Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול הדור הבא רצפי עבור מטוסי אף-16 rRNA רצף המאפשרת זיהוי ואפיון של קהילות חיידקים בתוך וקטורים. שיטה זו כרוכה DNA החילוץ, הגברה, barcoding דגימות באמצעות PCR, רצף תאים זרימה, ביואינפורמטיקה כדי להתאים את רצף נתונים למידע פילוגנטי.
Abstract
במהלך העשורים האחרונים, מחלות נישאות וקטור מחדש, מורחב-מדאיגה המחירים, גורם משמעותי התחלואה והתמותה ברחבי העולם. חיסונים נרחב זמין ויעיל חסרים עבור רוב המחלות האלה, המחייב הפיתוח של אסטרטגיות להפחתת הסיכון למחלות הרומן. למטרה זו, שדרה מבטיח שליטה במחלה כולל מיקוד microbiome וקטור, הקהילה של חיידקים המאכלסים את הווקטור. Microbiome וקטור ממלא תפקיד מרכזי ב- dynamics הפתוגן, מניפולציות של microbiome הובילו שידור שפע או פתוגן וקטור מופחתת על קומץ של מחלות נישאות וקטור. עם זאת, לתרגם את הממצאים הללו לתוך המחלה בקרת יישומים דורש הבנה מעמיקה של וקטור אקולוגיה מיקרוביאלית, מבחינה היסטורית מוגבל על-ידי הטכנולוגיה לא מספיק בתחום זה. כניסתו של הדור הבא רצפי גישות אפשרה רצף מהיר, מקבילים ביותר של קהילות שונות מיקרוביאלי. פילוח הגן rRNA והתפאורה מאוד מטוסי אף-16 הנחתה את אפיוני של חיידקים מתנה בתוך וקטורים תחת משתנה תנאים אקולוגיים וניסויים. טכניקה זו כוללת הגברה של הגן rRNA מטוסי אף-16, דוגמת barcoding באמצעות PCR, טעינה בדגימות אל תא זרימה עבור רצף, ואת ביואינפורמטיקה הגישות כדי להתאים את רצף נתונים עם מידע פילוגנטי. מין או סוג ברמת זיהוי עבור מספר גבוה של משכפל יכולה בדרך כלל להיות מושגת באמצעות גישה זו, ובכך לעקוף את האתגרים של זיהוי נמוך, רזולוציית הפלט culturing מסורתיים, מיקרוסקופ או צביעת היסטולוגית טכניקות. לכן, בשיטה זו הוא מתאים היטב אפיון וקטור מיקרובים בתנאים מגוונים אך כעת לא יכול לספק לכם מידע אודות הפונקציה מיקרוביאלי, מיקום בתוך וקטור, או התגובה לטיפול אנטיביוטי. בסך הכל, מטוסי אף-16 הדור הבא רצפי היא טכניקה עוצמה להבנת טוב יותר את הזהות ואת התפקיד של חיידקים וקטור ב dynamics המחלה.
Introduction
התחייה של התפשטות מחלות נישאות וקטור בעשורים האחרונים מהווים איום רציני לבריאות האדם וחיות גלובלית. חיסונים יעילים חסרים עבור רוב המחלות האלה, מאמצי הבקרה הם מוגבל בשל האופי ביולוגי המורכב של וקטורים ואינטראקציות וקטור-פונדקאי. להבין את התפקיד של אינטראקציות חיידקים בתוך וקטור הפתוגן בשידור שיכולים לאפשר הפיתוח של אסטרטגיות מקוריות אשר לעקוף האתגרים הללו. בפרט, אינטראקציות בין וקטור-הקשורים commensals מיקרוביאלי, אנחנו חיים איתם בסמביוזה פתוגנים, המכונה של microbiome, עשויות להיות השלכות חשובות לשידור הפתוגן. ראיות רבות עכשיו תומך קביעה זו, עם דוגמאות הדגמת קישור בין וקטור microbiome הקוד עבור מחלות כמו מלריה, Zika וירוס ומחלת ליים1,2,3. עם זאת, לתרגם את הממצאים הללו לאסטרטגיות לבקרת מחלות דורש הבנה הרבה יותר מפורטת של מבנה, תפקוד, מקורם של וקטור microbiomes. זיהוי ואפיון של הקהילה מיקרוביאלי וקטור תחת משתנה תנאים אקולוגיים וניסויים מהווים נתיב חשוב קדימה בתחום זה.
הליך של זיהוי תושבי מיקרוביאלי וקטור הפתוגן מסופק כאן על ידי ניצול המערבי שחור-רגלי השניה, Ixodes pacificus, זן וקטור של המחלה מחלת ליים Borrelia burgdorferi. בעוד קרציות הנמל סוגים נוספים של פתוגנים האנושית מאשר כל פרוקי-רגליים, יחסית מעט מאוד ידוע על האקולוגיה ביולוגיה והקהילה של שנתות microbiomes4. זה מתבטא קרציות הנמל מערך מגוון של וירוסים, חיידקים, פטריות, protozoans, הכוללים commensals, endosymbionts ו-5,תושבים מיקרוביאלי ארעי4. עבודה מוקדמת הוכיחה וריאציות חזקה ב- microbiomes Ixodes המשויך גאוגרפיה, מינים, מין, שלב חיים וארוחת דם מקור6,7,8. עם זאת, המנגנונים וריאציה זו עדיין לא ידועים ומתחייב שמפורט יותר חקירות של המקור והרכבה של קהילות אלה חיידקים. קרציות יכול לרכוש חיידקים באמצעות שידור אנכי, קשר עם מארחים, ספיגת מן הסביבה דרך spiracles, הפה, נקבובית אנאלי9. הבנת הגורמים בעיצוב את היווצרות ראשונית והפיתוח של microbiome שנתות, במיוחד את התרומה היחסית של השידור האנכי וסביבתיים, חשוב להבנת דפוסי הטבעי של וריאציות של שנתות microbiome המגוון ואת האינטראקציה של קהילות אלה במהלך השידור הפתוגן, עם היישומים האפשריים כדי לשלוט במחלה או וקטור.
