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सीडी 8 + टी सेल सक्रियण के लिए कोशिकाओं को पेश अनिसोट्रोपिक बहुलक कृत्रिम प्रतिजन का निर्माण

Published: October 12, 2018 doi: 10.3791/58332
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2
1Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Ophthalmology, Oncology, Neurosurgery, Materials Science and Engineering, Chemical and Biomolecular Engineering, and the Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम जल्दी और reproducibly उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद जैविक रूप से प्रेरित, biodegradable articifical प्रतिजन पेश कोशिकाओं (aAPC) के साथ स्वरित्र आकार, आकार, और सतह प्रोटीन के लिए प्रस्तुति टी सेल विस्तार पूर्व विवो या vivo में .

Abstract

कृत्रिम प्रतिजन पेश कोशिकाओं (aAPC) प्रतिरक्षा मॉडुलन टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए अपने शक्तिशाली क्षमता के कारण के लिए एक होनहार मंच हैं । Acellular सब्सट्रेट सेल-आधारित aAPC पर प्रमुख लाभ प्रदान करते हैं, जिसमें संकेत प्रस्तुति पैरामीटर और aAPC सतह के भौतिक गुणों को टी कोशिकाओं के साथ अपनी बातचीत का नियमन करने के लिए सटीक नियंत्रण शामिल है । aAPC अनिसोट्रोपिक कणों, विशेष रूप से ellipsoidal कणों से निर्माण किया गया है, को और अधिक प्रभावी होने के लिए अपने गोलाकार समकक्षों से प्रेरित टी कोशिकाओं के कारण बढ़ बाध्यकारी और बड़ा सतह क्षेत्र टी सेल संपर्क के लिए उपलब्ध है, के रूप में अच्छी तरह से दिखाया गया है के रूप में कम विशिष्ट और बढ़ी pharmacokinetic गुण बढ़ाया । अनिसोट्रोपिक कणों में वृद्धि की रुचि के बावजूद, अनिसोट्रोपिक कणों जैसे पतली फिल्म टूटती पैदा करने के भी व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते तरीकों को लागू करने और reproducibly का उपयोग करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है ।

इस अंत करने के लिए, हम तेजी से, मानकीकृत निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन biodegradable अनिसोट्रोपिक कण के साथ aAPC आधारित स्वरित्र आकार, आकार, और संकेत प्रस्तुति के लिए टी सेल विस्तार पूर्व vivo या vivo में, के साथ तरीकों के साथ उनके आकार, आकृति विज्ञान, और सतह प्रोटीन सामग्री की विशेषता है, और उनकी कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए । अनिसोट्रोपिक aAPC के निर्माण के लिए यह दृष्टिकोण स्केलेबल और reproducible है, यह aAPC के लिए "बंद-the-शेल्फ" immunotherapies पैदा करने के लिए आदर्श बना ।

Introduction

वे एक मजबूत antigen-विशिष्ट T कक्ष प्रतिसाद जनरेट कर सकते हैं, क्योंकि कृत्रिम antigen प्रस्तुत कक्ष (aAPC) इम्यूनोमॉड्यूलेटरी एजेंट्स के रूप में वादा दिखाया है । इन प्लेटफार्मों के लिए आवश्यक अपनी कुशलता से टी सेल सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण संकेत मौजूद हैं । Acellular aAPC सेल-आधारित aAPC के लिए एक आकर्षक विकल्प हैं क्योंकि वे आसान और कम महंगा बनाना, स्केल-अप और अनुवाद के दौरान कम चुनौतियों का सामना करना, और सेल आधारित उपचारों के साथ जुड़े जोखिम को कम करना है । Acellular aAPC भी संकेत प्रस्तुति मापदंडों पर नियंत्रण के एक उच्च डिग्री के लिए अनुमति देते हैं और सतह के भौतिक गुण है कि टी कोशिकाओं के साथ इंटरफेस होगा1.

aAPC टी सेल सक्रियण के लिए आवश्यक दो संकेतों की एक ंयूनतम दोहराऊंगा चाहिए । संकेत 1 प्रतिजन मांयता प्रदान करता है और तब होता है जब टी सेल रिसेप्टर (TCR) पहचानता है और एक MHC वर्ग मैं या द्वितीय इसके cognate प्रतिजन असर, TCR परिसर के माध्यम से संकेतन में समापन के साथ संलग्न है । antigen विशिष्टता आवश्यकता को बायपास करने के लिए, aAPC सिस्टंस अक्सर CD3 रिसेप्टर, जो विशेष रूप से TCR जटिल उत्तेजित करता है के खिलाफ एक agonistic मोनोक्लोनल एंटीबॉडी भालू । MHC के रिकॉमबिनेंट रूपों, विशेष रूप से MHC multimers, भी aAPC की सतह पर इस्तेमाल किया गया है प्रतिजन विशिष्टता2,3प्रदान करते हैं । संकेत 2 टी सेल गतिविधि डायरेक्ट करता है कि एक costimulatory संकेत है । टी सेल सक्रियण के लिए आवश्यक costimulation प्रदान करने के लिए, CD28 रिसेप्टर आम तौर पर aAPC सतह पर प्रस्तुत एक agonistic एंटीबॉडी के साथ उत्तेजित है, हालांकि अन्य costimulatory रिसेप्टर्स जैसे 4-1BB सफलतापूर्वक4लक्षित किया गया है. सिग्नल 1 और 2 प्रोटीन आमतौर पर विश्लेषित aAPC को कठोर कणों की सतह पर मैटीरियल है । ऐतिहासिक, aAPC polystyrene4,5 और लौह dextran6सहित सामग्री की एक किस्म से गढ़े गए हैं । नए सिस्टम पाली की तरह biodegradable पॉलिमर का उपयोग (लैक्टिक-co-glycolic एसिड) (PLGA) aAPC है कि आसानी से प्रोटीन संकेत करने के लिए युग्मित किया जा सकता उत्पंन करने के लिए, vivo मेंप्रत्यक्ष प्रशासन के लिए उपयुक्त हैं, और की निरंतर जारी की सुविधा कर सकते है समझाया साइटोकिंस या घुलनशील कारकों टी सेल सक्रियण7,8बढ़ाने के लिए ।

