Summary
Здесь мы представляем протокол следующего поколения последовательности для 16S рРНК последовательности, которая дает возможность идентификации и характеризации микробных сообществ в рамках векторов. Этот метод включает извлечения ДНК, усиления и штриховое кодирование образцов через PCR, виртуализации на поток клеток и биоинформатики соответствует последовательности данных в филогенетических информации.
Abstract
В последние десятилетия трансмиссивных заболеваний вновь возникли и расширена с угрожающей скоростью, вызывая значительные заболеваемости и смертности во всем мире. Для большинства этих заболеваний, что обусловливает необходимость разработки стратегий смягчения последствий новых болезней отсутствуют эффективные и широко доступны вакцины. С этой целью перспективным направлением контроля заболеваний включает в себя ориентации вектора микрофлора, сообщества микробов, обитающих вектор. Вектор микрофлора играет ключевую роль в динамике патогена, и манипуляции микрофлора, привели к сокращению вектор изобилия или патогена передачи для горстки трансмиссивных заболеваний. Однако переводя эти выводы в болезни управления приложения требует глубокого понимания вектор микробной экологии, исторически ограничивается недостаточным технологии в этой области. С появлением следующего поколения последовательности подходов позволила быстрый, высоко параллельной последовательности различных микробных сообществ. Ориентация весьма сохраняется 16S рРНК гена способствовала характеристики микробов присутствует в векторы в различных экологических и экспериментальных условиях. Этот метод включает амплификацию гена 16S рРНК, штриховое кодирование образца через PCR, Загрузка образцов на ячейку потока для виртуализации, и биоинформатики подходов к последовательности данные сопоставить с филогенетической информации. Видов или род уровень идентификации для большого числа реплицирует обычно может быть достигнуто через этот подход, таким образом обходя проблемы низкой обнаружения, резолюции и вывода из традиционного культивирования, микроскопии или гистологических пятнать методы. Таким образом этот метод хорошо подходит для характеризующие вектор микробов в различных условиях, но в настоящее время не может предоставлять информацию о микробной функции, расположение внутри Вектор, или ответ на лечение антибиотиками. В целом 16S секвенирование нового поколения – это мощный метод для лучшего понимания личности и роли векторных микробов в динамике болезни.
Introduction
Возрождение и распространение трансмиссивных заболеваний в последние десятилетия представляют серьезную угрозу для глобального здоровья человека и дикой природы. Для большинства этих заболеваний отсутствуют эффективные вакцины, и усилия управления препятствуют сложные биологической природы векторов и вектор хост взаимодействий. Понимание роли микробных взаимодействий внутри вектор в передаче возбудителя может позволить для разработки новых стратегий, позволяющих обойти эти проблемы. В частности взаимодействия между связанный вектор Комменсалами микроорганизмов, симбионтами и патогенов, именуемый микрофлора, могут иметь важные последствия для передачи возбудителя. Подавляющее большинство доказательств теперь поддерживает это утверждение, с примерами, демонстрируя связь между вектор микрофлора и компетентности для таких заболеваний, как малярия, вирус Зика и болезни Лайма1,2,3. Однако переводя эти выводы в стратегии по контролю за заболеваниями требует гораздо более глубокое понимание структуры, функции и происхождение векторных microbiomes. Определение и характеристика вектор микробной сообщества в различных экологических и экспериментальных условиях составляют важный путь вперед в этой области.
Процедуры выявления микробной жители возбудителя вектора предоставляется здесь, используя западные черный legged клеща, Ixodes pacificus, вектор, видов возбудителя болезни Лайма Borrelia burgdorferi. Хотя клещей гавани больше типов патогенов человека, чем любых других членистоногих, относительно мало известно о биологии и сообщество экологии тик microbiomes4. Очевидно, что клещи гавани разнообразных вирусов, бактерий, грибков и простейших, которые включают Комменсалами, endosymbionts и переходные микробной жителей5,4. Предыдущие работы продемонстрировал сильные колебания Ixodes microbiomes, связанные с география, видов, секс, стадия жизни и крови еды источник6,,78. Однако механизмы, лежащие в основе этого различия остаются неизвестными и гарантируете, что более подробные расследования происхождения и Ассамблеи этих микробных сообществ. Клещи могут приобрести микробов путем вертикальной передачи, контакт с хостов и поглощение из окружающей среды через дыхальца, рот и анальный поры9. Понимание факторов, определяющих первоначального формирования и развития клеща микрофлора, специально относительный вклад вертикальных и окружающей среды передачи, имеет важное значение для понимания физических моделей и вариации в тик микрофлора разнообразие и как эти общины взаимодействуют во время передачи возбудителя, с возможным приложениями для управления заболеванием или вектор.