טכניקות מולקולריות רבי עוצמה, כגון הדור הבא רצפי, כעת קיים לזיהוי קהילות מיקרוביאלי, יכול להיות מועסק כדי לאפיין וקטור microbiomes תחת מגוון תנאים סביבתיים או ניסיוני. לפני כניסתו של גישות אלה רצף תפוקה גבוהה, זיהוי חיידקים הסתמך בעיקר על מיקרוסקופ ותרבות. בעוד מיקרוסקופ היא טכניקה מהירה וקלה, מורפולוגיים שיטות לזיהוי חיידקים הם מטבעם סובייקטיבי, גס, מוגבל על-ידי רגישות נמוכה, זיהוי10. שיטות מבוססות-תרבות נמצאים בשימוש נרחב עבור זיהוי חיידקים והוא יכול לשמש כדי לקבוע את הרגישות של חיידקים סמים טיפולים11. עם זאת, שיטה זו סובל גם רגישות נמוכה, כאשר ההערכה היא כי פחות מ 2% של הסביבה חיידקים יכולים להיות תרבותי במעבדה הגדרת12. גישות מכתימים היסטולוגית יש גם כבר מועסקים לזהות לשפה חיידקים ספציפיים בתוך וקטורים, לאפשר חקירות של הפצות שונות taxa בתוך השניה ושל לימוד היפותזות על אינטראקציות מיקרוביאלי. עם זאת, ידיעה מוקדמת זהות מיקרוביאלי נדרש לבחירת שהכתמים המתאים, ביצוע גישה זו נועד עבור זיהוי ואפיון מיקרוביאלי. יתר על כן, צביעת היסטולוגית הוא תהליך מאוד אינטנסיבית, מייגעת, אינה סקיילבילית טוב עבור מדגמים גדולים. הגישות המסורתיות מולקולרי כגון סנגר רצף מוגבלות באופן דומה שלהם רגישות וזיהוי של קהילות מיקרוביאלי מגוונות.
הדור הבא רצפי מאפשר זיהוי מהיר של חיידקים מן מספר רב של דוגמאות. הנוכחות של גנים הסמן הרגיל ומאפשר התייחסות מסדי נתונים נוספים משופרת ברזולוציה בטקסונומיה, לעיתים קרובות לשלב סוג או מין. יחידת משנה קטנים ribosomal RNAs משמשים לעתים קרובות כדי להשיג מטרה זו, עם 16 rRNA להיות הנפוצה ביותר בשל נוכחותם של אזורים שנשמרת ומשתנה בתוך הגן, המאפשר היצירה של צבעי בסיס אוניברסלי עם amplicons ייחודי עבור כל בקטריאלי מינים13,14. דו ח זה מפרט הליך של זיהוי taxa, microbiome שנתות באמצעות מטוסי אף-16 rRNA הדור הבא רצפי. בפרט, פרוטוקול זה מדגיש את השלבים הכרוכים בהכנת הדגימות רצף. כללית יותר פרטים על הרצף ומסופקים שלבים ביואינפורמטיקה, שכן ישנם מגוון רחב של פלטפורמות רצף ניתוח תוכניות זמין כעת, כל אחד עם קיים תיעוד נרחב. הכדאיות הכוללת של גישה זו הדור הבא רצפי מומחש החלתו על חקירה של הקהילה מיקרוביאלי הרכבה בתוך וקטור מחלת מפתח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סמן אוסף ועיקור משטח
- לאסוף קרציות על-ידי גרירת מטלית2 לבן 1 מ' על גידול הקשורים שנתות, הסרת קרציות אלו המארח מינים, או לגידול מתקתק ב ה15,מעבדה16. להשתמש מלקחיים בסדר כדי לתפעל קרציות ואחסן אותם ב- 80 ° c
- הכנס קרציות בודדות המבחנות ולהסיר לכלוך משטח מאת vortexing 15 s במרוכז עם 500 μL של מי חמצן (H2O2), 70% אתנול ddH2O.
- למקם את הקרציות צינור PCR, לאפשר להם מילה נהדרת...
- . בצינור הזה, לשבש באופן מכני שנתות רקמות ע י השמדת את צבת ומכתש (השתמשו במחקר זה), באמצעות חרוזים קטנים במכה חרוז, או לחתוך את תקתוק בנפרד עם אזמל.
2. טיהור DNA
- לטהר את הדנ א של קרציות בודדות, ביצוע ההוראות בערכה החילוץ של ה-DNA זמינים מסחרית. Elute עבור אמצעי אחסון הסופי של 100 μL.
הערה: עיין באיור 1 לקבלת סקירה כללית של צעדים 2.2 – 2.8. שיטות הוצאה אלטרנטיבית כוללות פנול-כלורופורם החילוץ17,18, אתנול משקעים19או חילוץ עם גשמי20,chelating21. - לאשר מוצלחת טיהור DNA באמצעות fluorometer או ספקטרופוטומטרים. עבור fluorometry, להשתמש μL 10 של תבנית ה-DNA 190 assay DNA גדילי כפול μL. התשואה הצפויה היא 0.1-1.0 ng/μL22. ספקטרופוטומטר, להשתמש μL 1 של תבנית ה-DNA של כימות חומצות גרעין. היחס A260/280 הצפוי הוא כ 1.823.
- אם לא מיד שימשיך הגברה, לאחסן את הדגימות ב-20 ° C.
3. 16 rRNA ג'ין הגברה
- להגדיר את אמפליקון PCR ב תגובה 27.5 μL המכיל: 5 μL של כל תחל ב- 1 μM; ΜL 12.5 של מיקס PCR זמינים מסחרית; μL 5 של DNA מופק קרציות בודדות-ריכוז 5 ng/μL.
הערה: השתמש תחל את הבאים עבור הגברה של האזור V3-V4 hypervariable של מטוסי אף-16 rRNA ג'ין13:
5' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3 אינץ ',
5 - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3' ' - להעביר צינורות thermocycler מתוכנת: דנטורציה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 25 מחזורי 1) 95 ° C ל 30 s, 2) 57 ° C ל 30 s, 3) 72 ° C ל 30 s; סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 5 דקות; והחזק הסופי ב- 10 מעלות צלזיוס.
- ברגע נעשה את ה-PCR, דמיינו את המוצר PCR על-ידי טעינת 4-6 μL/לדוגמה ב- 1.5% agarose ג'ל. מחפש להקה. 460 bp כדי לאשר הגברה.