आवश्यक संकेत प्रोटीन की उपस्थिति के अलावा, aAPC/टी सेल बातचीत के दौरान एक पर्याप्त बड़ी सतह क्षेत्र पर रिसेप्टर सगाई टी सेल सक्रियण के लिए आवश्यक है । इस प्रकार, आकार और आकार के रूप में aAPC के भौतिक मापदंडों काफी उनके उपलब्ध संपर्क क्षेत्र में परिवर्तन और उनके टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने की क्षमता को प्रभावित करते हैं । माइक्रोन-आकार aAPC अपने नेनो समकक्षों9,10से टी कोशिकाओं उत्तेजक में अधिक प्रभावी होना दिखाया गया है । हालांकि, नैनो-aAPC लिम्फ नोड्स है कि माइक्रो aAPC11पर vivo में उनके प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए बेहतर हो सकता है और अधिक वितरण जल निकासी हो सकती है । आकृति कण-आधारित aAPC सिस्टमों में रुचि का एक और चर है । अनिसोट्रोपिक aAPC हाल ही में कम गैर विशिष्ट कोशिका के साथ मिलकर लक्ष्य कोशिकाओं के साथ बढ़ाया बातचीत की वजह से, उत्तेजक टी कोशिकाओं पर आइसोट्रोपिक कणों की तुलना में अधिक प्रभावी होना दिखाया गया है । कोशिकाओं को तरजीही ellipsoidal कणों की लंबी धुरी को बांध, और वक्रता और चापलूसी सतह के बड़े त्रिज्या aAPC और टी सेल12के बीच अधिक संपर्क के लिए अनुमति देते हैं । ellipsoidal कणों की लंबी धुरी भी phagocytosis हतोत्साहित, में वृद्धि परिसंचरण समय में जिसके परिणामस्वरूप vivo प्रशासन12,13 में निंनलिखित गोलाकार कणों की तुलना में । इन फायदों की वजह से, ellipsoidal कणों की अधिक से अधिक विस्तार मध्यस्थता में प्रतिजन-विशिष्ट टी कोशिकाओं और इन विट्रो में गोलाकार कणों की तुलना में vivo , एक प्रभाव दोनों माइक्रो और nanoscales12पर मनाया, 13. वहां विभिंन रणनीतियों के लिए अनिसोट्रोपिक कणों बनाना है, लेकिन पतली फिल्म टूटती एक सरल, व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है विभिंन कण आकार14की एक श्रृंखला उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया विधि है । संश्लेषण के बाद, कणों फिल्मों में डाली और कण सामग्री के गिलास संक्रमण के तापमान के ऊपर एक तापमान पर एक या दो आयामों में फैला रहे हैं । फिल्म तो कणों को पुनः प्राप्त करने के लिए भंग है. अनिसोट्रोपिक कणों में बढ़ती रुचि के बावजूद, कण आधारित aAPC के निर्माण के लिए वर्तमान दृष्टिकोण ज्यादातर आइसोट्रोपिक प्रणालियों के लिए सीमित हैं, और कण आकार बदलने के तरीकों को लागू करने के लिए मुश्किल हो सकता है, कुछ aAPC संश्लेषण के साथ असंगत रणनीतियों, और कमी परिशुद्धता और reproducibility15। हमारी पतली फिल्म खींच तकनीक मैंयुअल रूप से या एक स्वचालित फैशन में प्रदर्शन किया जा सकता है तेजी से अनिसोट्रोपिक biodegradable पॉलिमर की एक किस्म से संश्लेषित कणों उत्पंन, एक या दो आयाम15में एक वांछित पहलू अनुपात को बढ़ाकर ।

हमारे पिछले काम के आधार पर, हम एक biodegradable कण आधारित स्केलेबल पतली फिल्म खींच प्रौद्योगिकी के साथ संयुक्त तेजी से स्वरित्र आकार और टी सेल विस्तार के लिए एक मानकीकृत फैशन में आकार के साथ aAPC उत्पंन करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित पूर्व vivo या में vivo. हमारे प्रोटीन विकार रणनीति एक वांछित घनत्व पर कण की सतह पर carboxyl समूहों के लिए ब्याज की किसी भी प्रोटीन (ओं) को जोड़ा जा सकता है, इस aAPC प्रणाली लचीलापन के एक उच्च डिग्री दे रही है । हम भी आकार, आकृति विज्ञान, और aAPC की सतह प्रोटीन सामग्री, और इन विट्रो मेंउनकी कार्यक्षमता का मूल्यांकन करने के लिए तरीकों का वर्णन । इस प्रोटोकॉल को आसानी से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का विस्तार पूर्व vivo या vivo में immunotherapeutic आवेदनों की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को जॉंस हॉपकिंस विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. स्वरित्र आकार के गोलाकार PLGA कणों का निर्माण

