Summary
Her presenterer vi en protokoll for å raskt og reproduserbar generere biologisk inspirert, biologisk nedbrytbart articifical antigen presentere celler (aAPC) med tunable størrelse, form og overflate protein presentasjon for T celle ekspansjon ex vivo eller i vivo .
Abstract
Kunstig antigen presentere celler (aAPC) er en lovende plattform for immun moduleringshjul potente evne til å stimulere T celler. Acellular underlag tilbyr hovedfordelene over cellen-basert aAPC, inkludert presis kontroll over signal presentasjon parametere og fysiske egenskaper aAPC overflaten å modulere sin interaksjon med T-celler. aAPC konstruert av Anisotrop partikler, spesielt ellipsoidisk partikler, har vist seg å være mer effektivt enn deres sfærisk kolleger på stimulerende T celler økt binding og større areal tilgjengelig for T celle kontakter, samt som redusert uspesifikke opptak og forbedret farmakokinetiske egenskapene. Til tross for økt interesse Anisotrop partikler, akseptert selv allment metoder for å generere Anisotrop partikler som tynn-film strekker kan være utfordrende å implementere og bruke reproduserbar.
Dette vi beskriver en protokoll for rask, standardisert fabrikasjon av biologisk nedbrytbart Anisotrop partikkel-basert aAPC med tunable størrelse, form, og signalisere presentasjon for T celle ekspansjon ex vivo eller i vivo, samt metoder for å karakterisere deres størrelse, morfologi og overflate protein innhold, og for å vurdere funksjonaliteten. Denne tilnærmingen å fabrikere Anisotrop aAPC er skalerbare og reproduserbar, gjør det ideelt for å generere aAPC for "sokkel" immunotherapies.
Introduction
Kunstig antigen presentere celler (aAPC) har vist lovende som immunmodulerende fordi de kan generere en robust antigen-spesifikke T celle respons. Viktig for disse plattformene er deres evne til å effektivt presentere avgjørende signaler for T celle aktivering. Acellular aAPC er et attraktivt alternativ til cellen-basert aAPC fordi de er enklere og mindre kostnadskrevende å dikte færre utfordringer under oppskalering og oversettelse og lindre risikoen forbundet med cellen-basert behandling. Acellular aAPC også gi rom for en høy grad av kontroll over signal presentasjon parametere og fysiske egenskaper av overflaten som vil grensesnitt med T celler1.
aAPC må recapitulate minst to signaler nødvendig for T celle aktivering. Signal 1 gir antigen anerkjennelse og oppstår når den T-celle reseptoren (TCR) gjenkjenner og engasjerer med en MHC, klasse I eller II bærer sin beslektet antigen, kulminerte i signalering gjennom TCR komplekset. For å omgå antigen spesifisitet kravet, bære aAPC systemer ofte en agonistic monoklonalt antistoff mot CD3 reseptoren, som nonspecifically stimulerer TCR komplekset. Rekombinant former av MHC, spesielt MHC multimers, har også blitt brukt på overflaten av aAPC for å gi antigen spesifisitet2,3. 2 er et costimulatory signal som fører T celle aktivitet. For å gi costimulation nødvendig for T celle aktivering, stimuleres generelt CD28 reseptoren med et agonistic antistoff presentert på aAPC overflaten, selv om andre costimulatory reseptorer som 4-1BB har vært vellykket målrettet4. Signalet 1 og 2 proteiner er vanligvis immobilisert på overflaten av stive partikler å syntetisere aAPC. AAPC har historisk fabrikkert fra en rekke materialer, inkludert polystyren4,5 og jern dekstran6. Nyere systemer benytte biologisk nedbrytbare polymerer som poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) til å generere aAPC som lett kan kombineres for å signalisere proteiner, er egnet for direkte administrasjon i vivoog kan forenkle vedvarende utgivelsen av innkapslet cytokiner eller løselig faktorer å øke T celle aktivering7,8.
