な社会の識別や、生態学的および実験的変動ベクトル マイクロバイの特性にはあまり適して条件。逆に、16 s rRNA 遺伝子の高スループット シーケンス低豊かさと非培養細菌の同定を可能、高解像度と与えられる包括的なリファレンス ・ データベースの検出を提供します、高いレプリケーションによって提供することができます。カバレッジのニーズ。
16S rRNA 配列は今広く微生物同定に使用されますが、この手法は制限なしではありません。主に、微生物汚染はシーケンスの結果の解釈のあいまいし、生物学的意味32を混同できます。さらに、低に普遍的な細菌のプライマーと感度の使用を与えられた以降 16S rRNA 配列に内在している濃度では、微生物汚染が一般的な32。PCR の試薬、DNA 抽出キット、研究所表面と皮膚や研究者33,34,35の衣類の汚染源が含まれます。マイナス コントロールと技術的な複製を使用して、無菌実験室環境で作業汚染微生物の影響を最小化できる、36を使用すべてのキットおよび試薬の記録を維持します。
微生物汚染に加え低品質シーケンス出力は大きくマイクロバイ シーケンス データの有用性を妨げることができます。フィルター、30、およびクラスター密度の Q-スコア (ベース呼び出しのエラーの予測確率の測定) を超える読み取りの比率を渡す読み取りの数を含む実行のメトリックの数によっては、データの品質を評価できます。これらのメトリックの値は実行すると、シーケンス システム、試薬カートリッジとシーケンスを制御を使用すると、% のサンプルの数によって異なりますが、オンライン実行条件に基づいて最適な値があります。特に、クラスター密度、シーケンス処理の前に、フロー ・ セルの指定された平面上のライブラリのクラスターの数は、データの品質と歩留まりを最適化するための重要なパラメーターです。上と下でクラスタ リングの両方は、データ出力を削減し、サンプルの範囲が不十分のため解析から除外されている場合は、できます。不良クラスター密度は、多くの場合不正確なライブラリ定量化; を反映します。したがって、適切な DNA クリーンアップ、個々 のサンプルの定量化、およびライブラリ全体数量を実行には注意が必要があります。
高いデータ品質・収量を達成したと仮定すると、大規模なデータセットの統計の課題を克服するために使用されるデータ解析における発散のアプローチはこのアプローチのもう一つの制限をもたらします。たとえば、サンプル間読み取り数のアドレス変動する複数の方法が存在します。真空は、サブのすべてのサンプルと同じシーケンスの深さを達成するために読み取りをサンプリングが行われます、頻繁に使用されますが、最近大量のデータとシーケンスの最小深さ37 の主観的選択を無駄に批判の対象となっています。 ,,3839。スケーリング (CSS)、累積合計すべてのシーケンスを読み取りますが、指定された百分位数にカウントの累計に基づいてそれらの重量を量る続ける代替手法として開発されました。しかし、その相対的な目新しさと有無の分析前に正規化の真空の確認ユーティリティにより CSS は広く採用されていません。
標準的なデータ分析の手順は、否定的なコントロール シーケンスの読み取りを処理と低豊富なリードからこれらを区別するのも欠けています。前述のように、分析中に微生物汚染物質から真のベクトル マイクロバイ住民を区別するため推奨される DNA 抽出ステップから生成された負のコントロールの配列。まだ、識別し、疑いのある汚染物質をフィルタ リングの標準および統計的に厳密なアプローチが欠けています。一般的なアプローチは、すべてのサンプルから OTUs マイナス コントロールでを削除することです。ただし、このメソッドが過度に保守的なので可能性が高いこれらの微生物の多くはキット試薬40ではなく、実際のサンプルを起源として可能性があります。もう一つの一般的な手法には微生物汚染物質が実際サンプル8,41では珍しい「珍しい」カテゴリにグループ化微生物 < %1 に存在が含まれます。ただし、このメソッドを削除、マイクロバイは、共生によって支配されるI. スルメ I. holocyclus7,42.で見られる場合は特に低微量に存在する真のベクトル微生物これらのケースでより深いシーケンス、増幅 PCR42中、内の増幅を抑制するプライマーを開発または計算シーケンス分析中に、細胞内共生細菌を削除必要となるまれな微生物を検出7. マイクロバイ データ解析、研究間で結果を比較する機能が制限される場合の主観と先入観のための機会を作成します OTUs 様々 な珍しいアドレス方法や汚染物質の中から選択します。
分類学および系統発生情報をシーケンス リードに割り当てるために必要なリファレンス ・ データベースの選択は、発散と主観のため別の機会を提示します。変数遺伝子領域から識別された親ゲノム シーケンス リードを関連のタスクは、本質的に挑戦的な信頼性の高いリファレンス ・ データベースの正確な系統の割り当てが欠かせません。複数のデータベースは、シルバ43、Greengenes44、RDP45、NCBI46などのように、この課題に浮上しています。シルバは、RDP と同様、シルバ、しかし、16S ベース分類の最大属レベルの分類学的情報を提供するだけです。Greengenes 種レベル情報を提供し、QIIME のようなメタゲノム解析パッケージに含まれるが、それが 4 年間で更新されていません。NCBI、分類学的情報のプライマリ ソースではなくユーザーが投稿した動画から毎日更新された分類を提供しますが、精選されたではないです。データベース間での選択は、通常の解像度、カバレッジ、および通貨に関するユーザーのニーズによって異なります系統の割り当てと下流解析47,48に大きな影響があります。使用するリファレンス ・ データベースに関する研究者の間でコンセンサスはこうして解析における付加的なバイアスを回避するために不可欠です。
16S rRNA 配列がますます一般的な手法として、データ処理の課題に対応する標準的な方法は可能性が出てくる。シーケンシング コストと時間の継続的な削減はさらなるこのメソッドを普及します。この技術の使用量の増加は、組成とベクトル内細菌叢解析多様な条件下での生態をより深い調査を有効になります。同様にベクトル マイクロバイ生物学の知識はまだ始まったばかりで、記述研究のこれらのタイプは、ベクトル制御の手段として、マイクロバイを活用する試みに先行する重要な第一歩です。しかし、これらの微生物の機能的役割の知識を持つ、病原体の感染でマイクロバイの役割を本当に理解する微生物同定を結合する必要があります。RNA シーケンスとマッピングを含む遺伝子発現定量解析、トランスクリプトーム アプローチ微生物の機能役割に推論を有効にするが、ディープ シーケンスを必要し、対象種のゲノムを完全に組み立てられます。16S rRNA シーケンス データは最近開発されているが、広く採用されていないまだ49から機能構成を予測するこれらの課題、計算ツールを回避します。生態学的理論と同様、そのようなツールの開発、微生物のアイデンティティとベクトル内の機能的な役割を結ぶベクトル マイクロバイ研究の 16S rRNA 配列データの有用性を増加します。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作業によって支えられた全米科学財団は a. s. (DEB #1427772、1745411、1750037) に付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
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