Summary
여기, 우리는 빨리 그리고 reproducibly 생물학적 영감, 생 분해성 유일 항 원 제시 세포 (aAPC) 가변 크기, 모양, 및 T 셀 확장 비보 전 또는 vivo에서 표면 단백질 프레 젠 테이 션을 생성 하는 프로토콜을 제시 .
Abstract
인공 항 원 제시 세포 (aAPC)는 T 세포를 자극 하는 강력한 능력으로 인해 면역 변조에 대 한 유망한 플랫폼입니다. Acellular 기판 신호 프레 젠 테이 션 매개 변수 정밀 제어 및 aAPC 표면 조절 T 세포와의 상호 작용의 물리적 속성을 포함 하는 셀 기반 aAPC에 비해 주요 장점을 제공 합니다. 비 등방성 입자에서 건설 aAPC 특히 타원 입자 자극 T 세포 증가 바인딩 및 T 세포에 사용할 수 있는 더 큰 표면 영역에 구형 들 문의 또한 보다 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다 로 일반적인 이해 및 향상 된 pharmacokinetic 속성 감소. 비 등방성 입자에 대 한 관심 증가도 불구 하 고도 광범위 하 게 구현 하 고 사용할 reproducibly 도전적 일 수 있다 박막 스트레칭과 같은 비 등방성 입자를 생성의 방법 허용.
이 위해, 우리는 가변 크기, 모양, 생 분해성 비 등방성 입자 기반 aAPC의 급속 하 고, 표준화 된 제조에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 T 세포 확장 비보 전 또는 vivo에서함께 하는 방법에 대 한 프레 젠 테이 션을 신호 그들의 크기, 형태, 및 표면 단백질 콘텐츠, 특성 및 그들의 기능을 평가 하기 위해. 이방성 aAPC 날조에이 접근은 확장 가능 하 고 재현성, 이상적 aAPC "상용" immunotherapies에 대 한 생성.
Introduction
그들은 강력한 항 원 특정 T 세포 응답을 생성할 수 있기 때문에 인공 항 원 제시 세포 (aAPC) immunomodulatory 대리인으로 약속으로 나타났습니다. 이러한 플랫폼에 필수적인 그들의 능력을 효율적으로 T 세포 활성화에 대 한 중요 한 신호를 제시 있습니다. 그들은 쉽게 하 고 적은 비용이 많이 드는 조작, 스케일 업 및 번역, 중 적은 직면 및 세포 기반 치료와 관련 된 위험을 완화 하기 때문에 acellular aAPC 셀 기반 aAPC에 매력적인 대안 있습니다. Acellular aAPC는 또한 높은 정도의 제어 신호 프레 젠 테이 션 매개 변수 및 T 세포1인터페이스 표면의 물리적 특성에 대 한 수 있습니다.
aAPC는 2 개의 신호 T 세포 활성화에 대 한 필수 최소를 정리 해야 합니다. 신호 1 항 원 인식 하며 T 세포 수용 체 (TCR)를 인식 하 고 I 또는 II 베어링의 동족 항 원 TCR 복잡 통해 신호에 culminating MHC 클래스와 함께 종사 하는 경우에 발생 합니다. 항 원 특이성 요구 하지 않아도, aAPC 시스템은 종종 agonistic 단일 클론 항 체를 nonspecifically TCR 복잡 한 자극 CD3 수용 체에 대 한 부담. MHC, 특히 MHC multimers의 재조합 형태도 제공 하는 항 원 특이성2,3를 aAPC의 표면에 사용 되었습니다. 신호 2는 T 세포의 활동을 지휘 한 costimulatory 신호가 이다. T 세포 활성화에 필요한 costimulation를 하려면 CD28 수용 체는 일반적으로 자극 agonistic aAPC 표면에 항 체와 다른 costimulatory 수용 체 4-1BB 등 성공적으로 대상된4있다 지만. 1 및 2 신호 단백질은 일반적으로 합성 aAPC 엄밀한 입자의 표면에 움직일 수 있습니다. 역사적으로, aAPC 폴리스 티 렌4,5 와 철 dextran6을 포함 하 여 물자의 다양 한에서 조작 되어 있다. 폴 리 유산 공동 glycolic acid ()와 같은 생 분해성 고분자를 활용 하는 새로운 시스템 (PLGA)을 단백질 신호를 쉽게 결합 될 수 있다, 직접 관리에서 vivo에서, 적합의 지속적인된 출시를 촉진할 수 있다 aAPC 생성 하 cytokines 또는 T 세포 활성화7,8을 증가 시키기 위해 수용 성 요소를 캡슐화.