Мощные молекулярные методы, такие как секвенирование нового поколения, теперь для выявления микробных сообществ существуют и могут быть использованы характеризовать вектор microbiomes в различных условиях окружающей среды или экспериментальных. До появления этих подходов высокопроизводительного секвенирования выявление микробов полагались преимущественно на микроскопии и культуры. В то время как микроскопии — это быстрый и простой метод, Морфологические методы для идентификации микробов по своей сути субъективный и грубый и ограничивается низкой чувствительностью и обнаружения10. Методы на основе культуры широко используются для идентификации микроорганизмов и может использоваться для определения чувствительности микробов к наркотиков лечения11. Однако этот метод также страдает от низкой чувствительностью, как было подсчитано, что меньше, чем 2% экологических микробов может культивировали в лаборатории, установив12. Гистологические окрашивание подходы также были использованы для обнаружения и локализации конкретных микробов в векторы, включить расследования различных дистрибутивов таксонов в пределах клеща и исследование гипотезы о микробных взаимодействий. Однако предварительное знание микробного идентификации необходим для выбора соответствующего пятна, что делает этот подход плохо подходит для микробиологических характеристик и идентификации. Кроме того гистологические пятнать это очень много времени, трудоемкий процесс и не подходит для больших выборок. Традиционные Молекулярные подходы например Сэнгер, секвенирование аналогичным образом ограничены в их чувствительность и обнаружения различных микробных сообществ.
Секвенирование нового поколения позволяет для быстрой идентификации микробов из большого числа проб. Наличие стандартных маркерных генов и справочных баз данных дальнейшем позволяет повысить таксономических резолюции, часто до уровня рода или вида. Для достижения этой цели, с 16S рРНК чаще связано с наличием сохраняемой и переменных регионов в рамках гена, что позволяет для создания универсальных грунты с уникальными ампликонов для каждого бактериального часто используются малые Субблок рибосомной РНК виды,1314. В настоящем докладе подробно процедуру для определения таксонов в тик микрофлора через 16S рРНК секвенирование нового поколения. В частности этот протокол подчеркивает шаги, необходимые для подготовки образцов для виртуализации. Более обобщенные сведения о виртуализации и биоинформатики шаги предоставляются, как есть множество виртуализации платформ и программ анализа имеющихся в настоящее время, каждый с обширной существующей документации. Общая осуществимости этого подхода секвенирование нового поколения продемонстрировал, применяя его к расследованию микробных Ассамблеи в рамках ключевых болезнь векторного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Отметьте коллекции и поверхности стерилизации
- Сбор, клещей, перетащив 1 m2 белая ткань над клеща связанные Хабитат, Удаление Клещи придает принимающей видов, или воспитание клещей в лаборатории,1516. Использование тонкой щипцы манипулировать клещей и хранить их при температуре-80 ° C.
- Клещи в отдельных труб ПЦР и удаление поверхностных загрязнений, vortexing для 15 s последовательно с 500 мкл перекиси водорода (H2O2), 70% этанол и ddH2O.
- Место клещей в новом ПЦР-пробирку и позволить им высохнуть.
- В этой пробке, механически нарушить деления тканей путем дробления клещей с ступку и пестик (используется в этом исследовании), используя маленькие бусины в било шарик, или резки клеща друг от друга с помощью скальпеля.
2. ДНК очистки
- Очищайте ДНК от отдельных клещей, следуя инструкциям, приведенным в коммерчески доступных комплект экстракции ДНК. Элюировать окончательный объем 100 мкл.
Примечание: Обратитесь к рис. 1 представлен обзор шагов 2,2-2,8. Извлечения альтернативные методы включают в себя фенол хлороформ извлечения17,18, этанола осадков19или извлечения с хелатирующий материала20,21. - Подтверждение успешного Очищение дна с помощью флуориметр или спектрофотометра. Для флюометрия используйте 10 мкл ДНК шаблона в 190 мкл двуцепочечной ДНК assay. Ожидаемой доходности составляет 0,1-1,0 нг/мкл22. Для спектрофотометрия используйте 1 мкл ДНК шаблона в квантификации нуклеиновых кислот. Ожидаемое A260/280 соотношение составляет примерно 1,823.