  1. कण संश्लेषण के लिए सामग्री की तैयारी
    1. 5% w/w polyvinyl अल्कोहल (PVA) समाधान तैयार करें ।
      1. एक चुंबकीय हलचल बार और ५०० rpm पर गर्म प्लेट सरगर्मी पर जगह और थर्मामीटर के साथ तापमान की निगरानी के साथ एक Erlenmeyer कुप्पी के लिए (DI) पानी की ५०० मिलीलीटर जोड़ें । वाष्पीकरण को रोकने के लिए टिनफॉईल के साथ कुप्पी कवर ।
      2. जब पानी का तापमान लगभग ७० डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है, समय के साथ छोटे बैचों में PVA के 25 ग्राम कुल जोड़ें, PVA अधिक जोड़ने से पहले भंग करने के लिए प्रतीक्षा कर रहा है ।
      3. सभी PVA (आमतौर पर 30-60 मिनट) भंग कर रहा है एक बार, समाधान शांत और बाँझ फिल्टर चलो । भविष्य में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    2. 10% w/w PVA और 2% w/w ग्लिसरॉल की फिल्म कास्टिंग समाधान तैयार करें ।
      1. एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ एक Erlenmeyer कुप्पी के लिए DI पानी की ५०० मिलीलीटर जोड़ें । कमरे के तापमान पर ग्लिसरॉल के 8 मिलीलीटर जोड़ें और trituration द्वारा मिश्रण ।
      2. ५०० rpm पर गर्म प्लेट सरगर्मी पर कुप्पी प्लेस और थर्मामीटर के साथ तापमान की निगरानी । वाष्पीकरण को रोकने के लिए टिनफॉईल के साथ कुप्पी कवर ।
      3. जब समाधान तापमान लगभग ७० डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है, समय के साथ छोटे बैचों में PVA की कुल ५० ग्राम जोड़ें, PVA को अधिक जोड़ने से पहले भंग करने के लिए प्रतीक्षा कर रहा है ।
      4. एक बार सभी PVA (आमतौर पर ६० मिनट) भंग कर रहा है, चलो समाधान शांत और बाँझ ०.२२ माइक्रोन का एक ताकना आकार के साथ एक बोतल टॉप वैक्यूम फिल्टर प्रणाली का उपयोग कर फिल्टर । भविष्य में उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर ।
    3. एक ५० मिलीलीटर 1% w/PVA समाधान तैयार करें । DI पानी की ४० मिलीलीटर और 5% PVA समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें (1.1.1 में बनाया) एक 100-150 मिलीलीटर चोंच के लिए ।
    4. एक १०० मिलीलीटर ०.५% w/w PVA समाधान तैयार करें । एक 150-250 मिलीलीटर चोंच के लिए ९० मिलीलीटर DI पानी और 5% की 10 मिलीलीटर PVA समाधान जोड़ें ।
    5. एक चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ें ०.५% PVA समाधान और जगह पर एक रासायनिक हुड में कमरे के तापमान पर एक हलचल प्लेट पर ५०० rpm ।
  2. Microparticle संश्लेषण
    1. बाहर वजन १०० पाली के मिलीग्राम (लैक्टिक-co-glycolic एसिड) (PLGA) एक जुटाना शीशी में और भंग में 5 मिलीलीटर की dichloromethane (डीसीएम) । भंवर PLGA को भंग करने के लिए ।
    2. ५० एमएल 1% PVA सॉल्यूशन में homogenizer प्लेस करें ताकि homogenizer बिना छुए ही यूरिन के नीचे जितना हो सके उतना ही क्लोज हो जाए । homogenizer चालू करें और वांछित गति को समायोजित करें-5 माइक्रोन व्यास कणों के लिए 3200 rpm, 3 माइक्रोन के लिए ५,००० rpm, 1 माइक्रोन के लिए १५,००० rpm (बढ़ती homogenization गति कण का आकार घटाता है) । एक बार वांछित गति पर, PLGA समाधान चोंच और homogenize 1 मिनट के लिए जोड़ें ।
    3. homogenization के बाद, 1% PVA, एक हलचल प्लेट पर १०० मिलीलीटर ०.५% PVA समाधान में PLGA microparticle समाधान डालो और एक रासायनिक हुड में विलायक वाष्पीकरण के लिए कम से कम 4 घंटे के लिए हलचल ।
    4. कणों को DI water में 3 बार धो लें ।
      1. ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में कण समाधान डालो और 5 मिनट के लिए ३००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant बाहर डालो और DI पानी की लगभग 20 मिलीलीटर जोड़ें ।
      2. भंवर द्वारा कणों resuspend । एक बार resuspend, शंकु ट्यूबों को भरने के लिए DI पानी के साथ ५० मिलीलीटर ।
      3. फिर उसी तरह दो बार धो लें ।
  3. Nanoparticle संश्लेषण
    1. PLGA के २०० मिलीग्राम एक जुटा शीशी में बाहर वजन और डीसीएम के 5 मिलीलीटर में भंग । भंवर PLGA को भंग करने के लिए ।
    2. बर्फ से भरे कंटेनर में ५० मिलीलीटर 1% PVA समाधान के साथ एक चोंच रखें । sonicator जांच को यूरिन में बिना छुए यथासंभव नीचे की ओर रखें । sonication शुरू और तुरंत चोंच में PLGA समाधान जोड़ें । 2 मिनट के लिए 12 डब्ल्यू के एक शक्ति के साथ Sonicate २०० एनएम के एक अनुमानित व्यास के साथ नैनोकणों उत्पंन करने के लिए ।
    3. sonication के बाद, 1% PVA, PLGA nanoparticle समाधान एक १०० मिलीलीटर ०.५% में एक हलचल प्लेट पर PVA समाधान डालो और एक रासायनिक हुड में विलायक वाष्पीकरण के लिए कम से कम 4 घंटे के लिए हलचल ।
    4. ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में कण समाधान डालो और microparticles को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए ३,००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant निकालें और उच्च गति केंद्रापसारक ट्यूबों में डालना ।
    5. कणों को DI water के साथ 3 बार धो लें । 15 मिनट के लिए ४०,००० x g पर केंद्रापसारक । बाहर डालो supernatant और भंवर द्वारा DI पानी में resuspend । फिर उसी तरह दो बार धो लें ।

2. स्वरित्र आकार के बहुलक कणों का निर्माण

  1. PLGA कणों तीन बार धोने के बाद, DI पानी की लगभग 1 मिलीलीटर में कणों resuspend । २.५ मिलीग्राम/एमएल कणों के अंतिम कण एकाग्रता के लिए कणों के लिए फिल्म कास्टिंग समाधान जोड़ें ।
  2. पिपेट में कण निलंबन 10 मिलीलीटर aliquots में ७५ x ५० mm आयताकार पेट्री व्यंजन के लिए एक आयामी खींच या में 15 मिलीलीटर aliquots में १०० x १०० mm स्क्वायर पेट्री व्यंजन के लिए दो आयामी खींच । या तो पिपेट या पक्ष को बुलबुले धक्का द्वारा बुलबुले निकालें और फिल्मों एक रासायनिक हुड में रातोंरात सूखी ।
  3. एक बार फिल्में सूख गई हैं, फिल्मों को चिमटी के साथ प्लास्टिक के व्यंजन से निकालें और कैंची से फिल्मों के किनारों को काट लें । गोलाकार कणों के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में किनारों को बचाने ।
    1. एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर एक फिल्म बढ़ते द्वारा स्वचालित पतली फिल्म डिवाइस खींच पर एक फिल्म लोड । 1 डी के लिए खींच, neoprene रबड़ के दो टुकड़ों के बीच में फिल्म के दो छोटे किनारों रखकर स्ट्रेचर (चित्रा 2) की एक धुरी के एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर फिल्म माउंट । एक एलन रिंच का प्रयोग, रबर के शीर्ष पर धातु पकड़ती पेंच जगह में फिल्म पकड़ । 2 डी खींचने के लिए, चार एल्यूमीनियम ब्लॉकों पर सभी चार किनारों माउंट करने के लिए दोनों अक्षों पर खिंचाव (1 चित्रा) ।
    2. माप और 2d खींच के लिए 1 डी खींच या दोनों अक्षों के लिए एक धुरी पर एल्यूमीनियम ब्लॉकों के बीच में फिल्म की लंबाई रिकॉर्ड । वांछित गुना-खिंचाव के आधार पर एक या दो दिशाओं में फिल्म खिंचाव करने के लिए आवश्यक दूरी की गणना.
    3. ९० डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में फिल्म खींच-लोड डिवाइस प्लेस और 10 मिनट से अधिक तापमान के लिए फिल्म ले आओ । एक बड़े यूरिन को ओवन में थोड़ी मात्रा में पानी के साथ लगाएं ।
    4. फिल्म खींचो ।
    5. जब खींच पूरा हो गया है, ओवन से खींच डिवाइस को हटाने और फिल्म 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान को शांत करते हैं ।
    6. 1 डी के लिए खींच, बाहर किनारों पर खींच डिवाइस के फिल्म काट । 2 डी खींचने के लिए, बाहर कट और फिल्म है कि समान रूप से दोनों अक्षों पर फैला है के केंद्र वर्ग को बचाने के लिए । शंकु ट्यूबों में फिल्मों के प्रति ट्यूब 2 फिल्मों के साथ प्लेस और फिल्म के बाकी छोड़ दें ।
    7. प्रत्येक शंकु ट्यूब और भंवर जब तक फिल्मों भंग कर रहे हैं के लिए लगभग 25 मिलीलीटर DI पानी जोड़ें ।
    8. एक बार फिल्मों में घुल-मिल जाने के बाद डीआई पानी से 3 बार कण धो लें ।
      1. microparticles के लिए, ५० मिलीलीटर के लिए शंकु ट्यूबों को भरने और 5 मिनट के लिए ३००० एक्स जी में केंद्रापसारक, बाहर supernatant डालना, DI पानी के लगभग 20 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और भंवर कणों resuspend करने के लिए ।
      2. नैनोकणों के लिए, उच्च गति केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए स्थानांतरण कणों और 15 मिनट के लिए ४०,००० x g पर केंद्रापसारक, बाहर डालना supernatant, DI पानी के लगभग 20 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और भंवर कणों resuspend करने के लिए ।
    9. तीसरे धोने के बाद, DI पानी की लगभग 1 मिलीलीटर में कणों resuspend । microcentrifuge ट्यूब के वजन रिकॉर्ड और ट्यूब के लिए कणों को जोड़ने । तरल नाइट्रोजन में 1 घंटे या फ्लैश फ्रीजर के लिए एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में कणों फ्रीज । एक बार जमे हुए, lyophilize कणों रातोंरात ।
    10. एक बार lyophilized, microcentrifuge ट्यूब में वजन कणों और lyophilized कणों के वजन का निर्धारण करने के लिए खाली ट्यूब का दर्ज वजन घटाना ।