필요한 신호 단백질의 존재 뿐만 아니라 aAPC/T 세포 상호 작용 하는 동안 충분히 큰 표면 영역 수용 체 참여 T 세포 활성화를 위해 필수적 이다. 따라서, 크기와 모양이 같은 aAPC의 물리적 매개 변수 크게 사용할 수 있는 그들의 접촉 영역을 변경 하 고 T 세포를 자극 하는 그들의 기능에 영향을 미칠. 미크론 크기 aAPC 그들의 nanoscale 대응9,10보다 T 세포 자극에 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다. 그러나, 나노 aAPC 우수한 biodistribution와 마이크로 aAPC11에 그들의 성능에서을 vivo에서 향상 시킬 수 있습니다 림프절에 더 나은 배수 장치를 가질 수 있습니다. 모양은은 aAPC 입자 기반 시스템에 대 한 관심의 또 다른 변수 이다. 이방성 aAPC 최근 대상 세포 감소 일반적인 셀 글귀와 결합 하 여 향상 된 상호 작용 때문에 주로 자극 T 세포에서 등방성 입자 보다 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다. 셀 우선적으로 타원 입자의 긴 축에 바인딩할 고 큰 반지름 곡률 및 아첨 표면 aAPC T 셀12사이의 더 많은 접촉. 타원 입자의 긴 축에는 먹어서를, 증가 순환 시간 관리12,13 vivo에서 다음 구형 입자에 비해 결과 또한 낙담 한다. 이러한 이점 때문에 타원 입자는 효과 관찰 마이크로 및 nanoscales12, 항 원 특정 T 세포에서 생체 외에서 그리고 vivo에서 , 구형 입자에 비해의 큰 확장 중재 13. 비 등방성 입자를 조작 하는 다양 한 전략이 있다 하지만 박막 스트레칭 방법은 간단 하 고 널리 허용 다양 한 입자 모양14의 범위를 생성 하는 데 사용. 합성, 다음 입자 영화에 캐스팅 되며 입자 물자의 유리 전이 온도 이상의 온도에서 하나 또는 두 개의 크기에 기지개. 영화는 입자를 검색 하려면 다음 해산 된다. 비 등방성 입자에 대 한 관심 증가도 불구 하 고 조작 입자 기반 aAPC에 대 한 현재 접근은 주로 등방성 시스템 및 입자 모양 변경 방법 구현 하기 어려운, 호환 되지 않는 특정 aAPC 합성 수 전략, 그리고 부족 정밀도 재현성15. 우리의 박막 스트레칭 기법 수동으로 수행 하거나 빠르게 다양 한 생 분해성 고분자 합성 비 등방성 입자 생성을 자동화 된 방식에서 하나 또는 두 개의 크기15에서 원하는 종횡비를 뻗어 될 수 있습니다.
우리의 이전 작품을 바탕으로, 우리는 생 분해성 입자 기반 접근 방식을 개발 결합 기술로 확장 가능한 박막 스트레칭 빠르게 T 셀 확장 비보 전 또는 에 대 한 표준화 된 방식 aAPC 가변 크기와 형태를 생성 하 vivo. 주는이 aAPC 시스템 유연성의 높은 수준의 원하는 밀도, 입자 표면에 carboxyl 그룹에 관심의 모든 protein(s) 하 우리의 단백질 활용 전략을 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 크기, 형태, 및 표면 단백질, aAPC의 콘텐츠를 특성화 하 고 그들의 기능에서 생체 외에서평가 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 면역 세포 vivo 전 또는 vivo에서 immunotherapeutic 응용 프로그램의 다양 한 확장을 쉽게 적용할 수 있습니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 존스 홉킨스 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 가변 크기의 구형 PLGA 입자의 제조
- 입자 합성에 대 한 자료의 준비
- 5 %w / w 폴 리 비닐 알코올 (PVA) 솔루션을 준비 합니다.