- Если не немедленно приступить к амплификации, хранить образцы при-20 ° C.
3. 16S рРНК амплификации генов
- Настройка Ампликон ПЦР в 27,5 мкл реакции, содержащей: 5 мкл каждого праймера на 1 мкм; 12,5 мкл коммерчески доступных ПЦР смеси; и 5 мкл ДНК, извлеченные из отдельных клещей в концентрации 5 нг/мкл.
Примечание: Используйте следующие Праймеры для амплификации регионе V3 V4 гипервариабельных гена 16S рРНК13:
5'--TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG--3',
5'--GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC--3' - Переехать Термоциклер запрограммированы для трубы: первоначальный Денатурация при 95 ° C 3 мин; 25 циклов 1) 95 ° c за 30 сек, 2) 57 ° C за 30 сек, 3) 72 ° C для 30 s; окончательное расширение при 72 ° C за 5 мин; и окончательный удерживайте при 10 ° C.
- После того как сделали ПЦР, визуализируйте продукт PCR, загрузка 4-6 мкл/образца на 1,5% агарозном геле. Посмотрите на группы на 460 bp для подтверждения амплификации.
Примечание: Ампликон ПЦР продукт не может быть видимой на геле если концентрация образца является слишком низким (< 10 нг). Присутствие димера праймера встречается в образцах низкие концентрации. Если присутствуют другие непромысловых полос, регулировки температуры отжига или уменьшить количество циклов. - Если не немедленно приступить к очистке, хранить образцы на 4 ° C.
4. 16S ампликон очистки
- С помощью нового ПЦР-пробирку для каждого образца, совместить продукт PCR с ddH2O получить 60 мкл всего. Для образцов с низкой концентрации ДНК выполняют Ампликон ПЦР в трех экземплярах уменьшить усиление предвзятости и объединить образцы сосредоточиться.
- Принести парамагнитных бусины комнатной температуры и вихревой их хорошо перед использованием.
- Добавьте 48 мкл парамагнитных бисера 60 мкл пример и инкубировать на 5 мин место трубы на магнитной стойке за 5 мин до тех пор, пока раствор становится ясно. Удалите супернатант.
Примечание: Этот шарик концентрация цели удаления Димеры праймера (< 60 bp). Если необходимо, отрегулировать концентрацию шарик для удаления других неспецифических диапазонов. - С трубками на магнитные стойки, добавить 500 мкл свежеприготовленные 80% EtOH. Сразу же после добавления EtOH все трубы, Пипетка, жидкости. Не удаляйте бисер. Повторите EtOH добавления и удаления еще один раз.
- Просушите образцы для удаления избыточных EtOH, оставив открытым трубы на магнитные стойки для 5 минут, или до тех пор, пока в бисер видны небольшие трещины.
- Добавить 20 мкл буфера TE и Проинкубируйте образцы от магнита, при комнатной температуре, для 5-10 мин.
- Место труб обратно на магните. После того, как бусы и жидкости разделены, передать свежие трубки для получения очищенного продукта PCR супернатант.
- (Необязательно) Визуализация продукта для подтверждения успешного ампликон очистки путем загрузки 4-6 мкл/образца на 1,5% гель. 460 bp группы должны быть видны, и там должно быть без димера праймера.
- Если не приступить немедленно к индекс PCR, хранить образцы 4 ° C.
5. пример штрихового кодирования и очистки
- Назначьте комбинации уникальных грунтовка для каждого образца, выбрав вперед или обратный грунты, или оба, из комплекта индекс коммерчески доступные библиотеки.
Примечание: Уникальной маркировки образцы позволяет для дифференциации после виртуализации. Комплекты обычно предоставляют достаточно Праймеры для последовательности 96-384 образцы. - Придаем двойной грунтовки или индексов, образцы, выполняя ПЦР в 25 мкл реакции, содержащие 2,5 мкл каждого праймера (N7xx и S5xx), 12,5 мкл коммерчески доступных ПЦР мастер смеси, 5 мкл ddH2O и 2,5 мкл уборка ампликон продукта.
- Переместите трубы Термоциклер запрограммированы для: первоначальный Денатурация при 95 ° C 3 мин; 8-14 циклов 1) 95 ° c за 30 сек, 2) 55 ° C за 30 сек, 3) 72 ° C за 30 s; окончательное расширение при 72 ° C за 5 мин; и окончательный удерживайте при 10 ° C.