הערה: אמפליקון PCR מוצר עשוי לא להיות גלוי על הג'ל אם ריכוז מדגם נמוכה מדי (< 10 ng). פריימר דיימר נוכחות נפוץ בדגימות ריכוז נמוך. אם קיימות להקות אחרות שאינן-יעד, להתאים את טמפרטורת מחזק או להקטין את מספר מחזורי. - אם לא ממשיכים מיד לתחנת טיהור, לאחסן את הדגימות-4 מעלות צלזיוס.
4. 16 אמפליקון טיהור
- באמצעות צינור PCR עבור כל דגימה, לשלב את המוצר PCR עם ddH2O להשיג הכולל 60 μL. לקבלת דוגמאות עם ריכוזים נמוכים של ה-DNA, לבצע אמפליקון PCR שהפקידים כדי להפחית הגברה הטיה מאגר דגימות להתרכז.
- להביא חרוזים פאראמגנטיים בטמפרטורת החדר ו מערבולת שאותם היטב לפני השימוש.
- להוסיף μL 48 של חרוזים פאראמגנטיים 60 μL של המדגם, תקופת דגירה של 5 דק. לנקות את הצינורות על מתלה מגנטי במשך 5 דקות עד פתרון הופך את המקום. הסר את תגובת שיקוע.
הערה: במכלול זה חרוז מטרות ההסרה של הדימרים פריימר (< 60 bp). במידת הצורך, התאם את הריכוז חרוז כדי להסיר סימון שאינם ספציפיים אחרים. - עם צינורות על מתלה מגנטי, להוסיף 500 μL של טריות 80% EtOH. מיד לאחר הוספת EtOH לכל הצינורות, פיפטה החוצה הנוזל. אל תסיר את החרוזים. חזור על תוספת EtOH והסרה עוד פעם אחת.
- מילה נהדרת את הדוגמאות כדי להסיר עודפי EtOH על ידי השארת הצינורות פתוחים על מתלה מגנטי במשך 5 דקות, או עד סדקים קטנים הגלויות בהחרוזים...
- הוסף 20 μL טה המאגר, דגירה בדגימות את המגנט, בטמפרטורת החדר, למשך 5-10 דקות.
- במקום הצינורות בחזרה על המגנט. ברגע חרוזים ונוזלים מופרדים, להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים כדי לקבל את המוצר PCR נקי.
- (אופציונלי) דמיינו את המוצר כדי לאשר טיהור אמפליקון מוצלחת על-ידי טעינת 4-6 μL/לדוגמה ב- 1.5% ג'ל. הלהקה bp 460 צריך להיות גלוי, צריך להיות אין פריימר דיימר.
- אם לא ממשיכים מיד לאינדקס PCR לאחסן את הדגימות 4 ° C.
5. לטעום Barcoding וטיהור
- להקצות שילובים ייחודיים פריימר כל דגימה על-ידי בחירת תחל קדימה או אחורה, או את שתיהן, ערכה אינדקס ספריית זמינים מסחרית.
הערה: באופן ייחודי תיוג דגימות מאפשר בידול לאחר רצף. ערכות מספקים בדרך כלל מספיק תחל את רצף דגימות 96-384. - לצרף את צבעי בסיס כפול, או מדדי, דוגמאות על-ידי ביצוע PCR בתגובה 25 μL המכילה 2.5 μL של כל פריימר (N7xx ו- S5xx), 12.5 μL של זמינים מסחרית PCR מאסטר מיקס, 5 μL של ddH2O, ו- 2.5 μL של המוצר אמפליקון נקי.
- לעבור הצינורות thermocycler מתוכנת: דנטורציה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 8-14 מחזורים של 1) 95 ° C ל 30 s, 2) 55 ° C ל 30 s, 3) 72 ° C ל 30 s; סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 5 דקות; והחזק הסופי ב- 10 מעלות צלזיוס.
- ברגע נעשה את ה-PCR, דמיינו את המוצר PCR על-ידי טעינת 4-6 μL/לדוגמה ב- 1.5% agarose ג'ל. מחפש להקה. 550 bp כדי לאשר הגברה.
הערה: השתמש בתוצאות ויזואליזציה להודיע תנאי הרכיבה של ה-PCR מדד. . תוריד את ספירת סבובי כדי להמתיק מחייב שאינם ספציפיים או הגדל את ספירת סבובי להשיג להקות גלויים עבור כל דגימה. - חזור על הפעולות לנקות ברשימה בשלב 4. כדי למנוע דילול במהלך ניקיון, לבצע אינדקס PCR כפילויות, בריכה המוצר כאן.
- אם לא מיד שימשיך ספריית כמת, נורמליזציה, לאחסן את הדגימות-4 מעלות צלזיוס.
6. ספריית כימות ונורמליזציה
- מעריכים את הריכוז של כל מוצר לבר-קוד מטוהרים, משלב 5.5 שימוש fluorometer או ספקטרופוטומטרים (ראה שלב 2.2). לדלל את הדגימות במאגר טה לקבל ריכוזים של 1 pM.
הערה: ספריית כמת יש צורך להשיג את הדוגמית מעמיסים ריכוז מומלץ עבור פלטפורמת רצף. ספריית כימות מושגת באמצעות qPCR, אך הערכת הריכוז מדגם לפני qPCR חוסך ריאגנטים וזמן. ריכוז 1 pM מומלץ להגדיל את הדיוק של ספריית כמת, כמו זה הריכוז אכזרי של הסטנדרטים qPCR הניתנים את ערכת כימות24. - ביצוע qPCR לתגובה 10 μL המכיל μL 6.0 של מיקס מאסטר qPCR (מתוך ספריית כימות קיט), μL 2.0 של ddH2O μL 2.0 של הדגימה או רגיל. הפעל כל דוגמה סטנדרטי דולר עבור ודיוק רב יותר. לרוץ כל מדגם ברמות דילול שלושה או יותר (למשל-, 0-1 pm, מאי 1 ו 22:00 עבור ריכוזים התחלה משוער) כדי להבטיח כימות מדויק.
הערה: מידע מפורט על תחל שסופקו ועל סטנדרטים ישתנו בהתבסס על ערכת כימות בשימוש והם זמינים בגליון נתונים טכניים של מוצרים. עיין בטבלה של חומרים עבור ערכת כימות השתמשו במחקר זה. - להעביר את qPCR בצלחת או צינורות מכשיר PCR בזמן אמת מתוכנת: דנטורציה הראשונית של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 35 מחזורי 1) 95 ° C עבור s 30 ו 2) 60 מעלות צלזיוס במשך 45-סופרן; צעד דיסוציאציה של 1) 95 ° C 15 s, 2) 60 ° C ל 30 s, ו- 3) 95 ° C 15 s.