- 마그네틱 볶음 바 삼각 플라스 크에 이온된 (DI) 수의 500 mL를 추가 하 고 온도계로 핫 플레이트 활동가 500 rpm 및 모니터 온도에 놓습니다. 증발을 방지 하기 위해 은박지와 플라스 크를 커버.
- 물 온도 약 70 ° C에 도달 하면 추가 25 g 총 PVA의 작은 배치에서 시간이 지남에, PVA를 더 추가 하기 전에 해산을 기다리는.
- 모든 PVA (일반적으로 30-60 분)를 해산 하 고, 일단 하자 솔루션 시 원하고 살 균 필터. 나중에 사용할 4 ° C에서 저장 합니다.
- 10 %w / w PVA의 영화 캐스팅 솔루션 및 2 %w / w 글리세롤을 준비 합니다.
- 마그네틱 볶음 바 삼각 플라스 크에 디 물 500 mL를 추가 합니다. 실내 온도와 혼합 분쇄 하 여 글리세롤의 8 mL를 추가 합니다.
- 온도계로 핫 플레이트 활동가 500 rpm 및 모니터 온도 플라스 크를 놓습니다. 증발을 방지 하기 위해 은박지와 플라스 크를 커버.
- 솔루션 온도 약 70 ° C에 도달 하면 추가 50 g 총 PVA의 작은 배치에서 시간이 지남에, PVA를 더 추가 하기 전에 해산을 기다리는.
- 모든 PVA (일반적으로 60 분)를 해산 하 고, 일단 0.22 μ m의 기 공 크기와 병 가기 진공 필터 시스템을 사용 하 여 솔루션 시 원하고 살 균 필터를 하자. 미래 사용을 위한 실내 온도에 상점.
- 50 mL 1 %w / w PVA 솔루션을 준비 합니다. 100-150 mL 비 커에 디 물과 5 %PVA 솔루션 (1.1.1에서 만든)의 10 mL 40 mL를 추가 합니다.
- 100 mL 0.5 %w / w PVA 솔루션을 준비 합니다. 150-250 mL 비 커에 90 mL 디 물과 5 %PVA 솔루션의 10 mL를 추가 합니다.
- 자기 저 어 바 0.5 %PVA 솔루션 및 500 rpm에서 실내 온도에 저 어 접시에 화학 후드에 장소를 추가 합니다.
- 5 %w / w 폴 리 비닐 알코올 (PVA) 솔루션을 준비 합니다.
- Microparticle 합성
- 폴 리 (유산 공동 glycolic 산)의 100 밀리 그램으로 무게 (PLGA) 섬광 유리병 및 dichloromethane (DCM) 5 mL에 녹 인. 소용돌이 PLGA 분해입니다.
- 균질 화기는 그것을 건드리지 않고도 가능한 비 커의 하단에 가까이 있도록 50 mL 1 %PVA 솔루션에 균질 화기를 배치 합니다. 균질 화기 설정 하 고 원하는 속도를 조정-5 μ m 직경 입자, 3 μ m, 1 μ m (균질 속도 감소 입자 크기 증가)에 대 한 15000 rpm에 대 한 5000 rpm에 대 한 3200 rpm. 일단 원하는 속도로 비 커를 PLGA 솔루션을 추가 하 고 1 분간 균질 키를 누릅니다.
- 균질, 후에 부 어 1 %PVA, PLGA microparticle 솔루션 화학 후드에서 용 매 증발에 대 한 적어도 4 시간 동안 저 어 저 어 접시에 100 mL 0.5 %PVA 솔루션으로.
- 디 물에 3 번 입자를 씻어.
- 5 분 동안 50 mL 원뿔 튜브와 3000 x g에서 원심 분리기로 입자 솔루션을 붓는 다. 상쾌한에 밖으로 부 어와 디 물 약 20 mL를 추가.