Tilstedeværelsen av nødvendig signal proteiner er reseptor engasjement over et tilstrekkelig stort område under aAPC/T celle interaksjon nødvendig for T celle aktivering. Dermed fysiske parametere i aAPC som størrelse og form drastisk endre deres tilgjengelige kontakt området og påvirke deres evne til å stimulere T celler. Mikron-størrelse aAPC vist seg å være mer effektiv på stimulerende T celler enn deres nanoskala kolleger9,10. Nano-aAPC kan imidlertid ha overlegen biodistribution og bedre drenering til lymfeknutene som kan øke sin ytelse i vivo over mikro-aAPC11. Figuren er en annen variabel interesse partikkel-baserte aAPC systemer. Anisotrop aAPC har nylig vist å være mer effektiv enn isotropic partikler på stimulerende T-celler, hovedsakelig på grunn av forbedret interaksjon med målet celler kombinert med redusert uspesifisert celle opptak. Cellene binder fortrinnsvis seg til den lange aksen ellipsoidisk partikler, og større radius av kurvatur og flatere overflaten tillater mer kontakt mellom aAPC og T-celler12. Den lange aksen ellipsoidisk partikler også fraråder fagocytose, noe som resulterer i økt sirkulasjon tid i forhold til sfæriske partikler etter i vivo administrasjon12,13. På grunn av disse fordelene megle ellipsoidisk partikler større utvidelse av antigen-spesifikke T celler i vitro og i vivo sammenlignet sfæriske partikler, en effekt observert både mikro og nanoscales12, 13. Det er ulike strategier for å dikte Anisotrop partikler, men tynn-film stretching er en enkel, allment akseptert metode som brukes til å generere en rekke ulike partikkel figurer14. Etter syntese, partikler er kastet i filmer og strukket i en eller to dimensjoner ved en temperatur over glass overgang temperaturen av partikkel. Filmen er da oppløst for å hente partikler. Til tross for økende interesse Anisotrop partikler, gjeldende metoder for fabrikere partikkel-baserte aAPC er stort sett begrenset til isotropic systemer og metoder for å endre partikkel formen kan være vanskelig å gjennomføre, kompatibel med visse aAPC syntese strategier og mangel presisjon og reproduserbarhet15. Våre tynn-film strekker teknikk kan utføres manuelt eller i et automatisert mote raskt generere Anisotrop partikler fra en rekke nedbrytbart polymerer, strukket til ønsket størrelsesforholdet i en eller to dimensjoner15.
Basert på våre tidligere arbeid, utviklet vi en biologisk nedbrytbart partikkel-basert tilnærming kombinert med skalerbare tynn-film strekk teknologi raskt generere aAPC med tunable størrelsen og formen på en standardisert måte for T celle ekspansjon ex vivo eller i vivo. Vår protein Bøyning strategi kan brukes å alle protein(s) rundt carboxyl grupper på partikkel overflaten på en ønsket tetthet, gir dette aAPC systemet en høy grad av fleksibilitet. Vi beskriver også metoder å karakterisere størrelse, morfologi og overflate proteininnhold på aAPC, og å vurdere deres funksjonalitet i vitro. Denne protokollen kan tilpasses enkelt å utvide immunceller ex vivo eller i vivo for en rekke immunterapeutisk programmer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Johns Hopkins University.
1. fabrikasjon av sfærisk PLGA partikler av Tunable størrelse
- Utarbeidelse av materialer for partikkel syntese
- Forberede 5% w/w polyvinylalkohol (PVA) løsning.
- Legge 500 mL deionisert (DI) vann til en Erlenmeyer kolbe med magnetic røre bar og plasser på kokeplate rørestang 500 rpm og overvåke temperatur med termometer. Dekk flasken tinfoil å hindre fordampning.
- Når vanntemperaturen når omtrent 70 ° C, legge til 25 g totalt PVA i små grupper over tid venter PVA å oppløse før legge mer.
- Når alle PVA oppløst (vanligvis 30-60 minutter), la løsning kule og sterile filter. Lagre på 4 ° C for fremtidig bruk.
- Forberede filmen casting løsning av 10% w/w PVA og 2% w/w glyserol.
- Legg til 500 mL DI vann i en Erlenmeyer kolbe med magnetic røre bar. Legge til 8 mL glyserol ved romtemperatur og blanding av føden.
- Plasser kolbe på kokeplate rørestang 500 rpm og overvåke temperatur med termometer. Dekk flasken tinfoil å hindre fordampning.
- Når løsningen temperaturen når omtrent 70 ° C, legge til 50 g totalt PVA i små grupper over tid venter PVA å oppløse før legge mer.
- Når alle PVA oppløst (vanligvis 60 min), la løsning kule og sterile filter med en plastflaske-top vakuum filtersystem med en porestørrelse på 0.22 μm. Lagre ved romtemperatur for fremtidig bruk.
- Forberede en 50 mL 1% w/w PVA løsning. Legge til 40 mL DI vann og 10 mL av 5% PVA løsning (laget i 1.1.1) en 100-150 mL kanne.