- לחשב את הממוצע החל ריכוז עבור כל דגימה, באמצעות הערכים כימות המתקבל התוצאות qPCR ואת רמות הדילול מדגם בשימוש.
הערה: לדוגמה, ריכוז ממוצע של 14:00 עבור כוללות מדגם מדולל התשואות של הריכוז ההתחלתי המקורי של 200 ננומטר. אם אף אחת מרמות לדילול דגימה נתון נופל בתוך הטווח של עקומות סטנדרטי, כמת תוצאות וייתכן שלא תהיה מדויקת; בכל מקרה, לכוונן את רמות הדילול ולבצע מחדש qPCR. - לדלל כל מדגם לבר-קוד מטוהרים, 4 nM במאגר טה, מבוסס על ריכוז ממוצע שחושבו בצעד 7.5.
הערה: לדוגמה, ריכוז ממוצע מדגם של 200 ננומטר, שתדללו דוגמה 1:50 ב- TE מאגר להשגת ריכוז 4 nM. ריכוז דגימה מדויקת משתנים בהתאם מערכת רצף וערכת ריאגנט בשימוש. עיין במדריך למשתמש של מערכת רצף עבור הריכוז המומלץ ביותר. - צור ספריית משולב על-ידי הוספת נפחים שווים (בדרך כלל 5-10 μL) כל הספריות בודדים לתוך צינור יחיד.
הערה: כמו כל דוגמאות צריך להיות ב 4 nM ריכוז, הוספת נפחים שווים משיג על ריכוז שווה של כל הדגימות בספריה במאגר. - חזור על שלבים 6.2-6.4 על הספרייה המשולבת כדי לאשר את הריכוז nM 4.
- לחשב את הריכוז ספריה משולבת ו לדלל או מחדש מהווים גמר, במאגר הספריה באמצעות מאגר טריס לפי הצורך כדי להשיג 4 nM.
- אם לא ממשיכים מיד לתחנת טעינה הדגימה, לאחסן את הדגימות ב-20 ° C. לבצע רצף זמן קצר לאחר כימות כדי למזער את אובדן או שינויים DNA ריכוז במהלך האחסון.
7. ספריית דנטורציה, דילול, ולבצע רצף לרוץ (באותו יום)
- Denature הספרייה 4 nM המשולב משלב 6.9 עם NaOH.
הערה: השלבים הכנה ספריית הסופי להשתנות עבור כל מערכת רצף. עיין במדריך למשתמש של מערכת רצף עבור פרוטוקולים יותר מפורט, מעודכן. משתמשים חדשים כדי להתאמן על השימוש של פלטפורמת רצף או לשלוח שלהם ספריות למתקן רצף של הליבה. - לדלל את הספריה denatured לריכוז הרצוי טעינה באמצעות המאגר המסופק בערכה ריאגנט רצף (טבלה של חומרים).
הערה: טעינה אופטימלית ריכוזים משתנים בהתאם מערכת רצף בדרך כלל בטווח שבין 1-250 pM25. - Denature, לדלל את הפקד רצף.
הערה: הוספת פקד רצף מתקנת עבור רצף בעיות הנובעות ספריות המגוון נמוך. Denature הפקד רצף באמצעות NaOH, לדלל את ריכוז זהה כמו הספרייה. - לשלב את הספריה רצפי הבקרה.
הערה: היחס של רצפי בקרה לספריית משולב יהיה תלוי ספריית המגוון ואת מערכת רצף, אבל זה בדרך כלל 1:126. - לטעון את הספריה משולב ואת רצף התערובת שליטה על רצף זרימה התא.
8. אמפליקון רצף ניתוח
- להעריך את ההצלחה הכוללת של ההפעלה על ידי בחינת המדדים לרוץ על הסביבה מחשוב ענן המתאים למערכת רצף בשימוש.
הערה: המדדים לרוץ, כגון מספר הקריאות רצף, ישתנו בהתבסס על רצף פלטפורמה וערכת ריאגנט בשימוש. ערכי יעד עבור מערכות רצף נפוצות מפורטים בטבלה 1. - הורד את הנתונים הגולמיים רצף של תוכנת קוד-פתוח ביואינפורמטיקה להזמנה כמותית תובנות אקולוגיה מיקרוביאלית (QIIME)27 או Mothur28.
הערה: שניהם QIIME Mothur הם פתוח להורדה בחינם. הוראות מפורטות על שימוש בתוכניות אלה ניתן למצוא באינטרנט, מפורטים מספיק עבור משתמשים מתחילים. השלבים שלהלן מספקים סקירה רחבה של צינור ביואינפורמטיקה שנערך QIIME. היכרות עם פיתון לא הכרחי אבל יקל על היישום של קבצי ה-script הבא - ליצור ולאמת את קובץ מיפוי באמצעות קובץ ה-script "validate_mapping_file.py" ב- QIIME.
הערה: הקובץ מיפוי מכיל כל המטה-נתונים הדרושים לביצוע ניתוח נתונים, כולל זיהוי הדגימה, רצפים פריימר אמפליקון ותיאור מדגם. שלב האימות בודק את כל הנתונים הדרושים הוזן בתבנית מתאימה. - Demultiplex ולסנן רצפים באמצעות script "split_libraries.py" (איור 1).
הערה: קובץ script זה מקצה לבר-קוד קריאות דגימות בהתבסס על הצירופים פריימר אינדקס, מזהי מדגם קלט בקובץ המיפוי. היא גם מבצעת מספר איכות סינון צעדים כדי לשלוט על רצף שגיאה מבוסס על-ידי המשתמש גזור-offs ציון איכות מינימלי, רצף אורכי של סוף-זמירה. - להקצות יחידות מבצעיות בטקסונומיה (אוטוס) רצפים באמצעות קובץ ה-script "pick_open_references_otus.py".
הערה: בשלב זה, רצפים מקובצים נגד אוסף רצף הפניה בהתבסס על סף של זהות (בדרך כלל 97%). קורא אשר אינן תואמות את האוסף רצף ההתייחסות מקובצים אחד נגד השני. De novo והפניה סגור OTU איסוף אפשרויות זמינות גם, אבל פתוח-הפניה האיסוף מומלץ על-ידי מפתחים QIIME. - לנרמל את הטבלה OTU באמצעות לכתיב "alpha_rarefaction.py" או "normalize_table.py".