- Vortexing에 의해 입자를 resuspend. Resuspended, 일단 디 물 50 ml 원뿔 튜브를 작성.
- 씻고 다시 같은 방법으로 두 번 더.
- 나노 입자 합성
- DCM의 5 mL에 용 해 및 섬광 유리병에 PLGA의 200 밀리 그램을 무게. 소용돌이 PLGA 분해입니다.
- 장소 비 커 50ml 1 %PVA 솔루션 컨테이너에는 얼음으로 가득합니다. 건드리지 않고 최대한 바닥에 가까운 비 커에 sonicator 프로브를 놓습니다. 쥡니다 시작 하 고 즉시 비 커에 PLGA 솔루션을 추가 합니다. 200의 대략 직경이 나노 입자 생성에 2 분 동안 12 W의 전력 sonicate nm.
- 쥡니다, 후에 부 어 1 %PVA, 화학 후드에서 용 매 증발에 대 한 적어도 4 시간 동안 저 어 저 어 접시에 100 mL 0.5 %PVA 솔루션으로 PLGA 나노 솔루션.
- 50 mL 원뿔 튜브와 미 제거에 5 분 동안 3000 x g에서 원심 분리기로 입자 솔루션을 붓는 다. 상쾌한을 제거 하 고 고속 원심 분리기 튜브에 붓는 다.
- 3 번 디 물으로 입자 세척. 40000 x g에서 15 분간 원심. 상쾌한에 밖으로 부 어과 vortexing에 의해 디 물에 resuspend. 씻고 다시 같은 방법으로 두 번 더.
2. 가변 모양의 고분자 입자의 제조
- PLGA 입자를 세 번 세척 후 디 물 약 1 mL에 입자를 resuspend. 2.5 mg/mL 입자의 최종 입자 농도 대 한 입자를 영화 캐스팅 솔루션을 추가 합니다.
- 75 x 50 mm 직사각형 접시 스트레칭 1 차원 또는 2 차원 스트레칭 위한 100 x 100 m m 평방 페 트리 접시에 15 mL aliquots로 10 mL aliquots에서 입자 현 탁 액을 플라스틱. 중 피 펫에 의해 거품 또는 측면으로 밀어 거품을 제거 하 고 화학 후드에 하룻밤 영화 건조 하 게.
- 건조 되 면 영화는, 핀셋으로 플라스틱에서 필름을 제거 하 고가 위 영화의 가장자리를 잘라. 구형 입자 사용 50 mL 원뿔 튜브에 가장자리를 저장 합니다.
- 알루미늄 블록에 필름을 장착 하 여 장치를 기지개 하는 자동화 된 얇은 필름에 영화를 로드 합니다. 1 D 스트레칭, 대 한 알루미늄 블록 들 것 (그림 2)의 한 축에 영화 neoprene 고무의 2 개 조각 사이 영화의 두 짧은 가장자리를 배치 하 여 탑재 합니다. 장소에서 영화를 고무 위에 금속 그립 나사 알 렌 렌치를 사용 하 여. 2D 스트레칭, 대 한 두 축 (그림 2)에 스트레칭 4 개의 알루미늄 블록에 모든 4 개의 가장자리를 탑재 합니다.
- 측정 하 고 1 D 기지개 한 축 또는 양 축 2D 스트레칭을 위한 알루미늄 블록 사이 영화의 길이 기록 합니다. 원하는 배 스트레치에 따라 하나 또는 두 개의 방향으로 영화를 스트레칭 하는 데 필요한 거리를 계산 합니다.
- 90 ° c 오븐에서 영화 로드 스트레칭 장치를 배치 하 고 온도를 10 분 이상 영화를가지고. 적은 양의 물으로 오븐에 큰 비 커를 배치 합니다.
- 스트레치 필름입니다.
- 스트레칭 완료 되 면, 오븐에서 스트레칭 장치를 제거 하 고 20 분 동안 실내 온도에 영화 식힙니다.