- Forberede en 100 mL 0,5% w/w PVA løsning. Legge til 90 mL DI vann og 10 mL av 5% PVA løsning en 150-250 mL kanne.
- Legge til en magnetic røre bar 0,5% PVA løsningen og sted i en kjemisk panseret på en røre plate ved romtemperatur på 500 rpm.
- Forberede 5% w/w polyvinylalkohol (PVA) løsning.
- Microparticle syntese
- Veie ut 100 mg av poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) i en scintillation medisinglass og oppløses i 5 mL av diklormetan (DCM). Vortex å oppløse PLGA.
- Plass homogenizer i 50 mL 1% PVA løsningen slik at homogenizer er så nær bunnen av begeret som mulig uten å røre den. Slå på homogenizer og Juster til ønsket hastighet-3200 rpm for 5 μm diameter partikler, 5000 rpm for 3 μm, 15 000 rpm for 1 μm (økende homogenisering hastigheten reduseres partikkelstørrelse). En gang ønsket hastighet, legger PLGA løsningen til begeret og homogenize i 1 minutt.
- Etter homogenisering helle 1% PVA, PLGA microparticle løsning i 100 mL 0,5% PVA løsningen på et rør plate og rør i minst 4 timer for løsemiddel fordampning i kjemisk hette.
- Vask partikler 3 ganger i Ionisert vann.
- Hell partikkel løsningen i 50 mL konisk rør og sentrifuger 3000 x g i 5 minutter. Hell ut nedbryting og tilsett ca 20 mL DI vann.
- Resuspend partikler av vortexing. Når resuspended, fylle opp konisk rør til 50 mL med DI vann.
- Vask igjen på samme måte to ganger.
- Hydrogenion syntese
- Veie ut 200 mg PLGA i scintillation ampuller og løses i 5 mL DCM. Vortex å oppløse PLGA.
- Plass et beaker med 50 mL 1% PVA løsning i container fylt med is. Plass sonicator sonden i begeret så nær bunnen som mulig uten å berøre. Begynner sonication og umiddelbart legge PLGA løsning i begeret. Sonicate med en 12 M i 2 minutter å generere nanopartikler med en omtrentlig diameter på 200 nm.
- Etter sonication, helle 1% PVA, PLGA hydrogenion løsning til en 100 mL 0,5% PVA løsning på et rør plate og rør i minst 4 timer for løsemiddel fordampning i kjemisk hette.
- Hell partikkel løsningen i 50 mL konisk rør og sentrifuger 3000 x g i 5 minutter å fjerne microparticles. Fjerne nedbryting og hell i høy hastighet sentrifuge rør.
- Vask partikler 3 ganger med DI vann. Sentrifuge 40.000 x g i 15 minutter. Hell ut nedbryting og resuspend i DI vann av vortexing. Vask igjen på samme måte to ganger.
2. fabrikasjon av polymere partikler av Tunable figur
- Etter vask PLGA resuspend partikler tre ganger, partikler i ca 1 mL av Ionisert vann. Legge til filmen casting løsningen partikler for siste partikkel konsentrasjonen av 2,5 mg/mL partikler.
- Pipetter partikkel suspensjon i 10 mL dele i 75 x 50 mm rektangulære Petri retter endimensjonal strekker eller i 15 mL dele inn 100 x 100 mm firkantet Petri retter for todimensjonal strekking. Fjern bobler av enten pipette eller skyve bobler til side og la filmer tørr overnatting i kjemisk hette.
- Når filmer har tørket, fjerne filmer fra plast retter med pinsett og kuttet kantene av filmer med saks. Lagre kantene i et 50 mL konisk rør brukes som sfæriske partikler.
- Laste inn en film på den automatiserte tynnfilm strekker enheten ved å montere en film på aluminium blokker. For 1D stretching, montere film på aluminium blokker av en akse av båren (figur 2) ved å plassere to korte kantene av film mellom to tekstuttrykk neopren gummi. Bruker en Allen fastnøkkel, skru metall tak over gummi å holde filmen på plass. For 2D stretching, montere alle fire kanter på fire aluminium blokker å strekke på begge akser (figur 2).
- Mål og registrere lengden på filmen mellom aluminium blokker på én akse for 1 D strekker eller begge aksene i 2D strekking. Beregne avstanden må strekke filmen i en eller to retninger basert på ønsket fold-stretch.
- Plasser film lastet strekker enheten i en ovn ved 90 ° C og få filmen til temperaturen over 10 minutter. Sett en stor kanne i ovnen med en liten mengde vann.
- Strekke film.