- После того как сделали ПЦР, визуализируйте продукт PCR, загрузка 4-6 мкл/образца на 1,5% агарозном геле. Посмотрите на группы на 550 bp для подтверждения амплификации.
Примечание: Используйте визуализации результатов сообщить индекс PCR Велоспорт условий. Снизить число циклов для смягчения неспецифической привязки или увеличить значение счетчика цикла для получения видимых полос для каждого образца. - Повторите процедуру очистки, перечисленные на шаге 4. Чтобы избежать разбавления во время очистки, выполняют индекс PCR в двух экземплярах и бассейн продукт здесь.
- Если не немедленно приступить к Библиотека количественной и нормализации, хранить образцы на 4 ° C.
6. Библиотека количественной и нормализации
- Оценки концентрации каждого очищенный, перепутываются продукта из шага 5.5 с помощью флуориметр или спектрофотометра (см. шаг 2.2). Развести образцы в TE буфер для получения концентрации около 1 вечера.
Примечание: Библиотека количественная оценка необходима для достижения образец загрузки концентрации, рекомендуется для платформы виртуализации. Квантификация библиотека достигается с помощью ПЦР, но оценки концентрации образца до ПЦР экономит время и реагентов. Концентрации 1 pM рекомендуется увеличить точность библиотеки количественной оценки, как это средняя концентрация ПЦР стандартов в количественной оценке комплект24. - Выполните ПЦР в 10 мкл реакции, содержащие 6.0 мкл мастер смесь ПЦР (из библиотеки количественная оценка kit), 2.0 мкл ddH2O и 2.0 мкл пример или стандарта. Запустите каждый образец и стандартные в трех экземплярах для большей точности и точности. Запуск каждого образца на три или более уровнях разрежения (например., 0: 1 вечера, 1 вечера и вечера 10 оценкам начальной концентрации) для обеспечения точной количественной оценки.
Примечание: Подробная информация о предоставляемых грунтовки и стандартов будет зависеть в количественной оценке комплект используется и доступны в лист технических данных продуктов. Обратитесь к Таблице материалов для комплекта количественной оценки, используемые в данном исследовании. - Переехать в реальном времени инструмент ПЦР запрограммированы для ПЦР пластины или трубок: первоначальный денатурации 95 ° c за 5 мин; 35 циклов 1) 95 ° c за 30 s и 2) 60 ° C для 45 s; и диссоциации шаг 1) 95 ° c 15 s, 2) 60 ° C за 30 s и 3) 95 ° C 15 s.
- Вычислить среднее начиная концентрации для каждого образца, используя количественную оценку значения, полученные из результатов ПЦР и уровни разбавления образца, используемые.
Примечание: например, средняя концентрация 2 pM на образцы, которые разбавляют картирование дает оригинальный начальной концентрации 200 Нм. Если ни один из уровней разрежения для данного образца попадает в диапазон стандартных кривых, количественной оценки результаты не могут быть точными; в этом случае отрегулировать уровень разрежения и повторно выполнять ПЦР. - Разбавить каждой очищенной, перепутываются образец 4 Нм в буфере TE, основанный на средние концентрации рассчитаны на шаге 7.5.
Примечание: К примеру, для среднего образца концентрации 200 Нм, разбавляют образец 1:50 в TE буфера для достижения 4 Нм концентрации. Концентрация точный пример будет зависеть в комплект системы и реагента последовательности используется. Обратитесь к руководству пользователя системы виртуализации для рекомендуемая концентрация. - Создайте объединенную библиотеку, добавив равных объемах (обычно 5-10 мкл) всех отдельных библиотек в одну трубу.
Примечание: как все образцы должны быть при концентрации 4 Нм добавив равных объемах достигает равной концентрации всех образцов в библиотеке пула. - Повторите шаги 6.2-6.4 на объединенную библиотеку для подтверждения концентрации 4 Нм.
- Рассчитать концентрацию комбинированных библиотеки и разбавлять или повторно составляют окончательный, Объединенные библиотеки с использованием буфера Tris как необходимые для достижения 4 Нм.
- Если не немедленно приступить к загрузке образца, хранить образцы при-20 ° C. Выполните последовательность запуска вскоре после количественной оценки, чтобы свести к минимуму потери или изменения концентрации ДНК в процессе хранения.
7. Библиотека денатурации и разрежения и последовательность запуска (выполняют в тот же день)
- Денатурируйте 4 Нм объединенную библиотеку из шага 6.9 с NaOH.