- 1 D 스트레칭, 스트레칭 장치에서 필름 가장자리에 잘라. 2D 스트레칭, 잘라 두 축에 균일 하 게 형성 된 필름의 평방 센터 저장. 원뿔 튜브 튜브 당 2 영화와 함께 영화를 놓고 영화의 나머지를 삭제 합니다.
- 영화는 해산 될 때까지 각 원뿔 튜브와 소용돌이를 디 물 약 25 mL를 추가 합니다.
- 영화, 해산 일단 디 물으로 3 번 입자를 씻어.
- 미, 50 mL 및 3000 x g에서 원심 분리기 원뿔 관 5 분에 대 한 채우기, 상쾌한 쏟아, 디 물, 그리고 입자 resuspend에 소용돌이의 약 20 mL를 추가.
- 나노 입자, 고속 원심 분리기 튜브와 40000 x g에서 15 분간 원심 전송 입자 상쾌한 쏟아, 디 물, 그리고 입자 resuspend에 소용돌이의 약 20 mL를 추가 합니다.
- 3 세척 후 디 물 약 1 mL에 입자를 resuspend. Microcentrifuge 관의 무게를 기록 하 고 튜브에 입자를 추가. 액체 질소에서 입자-80 ° C 냉동 실에 1 시간 또는 플래시 동결에 대 한 고정. 즉, 일단 하룻밤 입자 lyophilize.
- 일단 동결 건조 된, microcentrifuge 튜브에서 입자의 무게 하 고 동결 건조 된 입자의 무게를 결정 하는 빈 관의 기록 된 무게 감.
3. 표면 단백질 활용 인공 항 원 제시 세포를 만드는
- 준비 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic 산 (MES) 버퍼. 물에 MES의 0.1 M 솔루션을 만들고 1 M 수산화 나트륨 (NaOH)으로 적정 하 여 pH 6.0 조정.
- Vortexing에 의해 MES 버퍼에 20 μ g/mL에서 동결 건조 된 PLGA/PBAE 마이크로/나노 입자를 resuspend. MES 버퍼의 900 μ와 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브와 튜브를 100 μ 입자 솔루션의 추가.
- EDC/NHS 솔루션을 준비 합니다. 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 및 48 mg N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) 1 mL MES 버퍼에 분해.
- 입자와 혼합 하는 소용돌이를 100 μ EDC/NHS 솔루션을 추가 합니다.
- 30 분 동안 실 온에서 인버터에 튜브를 품 어.
- 5 분, 또는 17000 x g에서 나노 입자에 대 일 분 동안 5000 x g에서 미 아래로 회전 합니다. 상쾌한 삭제 하 고 5 초 (나노)에 대 한 2-3 W에 vortexing (미) 또는 sonicating 1 mL PBS에에서 resuspend.
- 미, 8 μ g 원하는 신호 1 단백질 및 10 μ g 안티 마우스 CD28 (클론 37.51) 입자를 추가 합니다. 나노 입자, 16 μ g 신호 1과 20 μ g 안티 마우스 CD28 추가. 1.1 ml 튜브에 볼륨을가지고 PBS를 추가 합니다.
- 4 ° C에서 인버터에 튜브를 밤새 품 어.
- 다음 날, 입자 세척. 5 분, 또는 17000 x g에서 나노 입자에 대 일 분 동안 5000 x g에서 미 아래로 회전 합니다. 상쾌한, 삭제 하 고 vortexing (미) 또는 5 초 (나노)에 대 한 2-3 W에서 쥡니다 살 균 PBS의 1 mL에 입자를 resuspend. 두 번 반복 합니다.
- 즉각적인 사용을 위해 문화 매체에서 원하는 농도에 입자를 resuspend. 장기 저장을 위한 100mm 자당 솔루션에 10 mg/mL에서 입자를 resuspend. 동결, lyophilize, 그리고-80 ° c.에 입자를 저장
4. 특성화 및 aAPC의 평가
- AAPC 크기와 모양 (그림 3)의 특성
- 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 이미징 입자에 의해 microparticle 크기와 모양 특징. SEM에 대 한 탄소 테이프에 영상, 확산 동결 건조 된 입자는 알루미늄을 준수 압정 및 코트 금-팔라듐을 스퍼터.