- Når stretching er fullført, Fjern strekker enheten fra ovnen og la filmen avkjøles til romtemperatur i 20 minutter.
- For 1D kuttet stretching, filmen av den strekker innretning på kantene. For 2D stretching, kuttet ut og lagre sentrum for film som strekkes jevnt på begge aksene. Sett filmer i konisk rør med 2 filmer per rør og kast resten av filmen.
- Legge ca 25 mL DI vann til hver konisk rør og vortex til filmene er oppløst.
- Når filmene er oppløst, vask partikler 3 ganger med DI vann.
- For microparticles, fylle opp konisk rør til 50 mL og sentrifuger 3000 x g i 5 minutter, hell ut nedbryting, Legg ca 20 mL DI vann og vortex å resuspend partikler.
- For nanopartikler, overføring partikler høyhastighets sentrifuge rør og sentrifuger 40.000 x g i 15 minutter, hell ut nedbryting, Legg ca 20 mL DI vann og vortex å resuspend partikler.
- Etter tredje vask, resuspend partikler i ca 1 mL av Ionisert vann. Ta vekten av microcentrifuge røret og legge partikler til røret. Fryse partikler i en fryser for-80 ° C i 1 time eller flash fryse i flytende nitrogen. En gang frosset, lyophilize partikler over natten.
- Når lyofiliserte, veie partikler i microcentrifuge røret og trekker registrert vekten av Tom røret for å fastslå vekten lyofilisert partikler.
3. overflate Protein Bøyning lage kunstige Antigen presentere celler
- Forberede 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer. Lage en 0.1 M løsning av MES i vann, og justere pH 6.0 ved titrering med 1M natriumhydroksid (NaOH).
- Resuspend lyofilisert PLGA/PBAE mikro/nanopartikler på 20 μg/mL MES buffer av vortexing. Fyll en polypropylen microcentrifuge tube med 900 μL MES buffer og tilsett 100 μL av partikkel løsningen røret.
- Forberede EDC/NHS løsning. Oppløse 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) og 48 mg N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) i 1 mL MES buffer.
- Legg til 100 μL EDC/NHS løsning partikler og vortex å blande.
- Inkuber røret på en inverter ved romtemperatur i 30 minutter.
- Nedspinning microparticles 5000 x g i 5 minutter, eller nanopartikler 17000 x g i 5 minutter. Forkast nedbryting og resuspend i 1 mL PBS ved vortexing (microparticles) eller sonicating på 2-3 M i 5 sekunder (nanopartikler).
- For microparticles, legge til 8 μg ønsket signal 1 protein og 10 μg anti-musen CD28 (klone 37.51) partikler. Legge til 16 μg signal 1 og 20 μg anti-musen CD28 nanopartikler. Legge til PBS å bringe volumet i røret til 1.1 mL.
- Inkuber røret på en inverter på 4 ° C over natten.
- Neste dag, vask partikler. Nedspinning microparticles 5000 x g i 5 minutter, eller nanopartikler 17000 x g i 5 minutter. Forkaste nedbryting og resuspend partikler i 1 mL steril PBS ved vortexing (microparticles) eller sonication på 2-3 M i 5 sekunder (nanopartikler). Gjenta to ganger.
- Resuspend partikler på ønsket konsentrasjonen i kultur medium for omgående bruk. For langtidslagring, resuspend partikler på 10 mg/mL i en 100 mM sucrose løsning. Fryse lyophilize og lagre partikler på-80 ° C.
4. karakterisering og evaluering av aAPC
- Karakterisering av aAPC størrelse og form (Figur 3)
- Kjennetegner microparticle størrelse og form av tenkelig partikler bruker skanning elektronmikroskop (SEM). For SEM tenkelig, spre lyofilisert partikler på karbon bånd overholdt en tack og spraking frakk med gull-palladium.
- Analysere størrelsen og størrelsesforholdet partikler bruker analyseprogramvare.
- For å bestemme partikkelstørrelse, angi skala bruker skala bar og måle partikkel diameter. Gjenta for ca 100 partikler for å bestemme gjennomsnittlig partikkel diameter og generere et histogram for partikkelstørrelser.
- For å bestemme proporsjoner, måle avstanden over den lange og korte aksen partikler og dele lange aksen av kort axis. Gjenta for ca. 50 partikler av hver figur for å bestemme gjennomsnittlig partikkel størrelsesforholdet for hver figur og generere histogrammer.