3. सतह प्रोटीन विकार बनाने के कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं को पेश

  1. 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) बफर तैयार करें । पानी में एमईएस के ०.१ मीटर समाधान बनाओ और 1m सोडियम हीड्राकसीड (NaOH) के साथ अनुमापन द्वारा पीएच ६.० को समायोजित करें ।
  2. resuspend lyophilized PLGA/PBAE माइक्रो/नैनोकणों में 20 μg/एमएल द्वारा एमईएस बफर में भंवर । एमईएस बफर के ९०० μL के साथ एक microcentrifuge ट्यूब भरें और ट्यूब के लिए कण समाधान के १०० μL जोड़ें ।
  3. EDC/ भंग ४० मिलीग्राम 1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) और ४८ मिलीग्राम N-hydroxysulfoxuccinimide (एन एच एम) 1 मिलीलीटर एमईएस बफर में ।
  4. मिश्रण करने के लिए कणों और भंवर के लिए १०० μL EDC/
  5. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक पलटनेवाला पर ट्यूब मशीन ।
  6. 5 मिनट के लिए ५,००० x जी में microparticles नीचे स्पिन, या 5 मिनट के लिए १७,००० x g पर नैनोकणों । supernatant को त्यागें और 5 सेकंड (नैनोकणों) के लिए 2-3 W पर भंवर (microparticles) या sonicating द्वारा 1 एमएल पंजाबियों में पुनर्निलंबित ।
  7. microparticles के लिए, वांछित संकेत 1 प्रोटीन के 8 μg, और कणों के लिए 10 μg विरोधी माउस CD28 (क्लोन ३७.५१) जोड़ें । नैनोकणों के लिए, 16 μg सिग्नल 1 और 20 μg एंटी-माउस CD28 जोड़ें । १.१ मिलीलीटर के लिए ट्यूब में मात्रा लाने के लिए पंजाबियों जोड़ें ।
  8. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पलटनेवाला पर ट्यूब मशीन ।
  9. अगले दिन, कणों को धो लें । 5 मिनट के लिए ५,००० x जी में microparticles नीचे स्पिन, या 5 मिनट के लिए १७,००० x g पर नैनोकणों । supernatant त्यागें, और 5 सेकंड (नैनोकणों) के लिए 2-3 W पर भंवर (microparticles) या sonication द्वारा बाँझ पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में कणों resuspend । दोहराएं दो बार ।
  10. तत्काल उपयोग के लिए संस्कृति माध्यम में वांछित एकाग्रता पर कणों resuspend । लंबी अवधि के भंडारण के लिए, एक १०० mM सुक्रोज समाधान में 10 मिलीग्राम/एमएल में कणों resuspend । फ्रीज, lyophilize, और-८० डिग्री सेल्सियस पर कणों की दुकान ।