הערה: שלב זה מתקן עבור וריאציה סכומי עמודה, או רצף הכולל הקראה עבור דגימה, הנובעים טכנולוגיות רצף מודרני. נורמליזציה יכול להתבצע באמצעות rarefaction מסורתיים, או באמצעות שיטות אלטרנטיביות כגון שינוי גודל הסכום המצטבר. - לבצע מספר אלפא-המגוון בטא-המגוון, ניתוחים גיוון בהרכב בטקסונומיה בעת ובעונה אחת באמצעות קובץ ה-script "core_diversity_analysis.py".
הערה: לחלופין, ניתוחים אלה ניתן להפעיל בנפרד באמצעות קבצי ה-script בודדים (למשל, "alpha_diversity.py").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סך של קרציות 42 מביצה נפרדים שלושה מצמדים, שתי תקופות החשיפה הסביבתית, 0 ו- 2 שבועות, באדמת עובדו על רצף microbiome. . קבוצת כל טיפול, נחשבת אחת מצמד וחשיפה זמן, הכיל 6-8 לשכפל דוגמיות שנתות. תמציות שנתות מעובדים אלה העלו ברצף הדור הבא, הניב 12,885,713 קריאות לזווג-end עובר סינון. כלל בהפעלה זו היו 3 פקדים שלילי מן השלב החילוץ, מניב סכום כולל של קריאות 211,214 (כלול במונה הקודם). בהמשך מדדי איכות לרוץ יחד עם ערכי האופטימלי עבור כל מדד מפורטים בטבלה מס ' 2. Rarefaction עקומות, אשר מתייחסות רצף מאמץ מספר אוטוס לדגימה, ציינו כי רצף עומק, או מספר רצף ייחודי קורא לכל דגימה, הקריאות 2,129 יהיה מספיק כדי שלמאחה ללכוד את המגוון של (הקהילה מיקרוביאלי איור 2). רמות rarefaction ישתנו בהתבסס על סוג הדגימה, צריכה להיקבע בנפרד על כל רצפי לרוץ. לאחר קרבי לעומק כזה, אוטוס 1,714 אותרו בכל הדוגמאות עם ממוצע של 93.3 אוטוס ± 4.3 לדגימה. כדי למנוע ניתוח במורד הזרם היו בעיות הנובעות מ מטריצות דליל ועד הסרת מזהמים פוטנציאליים, אוטוס כל לא נמצא מדגם אחד לפחות אצל ≥ 1% שפע איחדו לקטגוריה כללי נדיר. יתר על כן, החבילה decontam R היה מנוצל כדי לזהות אוטוס יתר ייצג בפקדים שלילי ביחס דוגמאות אמיתיות, אוטוס אלו הוסרו מניתוח במורד הזרם.
קהילה אקולוגיה ניתוחים בוצעו באמצעות גיוון QIIME ניתוח זרימת העבודה כדי להדגים את סוגי גיוון אלפא ביתא גיוון, טקסונומיה ההרכב המגוון פלט שנוצר באמצעות צינור ביואינפורמטיקה פשוטה. לדוגמה, ניתוח נקודות הציון העיקריות Unifrac משוקלל, unweighted הופקו באמצעות קובץ ה-script "core_diversity_analyses.py", הם חשפו קיבוץ באשכולות המרחבי של קרציות זחל בהתבסס על זהות מצמד (איור 3). Boxplots של OTU נחשב שונים חשיפה סביבתית פעמים נוצרו גם באמצעות קובץ script זה, הממחיש את ההבדלים בין עושר מינים microbiome לאורך זמן (איור 4). אלה ניתוחים גיוון של אלפא, בטא מבוצעות בהתבסס על הקטגוריות על-ידי המשתמש המפורטות בקובץ מיפוי, אך דמויות ונתונים סטטיסטיים על מידע טקסונומי כללי נוצרים גם עבור כל הדגימות (איור 5).
איור 1 : Microbiome רצף זרימת. שלבים עיקריים של זרימת העבודה רצף microbiome מוצגות עם הסברים עבור ספריית הכנה ורצף ניתוח השלבים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : Rarefaction עקומות עבור רצף לספור נורמליזציה. עקומות rarefaction, המוצג עבור כל קוהורטה של קרציות, מתייחסים ספירות OTU נצפתה דגימה מאמץ. קווי שגיאה הן נמצאות כתוצאה מתנה בתוך כל מצמד שכפל דגימות, הן מציינות סטיית תקן אחת. יש לבחור רצף לעומק או מעבר לנקודה שבה עקומת הופך יציב כדי שלמאחה ללכוד את המגוון המלא של אוטוס. . הנה, לעומק רצף של קריאות 2,000 מופיע המתאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : המנהל לתיאום ניתוח על ידי המצמד. Unweighted Unifrac העיקרי קואורדינטות ניתוח (PCoA) מציגה וריאציה בהרכב microbiome בין תקתוקי הזחל מאחר תיקי ומ מבוגרים. כל נקודת נתונים מציין של קרציות בודדות. איור זה נוצר באופן אוטומטי באמצעות קובץ ה-script "core_diversity_analyses.py" QIIME. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : אלפא boxplots גיוון בזמן חשיפה. Boxplots המתארים OTU נחשב וריאציה הצג קבוצות החשיפה הסביבתית בשונות מיקרוביאלי לאורך זמן. איור זה נוצר באופן אוטומטי באמצעות קובץ ה-script "core_diversity_analyses.py" QIIME. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : מערכה ברמת זיהוי חיידקים עבור מצמד אחד. Microbiome הרכב עבור שנתות בודדים דגימות מצמד אחד מוצג ברמת מערכה. דמות זו, כמו גם מידע סיכום ברמות נמוכות בטקסונומיה, נוצר באופן אוטומטי באמצעות קובץ ה-script "core_diversity_analyses.py" QIIME. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מדד | הגדרה | התוצאות שלנו (MiSeq V3) | אופטימלי MiSeq V3 | אופטימלי עבור מצב מהירה HiSeq | |
| קורא PF | מספר רצף קורא להעביר את המסנן צניעות. קריאה עובר סינון אם השיחה הבסיס לא יותר מ 1 יש ערך הצניעות מתחת 0.6 במחזורי ראשון 25 | 12,885,713 | 14-16 מיליון | 600 מיליון | |
| שיעור שגיאה | אחוז בסיסי זוגות בשם שגוי במהלך מחזור, בהתבסס על קריאות המיושר PhiX שליטה | 3.28 ±0.10 | תלוי ערכים עבור מדדים אחרים | תלוי ערכים עבור מדדים אחרים | |
| % ≥Q30 | אחוז בסיסים עם ≥ הציון Q 30, המעידים על דיוק הקריאה הבסיס של 99.9% | 68.94 | > 70% | > 80% | |
| אשכול PF (%) | האחוז של אשכולות עובר את המסנן צניעות. | 85.61 ±0.81 | 90% | 90% | |
| צפיפות | צפיפות של אשכולות על flowcell - מדד המפתח של איכות הנתונים, פלט | אשכול ± 35 552/ממ... ^ 2 | 1200-1400 מ"מ/האשכול ^ 2 | 850-1000 מ"מ/האשכול ^ 2 | |
טבלה 1: מפתח הביצועים הפרמטרים עבור הגדרות פלט. נתוני המשתמש וערכי היעד דיווחה בהתבסס על רצף פלטפורמה, ריאגנט הערכה בשימוש במחקר זה (טבלה של חומרים) תוספת שליטה רצף 25%.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רצף הדור הבא של מטוסי אף-16 rRNA להפוך בגישה סטנדרטית לזיהוי חיידקים, התומך חקר כיצד וקטור microbiomes להשפיע על השידור הפתוגן. פרוטוקול שמפורטות כאן פרטים על השימוש בשיטה זו כדי לחקור את מכלול קהילה מיקרוביאלי אני pacificus, זן וקטור עבור מחלת ליים; עם זאת, ניתן בקלות להחיל אותה ללמוד שנתות מינים או וקטור arthropod מינים אחרים.