- Karakterisere hydrogenion størrelse og form av imaging partiklene ved hjelp av overføring elektronmikroskop (TEM). Analysere størrelsen og størrelsesforholdet nanopartikler bruker analyseprogramvare som beskrevet i 5.1.2. Du kan også måle sfærisk hydrogenion størrelse dynamisk lysspredning (DLS) eller hydrogenion sporing analyse (NTA).
- Protein Bøyning effektivitet
- Forberede aAPC ut metodene 1-3, men i trinn 3.7 bruker fluorescently merket signal 1 protein og anti-musen CD28. Etter bøyning og vask, resuspend aAPC i 1 mL PBS for en siste konsentrasjon av 2 mg/mL aAPC.
- Forberede protein standarder i en svart polystyren 96-brønnen microplate. Legge til 5 μg fluorescently merket signal 1 protein PBS i første brønn av platen og gjør 10 1:2 fortynninger i PBS bortover raden av platen. La den siste godt tomt. Gjenta dette trinnet for å generere et nytt sett med standarder med fluorescently merket anti-CD28.
- Pipetter 100 μL aAPC løsningen i Repliker brønner på den svarte polystyren microplate i tre eksemplarer.
- Les fluorescens på en fluorescens plate leser på de aktuelle bølgelengdene. Bruk fluorescens målingene fra protein standardene for å generere standard kurver for hver fluorescerende antistoff. Bruk av standardkurven, beregne konsentrasjoner av signal 1 og anti-CD28 i hvert eksempel godt, og deretter beregne overflaten protein og Bøyning effektivitet (figur 4A, figur 5A).
- Evaluering av aAPC for i vitro stimulering av CD8 + T celler
- Forberede B' media (RPMI medium med L-glutamin, 10% FBS, 1% ikke-essensielle aminosyren løsning, 1% natrium pyruvate, 1% MEM Vitamin løsning, 92 μM β-mercaptoethanol, 10 ng/mL ciprofloxacin og 30 U/mL IL-2.
- Ofre en svart 6 musen via karbondioksid eksponering.
- Høste milten fra musen etter en tidligere etablert protokoll16. Samle milten i en 50 mL konisk rør med 10 - 15 mL PBS. Bruker en pistil, MOS milten gjennom en 70 µm celle sil i et 50 mL konisk rør. Under Mose, vask silen med 40 mL PBS.
- Spinn splenocytes på 300 x g i 5 minutter. Hell av nedbryting og resuspend splenocytes i 4 mL Ack Lysing bufferen til lyse røde blodlegemer. Tillate røret å sitte uforstyrret i 1 minutt, deretter legge PBS å bringe volumet i røret til 20 mL.
- Spinne cellene på 300 x g i 5 minutter. Hell av nedbryting og resuspend cellene i 1 mL av PBS. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Spinn cellene på 300 x g i 5 minutter og resuspend i det ønskede volumet celle separasjon bufferen. Isolere CD8 + T celler fra enkelt celle suspensjon hjelp av et CD8 + negative T celle isolering kit, etter produsentens protokoll.
- Etter magnetiske separasjon, spinn CD8 + T celler på 300 x g i fem minutter og fjerne celle separasjon bufferen. Resuspend celler i 1 mL av PBS og telle celler. Merke celler med carboxyfluorescein succinyl ester (CFSE) i henhold til produsentens protokollen.
- Inkuber 8,333 CD8 + T celler og 0.0833 mg, eller ønsket dose aAPC i 150 μL B' medier i hver brønn på en 96 vel U-vev kultur-behandlet bunnplaten.
- Ruge på 37 ° C i 7 dager. Etter 3-4 dager, oppdatere kultur medium ved å legge til 75 μL frisk medium i hver brønn.
- Etter 3 dager med inkubering, analysere CFSE merket cellene i en flyt cytometer å vurdere spredning. Hver topp på flyt cytometri CFSE histogrammet representerer en generasjon av på grunn av CFSE fortynning hver påfølgende celledeling.