- 크기 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 입자의 가로 세로 비율을 분석 합니다.
- 입자 크기를 결정 하려면 눈금 막대를 사용 하 여 규모를 설정 하 고 입자 직경을 측정 한다. 평균 입자 직경을 결정 하 고 입자 크기의 히스토그램을 생성 하는 약 100 입자에 대 한 반복 합니다.
- 가로 세로 비율을 결정 하 긴 축과 입자의 짧은 축 거리를 측정 하 고 짧은 축에 의해 긴 축 분할. 각 셰이프의 각 모양에 대 한 평균 가로 세로 비율을 결정 하 여 히스토그램을 생성 약 50 입자를 반복 합니다.
- 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 입자를 이미징 하 여 나노 크기와 모양 특징. 크기 및 가로 세로 비율 5.1.2에서 설명한 대로 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 나노 입자의 분석. 또는 동적 산란 (DL) 또는 나노 분석 (NTA) 추적을 사용 하 여 구형 나노 입자 크기를 측정 합니다.
- 단백질 활용 효율
- 방법 1-3, aAPC 준비 하지만 단계 3.7에 붙일 레이블된 신호 1 단백질과 반대로 마우스 CD28 사용. 활용 및 세척 후 1 ml PBS 2 mg/mL aAPC의 최종 농도 aAPC resuspend.
- 검은 폴리스 티 렌 96 잘 microplate에 단백질 표준 준비. 접시의 첫 음에서 PBS에 붙일 레이블된 신호 1 단백질의 5 μ g를 추가 하 고 접시의 행에 걸쳐 PBS에서 10 1:2 희석 하 게. 마지막 잘 빈을 둡니다. 붙일 레이블된 안티 CD28 기준의 다른 세트를 생성 하려면이 단계를 반복 합니다.
- 3 중에 검은 폴리스 티 렌 microplate의 복제 우물에 aAPC 솔루션의 100 μ를 플라스틱.
- 적절 한 파장에서 형광 플레이트 리더에 형광을 읽기. 단백질 표준에서 형광 신호를 사용 하 여 각 형광 항 체에 대 한 표준 곡선을 생성. 표준 곡선을 사용 하 여, 각 샘플 잘에서 안티 CD28 신호 1의 농도 계산 하 고 표면 단백질 및 활용 효율 (그림 4A, 그림 5A)의 양을 계산.
- CD8 + T 세포의 생체 외에서 자극에 대 한 aAPC의 평가
- B' 미디어 준비 (L 글루타민, 10 %FBS, 1% 비 필수 아미노산 용액, 1% 나트륨 pyruvate, 1 %MEM 비타민 솔루션, 보완 RPMI 매체 92 μ β-mercaptoethanol, 10 ng/mL ciprofloxacin, 및 30 U/mL 일리노이-2.
- 이산화 탄소 노출을 통해 블랙 6 마우스를 희생.
- 16이전 설립된 프로토콜 따르면 마우스에서 비장을 수확. 10-50 mL 원뿔 튜브에 비장 수집 15 mL PBS. 사용 하는 유 봉, 매 시 비장 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 50 mL 원뿔 관으로. Mashing, 하는 동안 40 mL PBS와 여과기를 세척.
- 5 분 동안 300 x g에서 splenocytes를 회전 합니다. 상쾌한 오프와 붉은 혈액 세포를 lyse Ack Lysing 버퍼의 4 mL에는 splenocytes를 resuspend. 1 분간 앉아 튜브를 그대로 허용 후 20 ml 튜브에 볼륨을가지고 PBS를 추가 합니다.
- 5 분 동안 300 x g에서 세포를 스핀. 상쾌한 오프와 PBS의 1 mL에 셀 resuspend. hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 5 분 동안 300 x g에서 셀을 회전 하 고 세포 분리 버퍼의 원하는 볼륨에 resuspend. CD8 + 부정적인 선택 T 세포 격리 키트, 다음 제조 업체의 프로토콜을 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션부터 CD8 + T 세포를 격리 합니다.