4. aAPC का लक्षण वर्णन और मूल्यांकन

  1. aAPC आकार और आकार (चित्रा 3) का लक्षण वर्णन
    1. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग इमेजिंग कणों द्वारा microparticle आकार और आकार की विशेषता । SEM इमेजिंग के लिए, कार्बन टेप पर फैले lyophilized कणों एक एल्यूमीनियम हमले और सोने के साथ धूम कोट पैलेडियम का पालन किया ।
    2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कणों के आकार और पहलू अनुपात का विश्लेषण करें ।
    3. कण का आकार निर्धारित करने के लिए स्केल बार और माप कण व्यास का उपयोग कर स्केल सेट करें । औसत कण व्यास का निर्धारण और कण आकार के हिस्टोग्राम उत्पन्न करने के लिए लगभग १०० कणों के लिए दोहराएँ.
    4. पहलू अनुपात निर्धारित करने के लिए, लंबी धुरी और कणों की छोटी धुरी भर दूरी को मापने और लघु अक्ष द्वारा लंबी धुरी विभाजित । प्रत्येक आकृति के लिए औसत कण पक्ष अनुपात निर्धारित करने और हिस्टोग्राम जनरेट करने के लिए प्रत्येक आकृति के लगभग ५० कणों को दोहराएँ.
    5. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) का उपयोग इमेजिंग कणों द्वारा nanoparticle आकार और आकार की विशेषता. 5.1.2 में वर्णित के रूप में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर नैनोकणों के आकार और पहलू अनुपात का विश्लेषण करें । वैकल्पिक रूप से, गोलाकार nanoparticle आकार डायनामिक लाइट कैटरिंग (DLS) या nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (ंत्) का उपयोग करके माप ।
  2. प्रोटीन विकार दक्षता
    1. 1-3 तरीकों के अनुसार aAPC तैयार है, लेकिन चरण ३.७ में फ्लोरोसेंट संकेत 1 प्रोटीन और विरोधी माउस CD28 लेबल का उपयोग करें । विकार और धोने के बाद, 2 मिलीग्राम/एमएल aAPC के अंतिम एकाग्रता के लिए 1 एमएल पंजाब में aAPC resuspend ।
    2. एक काले polystyrene ९६-अच्छी तरह से microplate में प्रोटीन मानकों को तैयार । 5 μg की फ्लोरोसेंट लेबल संकेत की थाली के पहले कुआं में पंजाबियों के लिए 1 प्रोटीन जोड़ें और थाली की पंक्ति में पंजाब में 10 1:2 कमजोरियां बनाते हैं । पिछले अच्छी तरह से खाली छोड़ दें । इस कदम को दोहराने के साथ फ्लोरोसेंट लेबल विरोधी CD28 के साथ मानकों का एक और सेट उत्पंन करते हैं ।
    3. पिपेट १०० microplate में काले polystyrene तपसिल की प्रतिकृति कुओं में aAPC समाधान के μL ।
    4. एक प्रतिदीप्ति प्लेट रीडर पर उपयुक्त तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति पढ़ें । एक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के लिए मानक curves उत्पंन करने के लिए प्रोटीन मानकों से प्रतिदीप्ति रीडिंग का प्रयोग करें । मानक वक्र का उपयोग करना, प्रत्येक नमूने में संकेत 1 और एंटी-CD28 की सांद्रता की गणना अच्छी तरह से, और फिर सतह प्रोटीन और विकार दक्षता की मात्रा की गणना (चित्रा 4a, चित्रा 5 ए).
  3. के लिए aAPC का मूल्यांकन इन विट्रो सीडी 8 + टी कोशिकाओं की उत्तेजना
    1. ' बी मीडिया तैयार (RPMI मध्यम एल glutamine के साथ पूरक, 10% FBS, 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान, 1% सोडियम पाइरूवेट, 1% मेम विटामिन समाधान, ९२ माइक्रोन β-mercaptoethanol, 10 एनजी/एमएल ciprofloxacin, और 30 यू/एमएल आईएल-2 ।
    2. कार्बन डाइऑक्साइड जोखिम के माध्यम से एक काले 6 माउस बलिदान ।
    3. एक पहले से स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार माउस से तिल्ली फसल16. तिल्ली को 10-15 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में लीजिए । एक मूसल का प्रयोग, एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से तिल्ली एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में मैश । मुहब्बत के दौरान, ४० मिलीलीटर पंजाबियों के साथ छलनी धोने ।
    4. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर splenocytes स्पिन । supernatant बंद डालो और लाल रक्त कोशिकाओं लाइसे करने के लिए ले Lysing बफर के 4 मिलीलीटर में splenocytes resuspend । ट्यूब के लिए 1 मिनट के लिए परेशान बैठने की अनुमति दें, तो पंजाबियों जोड़ने के लिए ट्यूब में मात्रा 20 मिलीलीटर लाने के लिए ।
    5. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं स्पिन । supernatant बंद डालो और पंजाब के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend । किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करना.
    6. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर कक्षों को स्पिन और कक्ष पृथक्करण बफ़र की इच्छित मात्रा में पुनर्निलंबित । किसी सीडी 8 + ऋणात्मक चयन t कक्ष आइसोलेशन किट का उपयोग करते हुए एकल कक्ष निलंबन से सीडी 8 + t कक्षों को अलग करें, निर्माता के प्रोटोकॉल का अनुसरण करते हुए.
    7. चुंबकीय जुदाई के बाद, स्पिन सीडी 8 + टी कोशिकाओं पर ३०० x जी पांच मिनट के लिए और सेल जुदाई बफर निकालें । पंजाब के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित और कोशिकाओं की गिनती । carboxyfluorescein succinyl एस्टर (CFSE) के साथ लेबल कोशिकाओं के निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार ।
    8. मशीन ८,३३३ सीडी 8 + टी कोशिकाओं और ०.०८३३ मिलीग्राम (या वांछित खुराक) में aAPC की १५० μL B ' मीडिया में एक अच्छी तरह से U-नीचे ऊतक संस्कृति-इलाज प्लेट के प्रत्येक कुआं में ।
    9. 7 दिनों के लिए ३७ ° c पर मशीन । 3-4 दिनों के बाद, संस्कृति माध्यम को एक अच्छी तरह से ७५ μL ताजा माध्यम जोड़कर ताज़ा करें ।
    10. मशीन के 3 दिनों के बाद, प्रसार का आकलन करने के लिए एक प्रवाह cytometer पर CFSE लेबल कोशिकाओं का विश्लेषण । प्रवाह cytometry CFSE हिस्टोग्राम पर प्रत्येक चोटी एक कोशिका विभाजन के साथ CFSE कमजोर पड़ने के कारण कोशिकाओं की एक पीढ़ी का प्रतिनिधित्व करता है ।
    11. 7 दिनों के बाद, प्रत्येक कुआं में कक्षों की संख्या की गणना करने के लिए एक hemocytometer का उपयोग करें । गिनती करने से पहले, एक Trypan नीले समाधान के साथ दाग मृत कोशिकाओं । अंतिम कक्ष गणना से मृत कक्षों को छोड़ें । प्रारंभिक एकाग्रता के लिए अंतिम कोशिका एकाग्रता को सामान्य करने के लिए गुना विस्तार (चित्रा 4 और चित्रा 5) की गणना.

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Representative Results

स्वचालित 2 डी पतली फिल्म डिवाइस खींच के लिए एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिया जाता है । एक योजनाबद्ध और एक 1 डी पतली फिल्म डिवाइस खींच के लिए वर्णन हो एट अल में दिया जाता है17 स्ट्रेचर एल्यूमीनियम भागों मानक मिलिंग और मशीनिंग तकनीक का उपयोग करने से निर्माण किया है । 1 डी स्ट्रेचर के लिए इसी तरह, 2d स्ट्रेचर धातु पकड़ता है और गाइड रेल के होते हैं । द्वि-दिशा नेतृत्व शिकंजा रोटेशन गति के लिए रैखिक अनुवाद करने के लिए उपयोग किया जाता है । नेतृत्व शिकंजा पर्याप्त टोक़ के साथ समान stepper मोटर्स के लिए यांत्रिक नल के माध्यम से संलग्न हैं. 8 stepper मोटर नियंत्रण तारों पर टांका किया जा सकता 8 पिन गर्मी प्रतिरोधी amphenol connectors के लिए आसान लगाव के लिए एक ओवन में पतली फिल्म टूटती के लिए सांत्वना. Polytetrafluoroethylene (PTFE) पर्याप्त लंबाई के लेपित तार नियंत्रण कंसोल में ड्राइवरों के लिए stepper मोटर्स कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अनुशंसित कंप्यूटर नियंत्रण योजना चित्रा 1aमें दी गई है । दो मोटर्स गर्मी प्रतिरोधी तारों के माध्यम से 2 स्वतंत्र ड्राइवरों के लिए जुड़ा होना चाहिए । दो ड्राइवरों तो एक microcontroller करने के लिए एक कंप्यूटर के साथ अंतरफलक से जुड़ा होना चाहिए । ड्राइवरों X-अक्ष और microcontroller पर Y-अक्ष outputs से जुड़ा होना चाहिए । ड्राइवरों और microcontroller दोनों एक बाहरी बिजली की आपूर्ति की आवश्यकता होती है । इन तीन घटकों के लिए बिजली की आपूर्ति को जोड़ने से पहले यह अनुशंसित है कि एक 4 एक फ्यूज संचालित कनेक्शन से प्रत्येक के बीच में डाला जा करने के लिए वर्तमान अधिभार से घटकों की रक्षा । अंत में, microcontroller एक समानांतर पोर्ट इनपुट के माध्यम से जोड़ा जा सकता है एक कंप्यूटर के लिए पुरुष केबल के लिए एक DB25 पुरुष का उपयोग कर । इलेक्ट्रॉनिक्स stepper मोटर्स को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गर्मी संवेदनशील हैं और इसलिए किसी भी गर्मी स्रोत के बाहर रखा जाना चाहिए (जैसे एक ओवन) आपरेशन के दौरान इस्तेमाल के लिए पर्याप्त तापमान खींच सक्षम करने के लिए पतली फिल्मों गर्मी. हालांकि अनुशंसित मोटर्स गर्मी कणों खींच के लिए इस प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट तापमान को प्रतिरोधी रहे हैं, मोटर्स और ड्राइवरों अतिरिक्त गर्मी का निर्माण होगा, जबकि वे मुख्य बिजली की आपूर्ति से जुड़े रहे हैं । इसलिए, यह अनुशंसा की जाती है कि डिवाइस केवल वास्तविक फिल्म की अवधि के दौरान चालू करने के लिए संभावित गर्मी का निर्माण-अप कम खींच ।