Примечание: Эти шаги подготовки окончательного библиотеки различаются для каждой последовательности системы. Обратитесь к руководству пользователя системы виртуализации для более подробного и обновленного протоколов. Новые пользователи будут скорее всего нужно быть натренированным на использование платформы виртуализации или может отправить их библиотек в объекте последовательности основных. - Разбавьте денатурированного библиотеки для концентрации желаемого загрузки, используя буфер, предоставленный в последовательности комплект реагентов (Таблица материалов).
Примечание: Загрузку оптимальных концентраций зависит от последовательности системы и обычно колеблется от 1-250 pM25. - Денатурировать и разбавленных элемент последовательности.
Примечание: Добавление последовательности управления корректирует последовательность вопросов, вытекающих из библиотек низкого разнообразия. Денатурируйте последовательности управления с использованием NaOH и разбавляют до такой же концентрации, что и библиотека. - Объединять библиотеки и последовательности управления.
Примечание: Соотношение последовательности управления для комбинированных библиотека будет зависеть от библиотеки разнообразия и используемой системы виртуализации, но это как правило 1:126. - Загрузите объединенную библиотеку и последовательности управления смесь на ячейку потока последовательности.
8. ампликон последовательность анализа
- Оцените общий успех выполнения путем изучения выполнения метрики на Облако вычислительной среды, соответствующие системе виртуализации используется.
Примечание: Выполнения метрик, таких как количество операций чтения последовательности, будет зависеть виртуализации платформы и реагента комплект используется. Целевые значения для общих систем виртуализации, перечислены в таблице 1. - Скачайте сырой последовательности данных и желаемого биоинформатики открытым исходным кодом, количественные исследования в микробной экологии (QIIME)27 или28Mothur.
Примечание: Оба QIIME и Mothur являются открытым исходным кодом и бесплатно скачать. Подробные инструкции по использованию этих программ можно найти в Интернете и достаточно подробным для пользователей, впервые. Ниже шаги обеспечивают широкий обзор биоинформатики трубопровода, проведенного в QIIME. Знакомство с языком python, не является необходимым, но будет способствовать осуществлению следующих скриптов - Создание и проверка файла сопоставления, с помощью сценария «validate_mapping_file.py» в QIIME.
Примечание: Файл сопоставления содержит все метаданные, необходимые для выполнения анализа данных, включая пример ID, ампликон грунтовка последовательности и описание образца. Шаг проверки проверяет, что все необходимые данные были введены в правильном формате. - Демультиплексирования и фильтрации последовательности с помощью сценария «split_libraries.py» (рис. 1).
Примечание: Этот сценарий присваивает перепутываются читает образцов, на основе сочетания Грунтовка индекса и образец идентификаторы входа в файле сопоставления. Он также выполняет несколько качества фильтрации шаги для контроля для виртуализации ошибка на основе определяемых пользователем обрезков показатель минимального качества, последовательности длины и конец обрезки. - Назначьте оперативные таксономических единиц (OTUs) последовательностей с использованием сценария «pick_open_references_otus.py».
Примечание: В этом шаге последовательности объединяются против ссылка последовательности коллекции, основанные на пороге личности (как правило 97%). Читает, которые не соответствуют последовательности коллекции ссылок сгруппированы друг против друга. Де ново и закрытые ссылки OTU собирание параметры также доступны, но открыть ссылку собирание рекомендуется разработчиками QIIME. - Нормализовать OTU таблицы с помощью сценария «alpha_rarefaction.py» или «normalize_table.py».
Примечание: Этот шаг корректирует различия в столбце суммы, или общая последовательность читает на сэмпл, что результатом современных последовательности технологий. Нормализация может выполняться с использованием традиционных разрежения, или через альтернативные методы, такие как нарастающая сумма масштабирования. - Выполните несколько альфа разнообразия, бета разнообразие и Таксономический состав разнообразия анализы сразу с помощью сценария «core_diversity_analysis.py».