אכן, רצף rRNA מטוסי אף-16 עבור ניתוח microbiome שימש בהרחבה ללמוד את microbiomes של וקטורים כולל יתושים, psyllids וביתושים29,30,31. שיטות אחרות זמינים עבור זיהוי חיידקים בתוך וקטורים כוללים מיקרוסקופ culturing, צביעת היסטולוגית. שיטות אלה עשוי להיות מתאים יותר מאשר רצף אם המטרה היא לזהות, לתאר את חיידק הרומן (מיקרוסקופ), להעריך את השפעת סמים מיקרוביאלית (תרבות), או בתרגום חיידקים ספציפיים וידועים בתוך וקטור (צביעת היסטולוגית). עם זאת, שיטות אלה סובלים ירידה לפרטים נמוך, זיהוי ומדרגיות, ובכך מתאימים פחות עבור זיהוי הקהילה מלאה של חיידקים בתוך וקטור או אפיון וקטור microbiome תחת משתנים אקולוגיים וניסויים תנאים. לעומת זאת, תפוקה גבוהה רצף של הגן rRNA מטוסי אף-16 מאפשר זיהוי של חיידקים נמוך-שפע, שאינן-culturable מספק רזולוציה גבוהה וזיהוי ניתנה התייחסות מקיפה מסדי הנתונים, יכול לספק שכפול גבוה בהתאם על כיסוי הצרכים.
בעוד 16 rRNA רצף עכשיו בשימוש נרחב עבור זיהוי חיידקים, טכניקה זו אינה ללא מגבלות. ב־1995, זיהום מיקרוביאלי ניתן לטשטש פרשנות של תוצאות רצף, וחיסול משמעות ביולוגית32. יתר על כן, שגבה את השימוש תחל חיידקי אוניברסלי ורגישות נמוכה החל ריכוזים הטבועות על רצף rRNA מטוסי אף-16, זיהום מיקרוביאלי היא נפוצה32. מקורות זיהום כוללות PCR ריאגנטים, ערכות חילוץ דנ א, מעבדה משטחים, העור ואת הבגדים של חוקרים33,34,35. ניתן למזער את ההשפעות של חיידקים מזהמים על-ידי עבודה בסביבת מעבדה סטרילי, באמצעות פקדי שלילי ומשוכפלת טכני, ומשמשת לשמור תיעוד של כל ערכות של ריאגנטים36.
בנוסף זיהום מיקרוביאלי, פלט באיכות נמוכה רצף יכול לעכב באופן משמעותי את השימושיות של microbiome רצף נתונים. איכות הנתונים יכול להיות מוערך על ידי מספר מדדים ריצה כולל מספר הקריאות עובר סינון, האחוז של קריאות מעל Q-ציון (מידת ההסתברות החזוי של שגיאה ב- base-טלפון) של 30 ואשכול צפיפות. ערכים עבור מדדים אלה משתנים בהתאם במספר הדגימות לרוץ, מערכת רצף הדיו ריאגנט, האחוזים רצף שליטה בשימוש, אך אופטימלית ערכים בהתבסס על תנאי ריצה זמינים באינטרנט. בפרט, אשכול צפיפות, המספר של ספריית אשכולות על מטוס נתון של התא זרימה לפני רצף, הוא פרמטר מפתח אופטימיזציה של איכות הנתונים ועם תשואה. גם מעל וגם מתחת בתצורת אשכול ניתן להפחית את נתוני הפלט, לגרום בדגימות מורחק מן ניתוח בשל כיסוי לא מספיק. אשכול המסכן צפיפות משקף לעתים קרובות ספריה לא מדויק כמת; לכן, כדאי לשים לב לביצוע נאות לנקות DNA כימות מדגם בודדים, כימות ספריה שלמה.
בהנחה איכות הנתונים גבוהה ועם תשואה מושגות, גישות מתבדרת בניתוח נתונים המשמש כדי להתגבר על האתגרים סטטיסטי של אלגוריתמית להוות מגבלה נוספת של גישה זו. לדוגמה, שיטות מרובות קיימים כדי כתובת וריאציה של ספירת קריאה בין הדגימות. Rarefaction, אשר כרוך תת דגימה קריאות כדי להשיג עומק של רצף שווה בכל הדוגמאות, משמש לעתים קרובות, אבל היתה נתונה ביקורת לאחרונה על בזבוז כמויות גדולות של נתונים הבחירה הסובייקטיבית של רצף מינימלי עומק37 38, ,39. סכום מצטבר קנה מידה (CSS), אילו שומרת כל רצף קורא אבל שוקל אותם בהתבסס על הסכום המצטבר של ספירת בתוך. באחוזון נתון, פותחה כמו טכניקה חלופית. עם זאת, CSS לא אומצה באופן נרחב בשל החדשנות היחסי שלה ואת התועלת מאושרות של rarefaction עבור נרמול לפני ניתוחים נוכחות/היעדרות.