- Etter 7 dager, bruk en hemocytometer for å telle antall celler i hver brønn. Før telling, beis døde celler med en Trypan blå løsning. Utelukke døde celler fra siste celletall. Normalisere den siste celle konsentrasjonen til den innledende konsentrasjonen å beregne kaste-utvidelsen (Figur 4 og figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk for automatisert 2D tynn film strekker enheten er gitt i figur 1. En skjematisk og beskrivelse for en 1D tynn film strekker enheten er gitt i Ho et al.17 båren er konstruert av aluminium deler bruke standard fresing og maskinering teknikker. Lik 1D båren, 2D båren består av metallisk grep og guide skinner. Toveis bly skruer brukes til å oversette lineær til roterende bevegelse. Bly skruene er den vedlagte via mekanisk kraner til identiske stepper motors med tilstrekkelig dreiemoment. 8 stepper motorstyring ledninger kan soldered på 8-pinners varmebestandig amphenol kontakter for lett vedlegg til kontroll konsollen i en ovn for tynnfilm strekking. Polytetrafluoroethylene (PTFE) belagt wire lang nok må brukes til å koble stepper motors til driverne i styrekonsollen. Anbefalt computer kontrollen ordningen er gitt i figur 1A. De to motorene må kobles gjennom varmebestandig ledninger til 2 uavhengige drivere. Førerne må deretter kobles til en microcontroller grensesnitt med en datamaskin. Driverne skal kobles til x-aksen og y utganger på microcontroller. Driverne og microcontroller begge krever en ekstern strømforsyning. Før du kobler strømforsyningen til disse tre komponentene anbefales det at en 4 A sikring settes inn mellom hver av drevet tilkoblinger til å beskytte komponenter mot gjeldende overbelastning. Til slutt, microcontroller kan kobles via en parallell Port inngang til en datamaskin via en DB25 Male til hann kabel. Elektronikk brukes til å kontrollere stepper motors er varme følsom og derfor må plasseres utenfor noen varmekilde (for eksempel ovn) brukes under operasjon for å varme de tynne filmene til tilstrekkelig temperatur aktivere strekker. Selv om den anbefalte motorer er varmebestandig til temperaturen angitt i denne protokollen for å strekke partikler, vil motorer og drivere bygge opp ekstra varme mens de er knyttet til hoved strømforsyningen. Det anbefales derfor at apparatet bare slås på i løpet av faktisk film strekker seg for å redusere potensielle varmeoppbygging.
PLGA nano- og microparticles ble syntetisert bruke enkelt emulsjon teknikkene som beskrives i denne protokollen og fotografert med TEM (figur 3A) og SEM (figur 3B), henholdsvis. Sfærisk nanopartikler hadde en diameter på 237.3 ± 4.0 nm målt ved DLS og 224 nm målt ved NTA (Figur 3 c). Microparticles ble syntetisert ved homogenisering 5000 RPM generere sfæriske partikler med en gjennomsnittlig diameter på 3 ± 1 μm (figur 3D). Partiklene var strukket bruke automatiserte filmen strekke enhet i 90 ° C i én dimensjon til å generere spheroid ellipsoidisk nano- og microparticles og strukket til 70 ° C i to dimensjoner til å generere oblate ellipsoidisk partikler. Sideforholdene til microparticles av alle tre figurene ble analysert ved måle lange aksen og kort aksen avstand partikler og dele to. Sfærisk microparticles hadde et størrelsesforhold på 1.05 ± 0,04, mens 1D strukket spheroid ellipsoidisk partikler hadde større størrelsesforholdet på 3,6 ± 0,8 (figur 3E). 2D strukket oblate ellipsoidisk partikler hadde et størrelsesforhold på 1,2 ± 0,2, omtrent som et størrelsesforhold på en.
EDC/NHS reaksjon kjemi ble brukt til å bøy en fluorescently merket peptid-lastet MHC IgG dimer og anti-CD28 mot overflaten av strekkes og sfærisk PLGA partikler. Bøyning effektivitet resultater viser lignende mengder protein på overflaten av sfærisk og ellipsoidisk mikro-aAPC (figur 4A) og nano-aAPC (figur 5A) og demonstrere at protein kobling under aAPC syntese oppstår i en konsentrasjon-avhengige måte. For å evaluere effekten av figuren på aAPC funksjonalitet, sfærisk og spheroid ellipsoidisk aAPC konjugert med gp100 lastet MHC IgG dimer og anti-CD28 ble brukt til å stimulere PMEL transgene CD8 + T celler. T celler ble merket med CFSE og evaluert av flowcytometri etter 3 dager å vurdere spredning (figur 4B, 5B). Spheroid ellipsoidisk aAPC ble funnet for å indusere høyere nivåer av T celle spredning på sub mette doser enn sfærisk aAPC, med de beste separasjonen oppnås ved en 0,01 mg dose. Etter 7 dager, var de T-cellene manuelt telles. Spheroid ellipsoidisk aAPC mer effektivt stimulert T celler i forhold til sine sfærisk kolleger på Mikroskala (figur 4C) og nanoskala (figur 5C), og doseavhengig T celleutvidelse ble observert.