Примечание: Кроме того, эти анализы могут выполняться отдельно с использованием отдельных сценариев (например, «alpha_diversity.py»).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В общей сложности 42 клещей из трех отдельных яйцо муфты и двух периодов воздействия окружающей среды, 0 и 2 недели в почве, были обработаны для секвенирования микрофлора. Каждой группе лечения, считается для сцепления и воздействия однократного, содержится 6-8 реплицировать клеща образцы. Эти экстракты обработанных тактов были погружены на следующего поколения секвенсор и принесли 12,885,713 читает в паре конец прохождения фильтра. В этой перспективе были включены 3 негативный контроль от извлечения шаг, давая в общей сложности 211,214 чтений (входит в предыдущих игр). Дальнейшего выполнения качества метрик и оптимального значения для каждой метрики подробно описаны в таблице 2. Разрежения кривые, которые касаются количество OTUs на сэмпл, указал что последовательности глубины, или количество уникальную последовательность читает на сэмпл, 2 129 гласит будет достаточно, чтобы адекватно отразить все многообразие микробных (последовательности усилий Рисунок 2). Уровень разрежения поменяет основано на образец типа и должен быть определен индивидуально для каждой последовательности запуска. После rarefying на этой глубине, 1,714 OTUs были определены во всех образцов с в среднем 93,3 ± 4.3 OTUs на сэмпл. Чтобы избежать течению анализ вопросов, вытекающих из разреженных матриц и для удаления возможных загрязнений, все OTUs, не найден в по крайней мере один образец в изобилии ≥ 1% были объединить в категорию редких общего. Кроме того в decontam пакет в R использовался для выявления OTUs перепредставлены в негативный контроль относительно реальных образцов, и эти OTUs были удалены из вниз по течению анализа.
Сообщество экологии анализы с использованием рабочего процесса анализа QIIME разнообразия продемонстрировать типы разнообразия альфа-, бета разнообразия и таксономии состав разнообразия, сформированный с помощью простой биоинформатики конвейера. Например взвешенные и невзвешенные Unifrac основные координаты анализы были подготовлены с помощью сценария «core_diversity_analyses.py», и они показали, пространственной кластеризации личинок клещей, основанный на личность муфта (рис. 3). Boxplots OTU рассчитывает на различные воздействия на окружающую среду, который раз также были созданы через этот скрипт, демонстрирует различия в микрофлора видовое богатство во времени (рис. 4). Эти альфа и бета разнообразия анализы выполняются на основании пользовательских категорий, перечисленных в файле сопоставления, но цифры и статистические данные по общей таксономической информации также создаются для всех образцов (рис. 5).
Рисунок 1 : Микрофлора последовательности рабочего процесса. Основные шаги рабочего процесса виртуализации микрофлора, отображаются с вызовами для библиотеки подготовка и последовательности шагов анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Разрежения кривых для последовательности рассчитывать нормализации. Кривые разрежения, показаны для каждой группы тиков, касаются выборки усилий наблюдаемых OTU графов. Планки погрешностей присутствуют благодаря репликации образцов в рамках каждой сцепления, и они обозначают одно стандартное отклонение. Секвенирование глубины должен быть выбран на или за пределами точки, где кривая становится стабильным адекватно захватить все разнообразие OTUs. Здесь последовательности глубины 2000 гласит появляется соответствующий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Главный координировать анализ путем сцепления. Невзвешенный Unifrac главных координировать анализ (PCoA) показывает вариации в составе микрофлора между личинок клещей от разных лап и от взрослых. Каждая точка данных обозначает отдельные клеща. Эта цифра автоматически генерируется через скрипт QIIME «core_diversity_analyses.py». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Альфа разнообразие boxplots, выдержка. Boxplots, изображающих OTU подсчитывает для воздействия на окружающую среду группы шоу вариации в микробного разнообразия с течением времени. Эта цифра автоматически генерируется через скрипт QIIME «core_diversity_analyses.py». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Тип уровня микробного идентификации для сцепления, один. Микрофлора композиции для отдельных клеща образцов из сцепления, один показано на уровне Фила. Эта цифра, а также краткая информация на более низких уровнях таксономических, автоматически генерируется через скрипт QIIME «core_diversity_analyses.py». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Метрика | Определение | Наши результаты (MiSeq V3) | Оптимальный для MiSeq V3 | Оптимальный для HiSeq быстрого режима | |
| Читает PF | Количество последовательности читает, проходя фильтр целомудрия. Читать проходит фильтр, если не больше чем 1 Базовый вызов имеет значение целомудрия ниже 0,6 в первые 25 циклов | 12,885,713 | 14-16 млн. | 600 миллионов | |
| Частота ошибок | Процент пар нуклеотидов называется неправильно во время цикла, основанный на читает в соответствие PhiX управления | 3.28 ±0.10 | * Зависит от значений других показателей | * Зависит от значений других показателей | |
| % ≥Q30 | Процент баз с Q счет ≥ 30, указывающий базовый вызов точность 99,9% | 68.94 | > 70% | > 80% | |
| Кластер PF (%) | Процент от кластеров, проходя фильтр целомудрия. | 85.61 ±0.81 | 90% | 90% | |
| Плотность | Плотность кластеров на flowcell - ключевые метрики для качества данных и вывода | 552 ± 35 кластера/мм ^ 2 | 1200-1400 кластера/мм ^ 2 | 850-1000 кластера/мм ^ 2 | |
Таблица 1: Ключевые параметры производительности для вывода NGS. Значения данных и целевого пользователя сообщили основаны на виртуализации платформы и реагента kit, используемых в этом исследовании (Таблица материалов) и добавления управления последовательность 25%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Секвенирование нового поколения 16S рРНК стал стандартным подходом для микробного идентификации и включено изучение как вектор microbiomes влияют на передачи возбудителя. Протокол, изложенные здесь подробности использования этого метода расследовать микробных Ассамблеи в I. pacificus, вектор видов для болезни Лайма; Однако она легко может применяться для изучения других видов клещей или видов членистоногих вектор.