PLGA नैनो और microparticles इस प्रोटोकॉल में वर्णित एकल पायस तकनीकों का उपयोग कर संश्लेषित किया गया था और उनि (चित्रा 3ए) और SEM (चित्र) का उपयोग कर छवि, क्रमशः । गोलाकार नैनोकणों २३७.३ ± ४.० एनएम का व्यास था के रूप में DLS और २२४ एनएम द्वारा मापा के रूप में ंत् द्वारा मापा (आंकड़ा 3सी) । Microparticles ५००० rpm पर homogenization द्वारा संश्लेषित करने के लिए 3 ± 1 माइक्रोन (चित्रा 3 डी) के एक औसत व्यास के साथ गोलाकार कणों उत्पंन थे । कणों एक आयाम में ९० डिग्री सेल्सियस पर स्वचालित फिल्म खींच डिवाइस का उपयोग करने के लिए देर से ellipsoidal नैनो उत्पंन और microparticles और दो आयामों में ७० डिग्री सेल्सियस पर फैला चिपटा ellipsoidal कणों उत्पंन करने के लिए बढ़ाया गया । सभी तीन आकृतियों के microparticles के पहलू अनुपात लंबी धुरी और कणों के छोटे अक्ष दूरी को मापने और दोनों को विभाजित करके विश्लेषण किया गया । गोलाकार microparticles १.०५ ± ०.०४ के एक पहलू अनुपात था, जबकि 1 d बढ़ाया देर ellipsoidal कणों ३.६ ± ०.८ (चित्रा 3E) का एक बड़ा पहलू अनुपात था । 2d तनी चिपटा ellipsoidal कणों १.२ ± ०.२ के एक पहलू अनुपात था, मोटे तौर पर एक के एक पहलू अनुपात को बनाए रखने ।