Figur 1: skjematisk fremstilling av automatiserte tynnfilm båre. (A) skjematisk av kontroll konsollen for tynnfilm båre. (B) skjematisk mekanisk maskinvare for tynnfilm båre. (Venstre) Oversiktsbilde av mekanisk maskinvare. (Høyre) Tverrsnitt av gripende mekanisme for tynne filmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: bilder av sammensatte automatisert tynnfilm båre å strekke polymere partikler til Anisotrop figurer. Den 2D tynnfilm strekker enhet består av to akser med aluminium ridedyr som grep filmen. De to aksene inneholde bly skruene i motsatte retninger slik at de flytter fra hverandre. For å automatisere strekker prosedyren, er en USB knyttet microcontroller koblet til to stepper motor drivere som stafett signaler til Unipolare stepper motorer gjennom en termisk kabel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: størrelsen og størrelsesforholdet analyse av sfærisk og ellipsoidisk PLGA partikler. (A) TEM og (B) SEM bilder av sfærisk, 1D strukket spheroid ellipsoidisk og 2D strukket oblate ellipsoidisk PLGA (A) nanopartikler og (B) microparticles. (C) sfærisk nanopartikler var størrelse av NTA og fastslått å være 224 nm i diameter. SEM bilder av PLGA microparticles ble analysert for (D) størrelsesDistribusjon av sfæriske partikler og (E) sideforholdene til alle partikkel figurer. (C) gjengis og tilpasset med tillatelse fra små13Copyright Wiley-VCH 2015. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: karakterisering og funksjonelle vurdering av sfærisk og spheroid ellipsoidisk mikro-aAPC. (A) Bøyning effektiviteten av fluorescently merket peptid-lastet MHC IgG dimer og anti-CD28 mot overflaten av sfærisk og spheroid ellipsoidisk microparticles. (B) CD8 + T celler ble merket med CFSE, og inkubert med sfærisk og 1D-strukket mikro-aAPC på 0,01 og 0,1 1 mg doser eller ikke-beslektet kontroller. Etter 3 dager, ble celler vurdert av flowcytometri å vurdere spredning. (C) T celler ble også vurdert etter 7 dager av manuelle telle. Celletall var normalisert første greven å beregne kaste utvidelse. For sammenligning mellom spheroid ellipsoidisk og sfærisk fold ekspansjon, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, og *** = p < 0,001. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (SEM) for 3 gjentak. Gjengitt og tilpasset med tillatelse fra biologisk materiale12, Copyright Elsevier 2014. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: karakterisering og funksjonelle vurdering av sfærisk og spheroid ellipsoidisk nano-aAPC. (A) Bøyning effektiviteten av fluorescently merket peptid-lastet MHC IgG dimer og anti-CD28 mot overflaten av sfærisk og spheroid ellipsoidisk nanopartikler. (B) CD8 + T celler ble merket med CFSE, og inkubert med sfærisk og spheroid ellipsoidisk nano-aAPC av varierende fold-strekning på 0,01 og 0,1 1 mg doser. Etter 3 dager, ble celler vurdert av flowcytometri å vurdere spredning. (C) T celler inkubert med spheroid ellipsoidisk partikler av varierende fold strekningen (alt fra 1,5 til 3,5) ble også vurdert etter 7 dager av manuelle telle. Celletall var normalisert til en ubehandlet tilstand beregne kaste utvidelse. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, og *** = p < 0,001 sammenlignet sfærisk. Feilfelt representerer standard feil av gjsnitt (SEM) for 3 gjentak. Gjengitt og tilpasset med tillatelse fra små13Copyright Wiley-VCH 2015. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen detaljer en allsidig metode for presis generasjon av Anisotrop polymere partikler. Tynnfilm strekker teknikken beskrevet her er skalerbar, svært reproduserbare og billig. Alternative teknikker for å generere Anisotrop partikler lider mange begrensninger, inkludert høy pris, lav overføringshastighet og begrenset partikkelstørrelse. Tynnfilm strekker tilnærming er også en fordel fordi partiklene er endret slik at Anisotrop etter syntese, og resultatet er kompatibel med en rekke partikkelstørrelser og syntese teknikker. Figur 1 viser oppsettet av den automatiserte todimensjonal strekker innretning. Denne enheten kan også brukes uten de elektroniske komponentene av manuelt dreie skruene til filmen har nådd ønsket grad av strekking. Vi har imidlertid funnet at den automatiserte prosessen er mye mer konsekvent og rask enn manuell drift15. Ulike teknikker er utviklet for å syntetisere Anisotrop partikler som microfluidic tilnærminger17,18,19, lag-på-lag belegg21og andre opp-syntese tilnærminger21 ,22. Men disse Aktiver ikke sterk kontroll over partikkel geometri og er ikke så allsidig figurer som kan genereres og partikkel materialer som kan brukes. En populær topp-ned-metode for fabrikasjon nonspherical partikler er partikkel replikering i ikke-Wetting maler (PRINT)24. Selv om PRINT gjør nøyaktig kontroll over partikkel formen, det krever dyre maskiner og er ikke så tilgjengelig og enkel å implementere som tynnfilm strekker seg metode.