תהליכי ניתוח נתונים רגיל גם חסר רצף קריאות בפקדים שליליים הטיפול, הבחנה אלה מן השפע נמוך קריאות. כאמור, קביעת רצף שלילי פקדים שנוצרו מהשלב מיצוי הדנ א מומלץ כדי לעזור להבדיל וקטור נכון microbiome תושבים חיידקים מזהמים במהלך ניתוח. ובכל זאת, בגישה סטנדרטית קפדני סטטיסטית לזיהוי וסינון מזהמים חשד לוקה בחסר. גישה משותפת היא להסיר אוטוס נוכח הפקדים שלילי כל הדגימות. עם זאת, שיטה זו עשויה להיות שמרנית מדי מאז רבים של החיידקים האלה סביר שמקורם דוגמאות אמיתיות ולא ערכת ריאגנטים40. טכניקה נפוצה אחרת כרוכה קיבוץ חיידקים נוכח < 1% לקטגוריה "נדיר" תחת ההנחה כי חיידקים מזהמים נדירים דוגמאות אמיתיות8,41. עם זאת, שיטה זו ניתן להסיר וקטור נכון חיידקים שנמצאים ב- abundances נמוך, במיוחד כאשר microbiome נשלטת על ידי אנדוסימביוזה כפי שניתן לראות pacificus ט וט holocyclus7,42. במקרים אלה, זיהוי חיידקים נדירות ידרוש רצף עמוק יותר, פיתוח תחל המעכבות ההגברה של אנדוסימביוזה במהלך ה-PCR אמפליקון42או שהמפתחות הסרת את אנדוסימביוזה במהלך ניתוח רצף 7-בחירה בין שיטות לכתובת נדיר השונים, מזהם אוטוס יוצר ההזדמנות עבור הסובייקטיביות ודעות קדומות בניתוח נתונים microbiome, אשר עשוי להגביל את היכולת להשוות תוצאות מעבר ללימודים.
הבחירה של ההפניה במסד נתונים, הכרחי עבור הקצאת טקסונומיה ומידע פילוגנטי קוראת ברצף, מציג הזדמנות נוספת עבור התבדרות הסובייקטיביות. בעוד המשימה של הנוגעים רצף קריאות מאזור הגן המשתנה הגנום האב שזוהה הוא מטבעו מאתגר, מסד נתונים אמין הפניה חיוני למשימה פילוגנטי מדויק. מספר מסדי נתונים הופיעו כדי לעמוד באתגר זה, כגון סילבה43, Greengenes44, RDP45NCBI46. סילבה הוא הגדול מיונים המבוסס על מטוסי אף-16, אבל סילבה, וכן RDP, רק מספק מידע טקסונומי עד לרמת סוג. Greengenes מספק מידע ברמת המין, כלול בחבילות ניתוחים metagenomic כמו QIIME, אבל זה לא עודכן כבר מעל 4 שנים. NCBI, תוך כדי לא מקור למידע בטקסונומיה, מספק יומי מעודכן סיווגים של רצפי שהמשתמש, אבל זה uncurated. בעת בחירה בין מאגרי המידע תלוי בדרך כלל צורכי המשתמשים לגבי הרזולוציה, כיסוי, מטבע, יש השפעה משמעותית על הקצאה פילוגנטי ועל ניתוח במורד הזרם47,48. הסכמה בין החוקרים לגבי מאיזה מסד נתונים התייחסות לשימוש הכרחי ובכך להימנע ההטיה נוספים בתחום ניתוחים.
גישות רגיל לאתגרים עיבוד הנתונים הללו יתעוררו כנראה כמו מטוסי אף-16 rRNA רצף הופך להיות טכניקה נפוץ יותר ויותר. המשך הפחתות רצף עלויות וזמן פופולרי נוסף בשיטה זו. בשימוש מוגבר של טכנולוגיה זו תאפשר חקירות עמוק יותר לתוך הרכב ואת האקולוגיה של וקטור microbiomes בתנאים מגוונים. כמו ידע בביולוגיה microbiome וקטור הוא עדיין בחיתוליו, סוגים אלה של תיאורי מחקרים הם צעד ראשון חיוני שקדמו ניסיונות למנף את microbiome כאמצעי שליטה וקטור. עם זאת, כדי באמת להבין את התפקיד של microbiome הפתוגן בשידור, זיהוי חיידקים חייבים להיות יחד עם הידע של תפקיד פונקציונלי של החיידקים האלה. רצפי RNA וגישות transcriptomic, בהם מעורבים מיפוי וכימות ביטוי גנים, לאפשר מסקנות את תפקיד פונקציונלי של חיידקים אבל דורשים רצף עמוק, ערוך בשלמותו הגנום של מינים היעד. עקיפת אלה אתגרים, כלים חישוביים לחזות הרכב פונקציונלי של מטוסי אף-16 rRNA רצף נתונים לאחרונה פותחו אבל הם לא אימצו אותו באופן נרחב כבר49. בפיתוח של כלים כאלה, כמו גם תיאוריה אקולוגית, קישור זהות מיקרוביאלי ואת תפקיד פונקציונלי בתוך וקטורים יגדיל את התועלת של מטוסי אף-16 rRNA רצף נתונים במחקרים microbiome וקטור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית מעניקה A.S. (דב #1427772, 1745411, 1750037).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Item | Name of Material/Equipment | Company | Catalog # |
| 1 | DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 |
| 2 | Qubit 4 Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | Magnetic Rack | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE buffer | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 mM Tris-HCl with 0.1% Tween 20 | Teknova | T7724 |
References
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia reduces transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Scientific Reports. 6 (July), 1-7 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the Lyme disease spirochete. Cell Host and Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Clay, K., Fuqua, C. The Tick Microbiome: Diversity, Distribution and Influence of the Internal Microbial Community for a Blood-Feeding Disease Vector. Critical Needs and Gaps in Understanding Prevention, Amelioration, and Resolution of Lyme and Other Tick-Borne Diseases: The Short-Term and Long-Term Outcomes. , Washington, D.C. October 11-12 1-22 (2010).