EDC/एच एस रिएक्शन रसायन विज्ञान संयुग्मी के लिए इस्तेमाल किया गया एक फ्लोरोसेंट लेबल पेप्टाइड-MHC आईजीजी डिमर और विरोधी CD28 एंटीबॉडी फैला और गोलाकार PLGA कणों की सतह के लिए । विकार दक्षता परिणाम गोलाकार और ellipsoidal माइक्रो-aAPC (चित्रा 4a) और नैनो-aAPC (चित्रा 5) की सतह पर प्रोटीन की इसी तरह की मात्रा का प्रदर्शन और aAPC संश्लेषण के दौरान प्रोटीन युग्मन एक में होता है कि प्रदर्शन एकाग्रता-निर्भर तरीके से । aAPC कार्यक्षमता पर आकार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, गोलाकार और ellipsoidal aAPC संयुग्मित के साथ gp100-लोड MHC आईजीजी डिमर और विरोधी CD28 PMEL ट्रांसजेनिक सीडी 8 + टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. टी कोशिकाओं CFSE के साथ लेबल और प्रसार (चित्रा 4B, 5B) का आकलन करने के लिए 3 दिनों के बाद प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन किया गया । देर से ellipsoidal aAPC उप पर टी सेल प्रसार के उच्च स्तर को प्रेरित पाया गया-गोलाकार aAPC से संतृप्ति खुराक, सबसे अच्छा एक ०.०१ मिलीग्राम खुराक में हासिल जुदाई के साथ । 7 दिनों के बाद, टी कोशिकाओं को मैंयुअल रूप से गिना गया । देर से ellipsoidal aAPC अधिक प्रभावी ढंग से उत्तेजित टी कोशिकाओं को अतिसूक्ष्म (चित्र 4c) और नेनो (चित्रा 5C), और खुराक-निर्भर टी सेल विस्तार पर उनके गोलाकार समकक्षों की तुलना में मनाया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: स्वचालित पतली फिल्म स्ट्रेचर के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (एक) पतली फिल्म स्ट्रेचर के लिए नियंत्रण सांत्वना की योजनाबद्ध । (ख) पतली फिल्म स्ट्रेचर के लिए यांत्रिक हार्डवेयर की योजनाबद्ध । छोड़ा यांत्रिक हार्डवेयर के ओवरहेड दृश्य । सही पतली फिल्मों के लिए मनोरंजक तंत्र की धारा पार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: अनिसोट्रोपिक आकार में बहुलक कणों खिंचाव के लिए इकट्ठे स्वचालित पतली फिल्म स्ट्रेचर की तस्वीरें. 2 डी पतली फिल्म डिवाइस खींच एल्यूमीनियम के साथ दो कुल्हाड़ियों से बना है कि पकड़ फिल्म माउंट । दो अक्षों को निर्देश का विरोध करने में नेतृत्व शिकंजा इतना है कि वे एक दूसरे से अलग कदम होते हैं । खींच प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए, एक यूएसबी लिंक्ड microcontroller दो stepper मोटर ड्राइवरों कि रिले संकेत एक थर्मल केबल के माध्यम से एकध्रुवीय stepper मोटर्स के लिए जुड़ा हुआ है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: गोलाकार और ellipsoidal PLGA कणों का आकार और पहलू अनुपात विश्लेषण । (क) उनि और (ख) गोलाकार की SEM छवियां, 1 डी बढ़ाकर देर ellipsoidal, और 2d तनी चिपटा ellipsoidal PLGA (क) नैनोकणों और (ख) microparticles । (ग) गोलाकार नैनोकणों को ंत् द्वारा आकार दिया गया और व्यास में २२४ एनएम का निर्धारण किया गया. PLGA microparticles के SEM छवियों के लिए विश्लेषण किया गया (D) गोलाकार कणों के आकार वितरण और (ई) सभी कण आकार के पहलू अनुपात । (ग) reproduced और छोटे13, कॉपीराइट विले-VCH २०१५ से अनुमति के साथ अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: गोलाकार और ellipsoidal सूक्ष्म aAPC के लक्षणीय और कार्यात्मक मूल्यांकन । (क) विकार क्षमता वाली फ्लोरोसेंट-बला पेप्टाइड-लोडेड MHC आईजीजी डिमर और एंटी-CD28 एंटीबॉडी की सतह को गोलाकार और दिवंगत ellipsoidal microparticles. (ख) सीडी 8 + टी कोशिकाओं CFSE के साथ लेबल थे और गोलाकार और 1 डी-तनी माइक्रो-aAPC पर ०.०१, ०.१, और एक मिलीग्राम खुराक, या गैर cognate नियंत्रण के साथ मशीन । 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन प्रसार का आकलन किया गया । (ग) टी कोशिकाओं को मैनुअल काउंटिंग द्वारा 7 दिनों के बाद भी मूल्यांकित किया गया. कोशिका गिनती गुना-विस्तार की गणना करने के लिए प्रारंभिक गिनती करने के लिए सामान्यीकृत थे. संबंधित ellipsoidal और गोलाकार फ़ोल्ड विस्तारण के बीच तुलना के लिए, * = p < ०.०५, * * = p < ०.०१, और * * * = p < ०.००१ । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि माध्य (SEM) के लिए 3 प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं । reproduced और 12, कॉपीराइट Elsevier २०१४ से अनुमति के साथ अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: गोलाकार और दिवंगत ellipsoidal नैनो-aAPC के लक्षणात्मक और कार्यात्मक मूल्यांकन । (क) विकार क्षमता वाली फ्लोरोसेंट-बला पेप्टाइड-लोडेड MHC आईजीजी डिमर और एंटी-CD28 एंटीबॉडी की सतह को गोलाकार और दिवंगत ellipsoidal नैनोकणों. (ख) सीडी 8 + टी कोशिकाओं CFSE के साथ लेबल और गोलाकार और देर से ellipsoidal नैनो-aAPC गुना-खिंचाव ०.०१, ०.१ पर, और 1 मिलीग्राम खुराक के साथ मशीन थे । 3 दिनों के बाद, कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा मूल्यांकन प्रसार का आकलन किया गया । (सी) टी कोशिकाओं गुना खिंचाव अलग की देर ellipsoidal कणों के साथ मशीन (१.५ से लेकर ३.५) भी मैनुअल गिनती द्वारा 7 दिनों के बाद मूल्यांकन किया गया । कक्ष गणना एक अनुपचारित हालत के लिए एक मोड़-विस्तार की गणना करने के लिए सामान्यीकृत थे । * = p < ०.०५, * * = p < ०.०१, और * * * = p < ०.००१ गोलाकार की तुलना में । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि माध्य (SEM) के लिए 3 प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं । reproduced और छोटे13, कॉपीराइट विले-VCH २०१५ से अनुमति के साथ अनुकूलित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल अनिसोट्रोपिक बहुलक कणों की सटीक पीढ़ी के लिए एक बहुमुखी विधि का विवरण । पतली फिल्म खींच तकनीक यहां वर्णित स्केलेबल, अत्यधिक reproducible और सस्ती है । अनिसोट्रोपिक कणों पैदा करने के लिए वैकल्पिक तकनीक उच्च लागत, कम प्रवाह, और सीमित कण आकार सहित कई सीमाओं से ग्रस्त हैं । पतली फिल्म खींच दृष्टिकोण भी लाभप्रद है क्योंकि कणों संश्लेषण के बाद अनिसोट्रोपिक होने के लिए संशोधित कर रहे हैं, और, एक परिणाम के रूप में, कण आकार और संश्लेषण तकनीक की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत है. चित्रा 1 स्वचालित दो आयामी खींच डिवाइस के सेटअप विवरण । इस डिवाइस को भी इलेक्ट्रॉनिक उपकरणों के बिना मैंयुअल रूप से शिकंजा बदल जब तक फिल्म खींच की वांछित डिग्री तक पहुंच गया है इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, हमने पाया है कि स्वचालित प्रक्रिया अधिक सुसंगत है और मैनुअल आपरेशन15की तुलना में तेजी से । विभिंन तकनीकों अनिसोट्रोपिक कणों को संश्लेषित करने के लिए विकसित किया गया है, जैसे microfluidic17,18,19, परत द्वारा परत कोटिंग21, और अंय नीचे-ऊपर संश्लेषण के दृष्टिकोण21 ,22. हालांकि, इन तरीकों कण ज्यामिति पर मजबूत नियंत्रण सक्षम नहीं है और आकार है कि उत्पंन किया जा सकता है और कण सामग्री है कि इस्तेमाल किया जा सकता है के मामले में के रूप में बहुमुखी नहीं हैं । गोलाकार कणों के निर्माण के लिए एक लोकप्रिय टॉप-डाउन विधि में गैर-गीला टेम्पलेट्स (मुद्रण)24कण प्रतिकृति है । हालांकि प्रिंट कण आकार पर सटीक नियंत्रण सक्षम बनाता है, यह महंगी मशीनरी की आवश्यकता है और के रूप में पतली फिल्म खींच विधि के रूप में लागू करने के लिए सुलभ और सरल नहीं है ।

सिंगल इमल्शन तकनीक को नैनो से लेकर अतिसूक्ष्म12,13तक विभिन्न आकारों के PLGA कणों का निर्माण किया जा सकता है । अलग homogenization गति या sonication आयाम, microparticle और nanoparticle आकार, क्रमशः, संग्राहक जा सकता है । एक बार गोलाकार कणों को उत्पन्न किया गया है, पतली फिल्म टूटती विधि यहाँ वर्णित विभिन्न आकार15में कणों ख़राब करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम एक या दो आयामों में खींचकर, क्रमशः देर से और चिपटा ellipsoidal कणों की पीढ़ी का वर्णन । गोलाकार कणों में एक पतली प्लास्टिक की फिल्म डाली जाती है, जो PLGA के काँच के संक्रमण तापमान से ऊपर गरम होती है और कणों को ख़राब करने के लिए एक या दो आयामों में तनी रहती है. कणों के पहलू अनुपात अत्यधिक नियंत्रणीय है । फिल्म खिंचाव की डिग्री ट्यूनिंग करके, कणों के पहलू अनुपात संग्राहक किया जा सकता है, और हम मापा कण पहलू अनुपात अत्यधिक अनुमानित मूल्य12,13के साथ संबंधित है पाया है । विभिंन अंय आकार खींच या खींच की डिग्री के दौरान तापमान को संशोधित करके उत्पंन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, लाल रक्त कोशिकाओं के आकार जैसी biconcave discoidal कणों ९० डिग्री सेल्सियस पर दो आयामों में microparticles १.५-गुना खींच द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है । 15. इस फिल्म खींच तकनीक भी कई अनिसोट्रोपिक आकार, कीड़े, बैरल, और आयताकार डिस्क21सहित में गोलाकार polystyrene कणों को बदलने के लिए इस्तेमाल किया गया है । डिवाइस खींच फिल्म को मैन्युअल रूप से शिकंजा नियंत्रण या डिवाइस स्वचालित किया जा सकता है के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है प्रक्रिया को और अधिक कुशल और लगातार15बनाने के द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है । यह सरल तकनीक मज़बूती से अनिसोट्रोपिक कणों कि शारीरिक शर्तों के तहत अपने आकार को बनाए रखने का उत्पादन24। इसके अलावा, इस विधि अंय बहुलक सामग्री के लिए लागू किया गया है, PLGA के अलावा, ऐसे polycaprolactone (PCL) और संकर PLGA और पाली (बीटा अमीनो एस्टर) (PBAE) के बने कणों के रूप में ।