Действительно 16S рРНК последовательности для анализа микрофлора широко используется для изучения microbiomes векторов, включая psyllids комаров и мух цеце29,,3031. Другие доступные методы для идентификации микроорганизмов в векторы включают микроскопии, культивирования и гистологической пятнать. Эти методы могут быть более подходящим, чем последовательности, если цель заключается в том, чтобы определить и описать Роман микроба (микроскопия), оценивать эффект противомикробных препаратов (культура) или локализовать конкретные и известных микробов внутри вектор (гистологический окрашивание). Однако эти методы страдают от низкой специфичности, обнаружение и масштабируемость и таким образом меньше подходят для выявления полного сообщества микробов внутри вектор или характеризующих вектор микрофлора в различных экологических и экспериментальных условий. И наоборот высок объём секвенирование гена 16S рРНК позволяет идентифицировать низкой изобилие и не culturable бактерий, обеспечивает высокое разрешение и обнаружения, учитывая всеобъемлющие справочные базы данных и может обеспечивать высокий репликации в зависимости от на покрытие потребностей.
В то время как 16S рРНК последовательности сейчас широко используется для идентификации микроорганизмов, эта техника-не без ограничений. Главным образом микробной контаминации может скрывать интерпретации результатов секвенирования и смешаем биологическое значение32. Кроме того, с учетом использования всеобщей бактериальных грунты и чувствительность к низкой начиная концентрации, которые присущи 16S рРНК последовательности, микробной контаминации является общим32. Источники загрязнения включают ПЦР реактивы, экстракции ДНК комплекты, Лаборатория поверхности, кожи и одежды исследователей33,34,35. Воздействию микробиологических загрязняющих веществ могут быть минимизированы, работая в среде стерильной лаборатории, используя негативный контроль и технический реплицирует, и вести учет всех наборы и реагенты используемые36.
В дополнение к микробной контаминации низкого качества последовательности вывода можно значительно препятствуют юзабилити микрофлора последовательности данных. Качество данных можно оценить по ряду показателей выполнения, включая количество считываний проходя фильтр, процент гласит выше Q-Оценка (мера предсказал вероятность ошибки в base вызов) 30 и плотности кластера. Значения для этих показателей будет меняться в зависимости от количество выборок, запуска, система виртуализации, реагент картриджа и процент виртуализации используется, но оптимальные значения на основе выполнения условий доступны онлайн. В частности кластера плотность, количество кластеров библиотеки на заданной плоскости поток ячейки до последовательности, является ключевым параметром для оптимизации качества данных и выход. Над и под кластеризация может сократить вывод данных и привести к образцов исключаются из анализа из-за недостаточного охвата. Бедные кластера плотность часто отражает неточной библиотека количественной оценки; Таким образом следует позаботиться о том, для выполнения надлежащей очистке ДНК, индивидуальный образец количественного определения и количественной оценки целую библиотеку.