Enkelt emulsjon teknikken kan brukes å dikte PLGA partikler av ulike størrelser, fra nano til Mikroskala12,13. Av varierende homogenisering hastighet eller sonication amplitude, kan microparticle og hydrogenion størrelse, henholdsvis omformes. Når sfæriske partikler har blitt generert, kan tynnfilm strekker metoden beskrevet her brukes å deformeres partikler i ulike figurer15. I denne protokollen beskriver vi generering av spheroid og flattrykte ellipsoidisk partikler av strekker seg i en eller to dimensjoner, henholdsvis. Sfæriske partikler er kastet i en tynn plast film, som er oppvarmet over glass overgang temperaturen på PLGA og strukket i en eller to dimensjoner å deformeres partikler. Størrelsesforholdet for partiklene er svært kontrollerbare. Ved å justere graden av filmen strekk, størrelsesforhold partikler kan være modulert, og vi har funnet at målt partikkel sideforholdet er sterkt korrelert med den anslåtte verdi12,13. Forskjellige andre figurer kan genereres ved å endre temperaturen under strekking eller graden av strekking. For eksempel kan biconcave discoidal partikler som ligner form av røde blodlegemer genereres ved å strekke microparticles 1.5-fold to dimensjoner på 90 ° C. 15. denne filmen strekker teknikken er også brukt til å transformere sfærisk polystyren partikler til mange Anisotrop figurer, inkludert ormer, fat og rektangulær plater21. Filmen strekker enheten kan brukes ved å manuelt kontrollere skruer eller enheten kan automatiseres som vist i figur 1 å gjøre prosessen mer effektiv og konsekvent15. Denne enkle teknikken gir pålitelig Anisotrop partikler som beholde sin form under fysiologiske forhold24. Videre, denne metoden er brukt på andre polymere materialer, i tillegg til PLGA, som polycaprolactone (PCL) og hybrid partikler av PLGA og poly (beta-amino ester) (PBAE).
Denne protokollen beskriver også hvordan PLGA partikler av variert størrelse og form kan være likt med overflaten proteiner kreves for CD8 + T celle aktivering som aAPC. Proteiner kan være covalently konjugert Anisotrop og sfærisk PLGA mikro- og nanopartikler av EDC/NHS mediert koblingen av primære aminer på proteiner carboxyl grupper på partikkel overflaten. Effektiviteten av protein Bøyning kan måles ved å koble fluorescently merket protein på overflaten av partikler som beskrevet i denne protokollen, og vi har funnet at denne teknikken par protein til partikler på 15-20% effektivitet12, 13. Spheroid ellipsoidisk mikro- og hydrogenion aAPC er mer effektive enn sine sfærisk kolleger på aktivere CD8 + T celle spredning og ekspansjon i vitro12,13. Ellipsoidisk aAPC har forbedret binding til og samspill med T-celler på grunn av deres større areal for kontakt12. Anisotrop partikler har også førsteklasses eiendommer over sfæriske partikler i vivo deres forbedret biodistribution og motstand mot fagocytose13. Denne plattformen er svært modulær og kan tilpasses mange andre stoffet levering programmer. Bruker denne fremgangsmåten, polymere partikler av tunable form og størrelse kan genereres og partikkel overflaten kan bli bøyd med en protein av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891) og KRR (DGE-1232825) Takk programmet NSF Graduate forskningsstipend for støtte. RAM Takk National Research Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) og prestasjon belønningen for College forskere fellesskap støtte. Forfatterne takker NIH (R01EB016721 og R01CA195503), forskning for å hindre blindhet James og Carole gratis katalysator prisen, og JHU Bloomberg-Kimmel Institutt for kreft immunterapi for støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
- Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
- Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
- Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
- Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
- Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
- Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
- Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
- Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
- Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
- Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
- Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
- Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
- Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
- Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
- Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
- Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
- Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
- Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
- Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
- Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).