इस प्रोटोकॉल भी विभिंन आकार और आकार के PLGA कणों का वर्णन कैसे सतह प्रोटीन के साथ संयुग्मित जा सकता है सीडी 8 + टी सेल सक्रियण के लिए आवश्यक aAPC के रूप में कार्य । प्रोटीन covalently संयुग्मित अनिसोट्रोपिक और गोलाकार PLGA सूक्ष्म और EDC/एन एस के लिए प्रोटीन पर प्राथमिक अमीन के नैनोकणों समूहों के लिए कण की सतह पर मध्यस्थता युग्मन द्वारा किया जा सकता है । प्रोटीन विकार की दक्षता इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में कणों की सतह के लिए फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन युग्मन द्वारा मापा जा सकता है, और हमने पाया है कि इस तकनीक जोड़ों 15-20% दक्षता12पर कणों के लिए प्रोटीन, 13. देर से ellipsoidal माइक्रो और nanoparticle aAPC सीडी 8 + टी सेल प्रसार और विस्तार इन विट्रो12,13में सक्रिय करने में अपने गोलाकार समकक्षों की तुलना में अधिक प्रभावी रहे हैं । Ellipsoidal aAPC के लिए बंधन बढ़ाया है और संपर्क के लिए अपने बड़े सतह क्षेत्र के कारण टी कोशिकाओं के साथ बातचीत12। अनिसोट्रोपिक कणों में भी phagocytosis13करने के लिए उनके बढ़ाया वितरण और प्रतिरोध के कारण vivo में गोलाकार कणों पर बेहतर गुण है । इस मंच अत्यधिक मॉड्यूलर है और कई अंय दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा करने के लिए क्षमता है । इस कार्यविधि का उपयोग करते हुए, स्वरित्र आकार और आकार के बहुलक कणों उत्पन्न किया जा सकता है और कण सतह ब्याज के किसी भी प्रोटीन के साथ संयुग्मित जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

EBA (डीजीई-१७४६८९१) और KRR (डीजीई-१२३२८२५) ने समर्थन के लिए NSF ग्रेजुएट रिसर्च फेलोशिप प्रोग्राम का धन्यवाद किया । राम धन्यवाद राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा पुरस्कार NIH NCI F31 (F31CA214147) और उपलब्धि के लिए कॉलेज के वैज्ञानिकों फैलोशिप समर्थन के लिए पुरस्कार । लेखकों ने NIH (R01EB016721 और R01CA195503), दृष्टिहीनों को रोकने के लिए शोध करने वाले जेम्स एण्ड Carole फ्री उत्प्रेरक पुरस्कार, और सहायता के लिए कैंसर Kimmel के लिए झळ ब्लूमबर्ग-Immunotherapy इंस्टिट्यूट को धन्यवाद दिया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed Polysciences, Inc. 02975-500
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Digital Thermometer Fluke N/A Model name: Fluke 52 II
Immersion Temperature Probe Fluke N/A Model name: Fluke 80PK 22
Digital Hotplate & Stirrer Benchmark Scientific H3760-HS
Multipoint stirrer Thermo Fisher Scientific 50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich 719900
Dichloromethane Sigma-Aldrich D65100
Homogenizer IKA  0003725001
Sonicator Sonics & Materials, Inc. N/A Model number: VC 505
Sonicator sound abating enclosure Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0427
Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0220
Sonicator microtip Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0423
High speed centrifuge Beckman Coulter N/A Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP
High speed centrifuge rotor Beckman Coulter 369691 Model number: JA-17
High speed polycarbonate centrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 mL, screw cap
Rectangular disposable petri dish VWR International 25384-322 75 x 50 x 10 mm
Square disposable petri dish VWR International 10799-140 100 mm x 100 mm
LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody Biolegend 100314
InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 Bio X Cell BE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E6383
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt Sigma-Aldrich 56485
MES Sigma-Aldrich M3671
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100212
APC anti-mouse CD28 Antibody Biolegend 102109
Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate Sigma-Aldrich CLS3915 flat bottom, black polystyrene
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11875093
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135 Heat Inactivated, sterile-filtered
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Recombinant Human IL-2 (carrier-free) Biolegend 589102
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360070
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
MEM Vitamin Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11120052
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotech 130-104-075
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher Scientific C34554
LS Columns Miltenyi Biotech 130-042-401
MidiMACS Separator Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS Multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
Flow Cytometer Accuri C6
Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader BioTek
autoMACS Running Buffer Miltenyi BIotech 130-091-221
Cell Strainer ThermoFisher Scientific 22363548 Sterile, 70 µm nylon mesh
ACK Lysing Buffer ThermoFisher Scientific A1049201
C57BL/6J (Black 6) Mouse The Jackson Laboratory 000664 Male, at least 7 weeks old
U-Bottom Tissue Culture Plates VWR 353227 Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates
40 V DC Power Supply Probotix LPSK-4010
PTFE Coated Wire Mouser 602-5858-100-01 This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work
Stepper Motor Driver Probotix MondoStep5.6
IDC Connector Kit Probotix IDCM-10-12
Microcontroller Probotix PBX-RF
4A Fuses Radio Shack 2701026 Equivalent fuses will work as well
DB25 Male to Male Cable Probotix DB25-6
USB-A to USB-B Cable Staples 2094915 Equivalent cable will work as well
8-Pin Amphenol Connectors Male and Female Mouser 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S
Stepper Motor Probotix HT23-420-8
Right Hand Lead Screw Roton 60722
Left Hand Lead Screw Roton 60723
Screws McMaster Carr 92196A151
Neoprene Rubber McMaster Carr 8698K51
Right Handed Flanged Lead Nut Roton 91962
Left Handed Flanged Lead Nut Roton 91963
Linux Control Computer Probotix LCNC-PC Any computer with matching specification and Linux operating system will work
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS431097
Trypan Blue Solution, 0.4 % ThermoFisher Scientific 15250061

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक १४० aAPC immunoengineering बहुलक अनिसोट्रोपिक कण आकार
सीडी 8 + टी सेल सक्रियण के लिए कोशिकाओं को पेश अनिसोट्रोपिक बहुलक कृत्रिम प्रतिजन का निर्माण
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Ben-Akiva, E., Rhodes, K. R., Meyer, … More

Ben-Akiva, E., Rhodes, K. R., Meyer, R. A., Green, J. J. Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation. J. Vis. Exp. (140), e58332, doi:10.3791/58332 (2018).

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