Предполагая, что достигается высокое качество данных и урожайности, различных подходов в анализе данных, используемых для решения статистических проблем больших наборов данных представляют собой еще одно ограничение этого подхода. Например несколько методов существуют в адрес вариации в чтения графов между выборками. Разрежения, которая включает в себя подвыборки читает для достижения равных последовательности глубины во всех образцах, часто используется, но было подвергнуто критике недавно для тратить большое количество данных и субъективный выбор минимальной последовательности глубины37 ,,3839. Нарастающая сумма масштабирования (CSS), который сохраняет все последовательности читает, но весит их основе совокупные суммы счетчиков в течение данного процентиль, был разработан как альтернативный метод. Однако CSS не широко принят из-за своей относительной новизны и подтвердил полезность разрежения для нормализации до присутствие/отсутствие анализа.
Стандартные данные анализа процедур для обработки последовательности операций чтения в негативный контроль и отличительный от низкого залегания читает также отсутствуют. Как уже упоминалось, секвенирование негативные элементы, полученные на шаге экстракции ДНК рекомендуется чтобы помочь дифференцировать истинный вектор микрофлора жителей от микробиологических загрязнений во время анализа. Тем не менее отсутствуют стандартные и статистически строгий подход для выявления и отбора предполагаемых загрязняющих веществ. Общий подход заключается в удалении OTUs в негативный контроль от всех образцов. Однако этот метод может быть чрезмерно консервативной, поскольку многие из этих микробов вероятно происходят из реальных образцов, вместо того, чтобы комплект реагентов40. Другой распространенный метод предполагает группировку микробов, присутствующих на < 1% в категорию «редких» в предположении, что микробных загрязнителей редки в реальных образцов8,41. Однако этот метод может удалить истинной вектор микробов, которые присутствуют на низкая распространённость, особенно когда микрофлора преобладают endosymbiont, как показано в I. pacificus и I. holocyclus7,42. В этих случаях выявления редких микробы потребует глубже последовательности, разработки грунты, которые тормозят усилители endosymbiont во время Ампликон ПЦР42, или вычислительно удаление endosymbiont во время последовательности анализа 7. выбор среди различных методов адрес редких и загрязнений OTUs создает возможность для субъективности и предвзятости в анализе данных микрофлора, которая может ограничить возможность сравнить результаты различных исследований.
Выбор справочной базы данных, необходимые для назначения таксономии и филогенетических информации считывает последовательность, представляет еще одну возможность для расхождения и субъективности. Хотя касающиеся считывает последовательность из региона переменной генов генома выявленных родительского задача изначально сложным, надежный справочной базы данных имеет решающее значение для точной филогенетических назначения. Для решения этой задачи, такие как Силва43, Greengenes44, RDP45и46NCBI появились несколько баз данных. Сильва является крупнейшим на основе 16S таксономии, но Сильва, а также RDP, только обеспечивает таксономической информации до уровня рода. Greengenes предоставляет информацию видов уровне и включены в метагеномных анализирует пакеты, такие как QIIME, но она не обновлялась в течение четырех лет. NCBI, а не основным источником для таксономической информации, обеспечивает ежедневных обновленных классификаций от введенные пользователем последовательности, но это uncurated. В то время как выбор среди баз данных, как правило, зависит от потребностей пользователей относительно резолюции, освещение и валюты, он имеет значительное влияние на филогенетических назначения и ниже по течению анализ47,48. Консенсус среди следователей относительно которой справочной базы данных для использования таким образом необходимо для избежания дополнительных предвзятости в анализе.
Стандартные подходы этих задач обработки данных скорее всего появятся как 16S рРНК последовательности становится все более распространенным способом. Далее продолжение сокращения издержек виртуализации и время будет популяризировать этот метод. Увеличение использования этой технологии позволит глубже расследования композиции и экологии векторных microbiomes в различных условиях. Поскольку знания биологии микрофлора векторных все еще находится в зачаточном состоянии, эти типы описательных исследований являются важнейшим первым шагом предыдущие попытки использовать микрофлора как средства борьбы с переносчиками. Однако чтобы действительно понять роль микрофлора в передаче возбудителя, микробного идентификации должны сочетаться с знания функциональной роли этих микробов. РНК последовательности и транскриптомики подходов, которые включают сопоставления и количественного выражения гена, включить выводы в функциональную роль микробов, но требуют глубоких последовательности и полностью собранный геномов целевых видов. Обойти эти проблемы, вычислительные инструменты для прогнозирования функционального состава от 16S рРНК последовательности данных, недавно был разработан, но не принят широко еще49. Разработки таких инструментов, а также экологической теории, связывая микробного идентификации и функциональной роли в векторы увеличит полезность 16S рРНК последовательности данных в вектор микрофлора исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальный научный фонд предоставляет а.с. (DEB #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L.
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
- Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