- Noda, H., Munderloh, U. G., Kurtti, T. J. Endosymbionts of Ticks and Their Relationship to Wolbachia spp. and Tick-Borne Pathogens of Humans and Animals. Applied and Environmental Microbiology. 63 (10), 3926-3932 (1997).
- van Treuren, W., et al. Variation in the microbiota of Ixodes ticks with regard to geography, species, and sex. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6200-6209 (2015).
- Swei, A., Kwan, J. Y. Tick microbiome and pathogen acquisition altered by host blood meal. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 11 (3), 813-816 (2017).
- Kwan, J. Y., Griggs, R., Chicana, B., Miller, C., Swei, A. Vertical vs. horizontal transmission of the microbiome in a key disease vector, Ixodes pacificus. Molecular Ecology. 26 (23), 6578-6589 (2017).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: The force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Houpikian, P., Raoult, D. Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: One laboratory's perspective. Emerging Infectious Diseases. 8 (2), 122-131 (2002).
- Kotsilkov, K., Popova, C., Boyanova, L., Setchanova, L., Mitov, I. Comparison of culture method and real-time PCR for detection of putative periodontopathogenic bacteria in deep periodontal pockets. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 29 (5), 996-1002 (2015).
- Wade, W. Unculturable bacteria - The uncharacterized organisms that cause oral infections. Journal of the Royal Society of Medicine. 95 (2), 81-83 (2002).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1-11 (2013).
- Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: Pluses, perils, and pitfalls. Journal of Clinical Microbiology. 45 (9), 2761-2764 (2007).
- Falco, R. C., Fish, D. A comparison of methods for sampling the deer tick, Ixodes dammini, in a Lyme disease endemic area. Experimental & Applied Acarology. 14 (2), 165-173 (1992).
- Patrick, C. D., Hair, J. A. Laboratory rearing procedures and equipment for multi-host ticks (Acarina: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 12 (3), 389-390 (1975).
- Köchl, S., Niederstätter, H., Parson, W. DNA extraction and quantitation of forensic samples using the phenol-chloroform method and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 297, 13-30 (2005).
- Wallace, D. M. Large- and small- scale phenol extractions. Guide to molecular cloning techniques. Berger, S. L., Kimmel, R. 18, Academic Press. Orlando. 33-41 (1987).
- Zeugin, J. A., Hartley, J. L. Ethanol Precipitation of DNA. Focus. 7 (4), 1-2 (1985).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques. 10, 506-518 (1991).
- Gariepy, T. D., Lindsay, R., Ogden, N., Gregory, T. R. Identifying the last supper: utility of the DNA barcode library for bloodmeal identification in ticks. Molecular Ecology Resources. 12, 646-652 (2012).
- Ammazzalorso, A. D., Zolnik, C. P., Daniels, T. J., Kolokotronis, S. O. To beat or not to beat a tick: comparison of DNA extraction methods for ticks (Ixodes scapularis). PeerJ. 3, 1-14 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- TaKara Bio. Library Quantification Kit: User Manual. , Mountain View, CA. (2018).
- Genohub. Cluster density optimization on Illumina sequencing instruments. , (2018).
- Fadrosh, D. W., et al. An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform. Microbiome. 2 (6), (2014).
- Caporaso, G. J., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75, 7537-7541 (2009).
- Duguma, D., et al. Developmental succession of the microbiome of Culex mosquitoes Ecological and evolutionary microbiology. BMC Microbiology. 15 (1), 1-13 (2015).
- Fagen, J. R. Characterization of the Relative Abundance of the Citrus Pathogen Ca. Liberibacter Asiaticus in the Microbiome of Its Insect Vector, Diaphorina citri, using High Throughput 16S rRNA Sequencing. The Open Microbiology Journal. 6 (1), 29-33 (2012).
- Geiger, A., et al. First isolation of Enterobacter, Enterococcus, and Acinetobacter spp. as inhabitants of the tsetse fly (Glossina palpalis palpalis) midgut. Infection, Genetics and Evolution. 9 (6), 1364-1370 (2009).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12 (1), 1-12 (2014).
- Rand, K. H., Houck, H. Taq polymerase contains bacterial DNA of unknown origin. Molecular and Cellular Probes. 4, 445-450 (1990).
- Grahn, N., Olofsson, M., Ellnebo-Svedlund, K., Monstein, H. J., Jonasson, J. Identification of mixed bacterial DNA contamination in broad-range PCR amplification of 16S rDNA V1 and V3 variable regions by pyrosequencing of cloned amplicons. FEMS Microbiology Letters. 219, 87-91 (2003).
- Mohammadi, T., Reesink, H. W., Vandenbroucke-Grauls, C. M., Savelkoul, P. H. Removal of contaminating DNA from commercial nucleic acid extraction kit reagents. Journal of Microbiological Methods. 61, 285-288 (2005).
- Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15, 564 (2014).
- Paulson, J. N., Stine, O. C., Bravo, H. C., Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods. 10 (12), 1200-1202 (2013).
- Weiss, S., et al. Normalization and microbial differential abundance strategies depend upon data characteristics. Microbiome. 5 (1), 1-18 (2017).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. Waste Not, Want Not: Why Rarefying Microbiome Data Is Inadmissible. Public Library of Science Computational Biology. 10 (4), (2014).
- Edmonds, K., Williams, L. The role of the negative control in microbiome analyses. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 23 (Suppl 1), (2017).
- Gall, C. A., et al. The bacterial microbiome of Dermacentor andersoni ticks influences pathogen susceptibility. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 10, 1846-1855 (2016).
- Gofton, A. W., et al. Inhibition of the endosymbiont "Candidatus Midichloria mitochondrii" during 16S rRNA gene profiling reveals potential pathogens in Ixodes ticks from Australia. Parasites & Vectors. , 1-11 (2015).
- Pruesse, E., et al. SILVA: a comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Research. 35, 7188-7196 (2007).
- DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB. Applied and Environmental Microbiology. 72, 5069-5072 (2006).
- Cole, J. R., et al. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research. 37, D141-D145 (2009).
- Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L. GenBank. Nucleic Acids Research. 34, D16-D20 (2006).
- Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. Public Library of Science Computational Biology. 6 (7), 19 (2010).
- Balvočiute, M., Huson, D. H., SILVA, R. D. P. Greengenes, NCBI and OTT - how do these taxonomies compare? BMC Genomics. 18 (Suppl 2), 1-8 (2017).
- Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