- 자기 분리, 다음 5 분 동안 300 x g에서 CD8 + T 세포를 회전 하 고 셀 분리 버퍼를 제거 합니다. Resuspend 1 mL의 PBS에 셀과 셀. Carboxyfluorescein succinyl 에스테 르 (CFSE) 제조 업체의 프로토콜에 따라 셀 라벨.
- 8,333 CD8 + T 세포 및 0.0833 mg (또는 원하는 복용량) 각 우물에서 150 μ B' 미디어에서 aAPC의는 96의 품 어 잘 U-조직 문화 취급 바닥판.
- 7 일 동안 37 ° C에서 품 어. 3-4 일 후 각 우물에 75 μ 신선한 매체를 추가 하 여 문화 매체를 새로 고칩니다.
- 3 일 후 부 화, CFSE 교류 cytometer 세포 분류 확산을 평가 하기 위해 분석. 교류 cytometry CFSE 히스토그램에서 각 피크 각 연속 셀 부분 CFSE 희석으로 인해 세포의 생성을 나타냅니다.
- 7 일 후에 각 잘 셀 수를 계산 하는 hemocytometer를 사용 합니다. 이전에, Trypan 블루 솔루션 죽은 세포 얼룩. 마지막 셀 카운트에서 죽은 세포를 제외 합니다. 배-확장(그림 4 및 그림 5)를 계산 하기 위해 초기 농도에 마지막 셀 농도 정상화.
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Representative Results
자동화 된 2D 박막 장치를 스트레칭 위한 회로도 그림 1에서 주어진 다. 회로도 및 장치를 스트레칭 1 D 박막에 대 한 설명을 들 것은 알루미늄 부품 표준 밀링 및 가공 기술을 사용 하 여에서 건설 하는 호 외.17 에 부여 됩니다. 1 D 들 것와 마찬가지로, 2D 들 것 금속 그립 및 가이드 레일의 구성 되어 있습니다. 양방향 리드 나사 선형 회전 운동에 번역 하는 데 사용 됩니다. 리드 나사는 충분 한 토크를 가진 동일한 스테퍼 모터를 기계 탭을 통해 연결 된. 8 스테퍼 모터 제어 전선 박막 스트레칭을 위한 오븐 제어 콘솔에 쉽게 첨부 파일에 대 한 8-핀 열 amphenol 커넥터에 납땜 될 수 있다. 소계 (PTFE) 코팅 와이어 충분 한 길이의 스테퍼 모터 드라이버 제어 콘솔에서 연결을 사용 해야 합니다. 추천된 컴퓨터 제어 구조는 그림 1A에서 주어진 다. 두 개의 모터 내 열 배선 2 독립적인 드라이버를 통해 연결 되어야 합니다. 두 드라이버는 다음 컴퓨터와 인터페이스 하는 마이크로컨트롤러에 연결 되어야 합니다. 드라이버는 x 축에 연결 되어야 및 마이크로컨트롤러에 y 축 출력 한다. 드라이버와 마이크로컨트롤러는 외부 전원 공급 장치가 필요합니다. 이러한 세 가지 구성 요소에 전원 공급 장치를 연결 하기 전에 현재 과부하에서 구성 요소를 보호 하기 위해 전원된 연결의 각각 사이 4 A 퓨즈 삽입 될 것이 좋습니다. 마지막으로, 마이크로컨트롤러 DB25 남성 남성 케이블을 사용 하 여 컴퓨터에 병렬 포트 입력을 통해 연결 될 수 있습니다. 스테퍼 모터를 제어 하는 데 사용 하는 전자 열 민감한 고 어떤 열원 (오븐) 등 박막 스트레칭 수 있도록 충분 한 온도에 열 작업 중 사용 외부 배치 되어야 합니다. 비록 권장된 모터는 입자를 스트레칭 위한이 프로토콜에 지정 된 온도까지 내열성, 모터와 드라이버 구축 됩니다 추가 열 주 전원 공급 장치에 연결 하는 동안. 따라서, 장치 실제 영화 잠재적인 열 형성을 최소화 하기 위해 스트레칭의 기간으로 켜져 있을 하는 것이 좋습니다.
PLGA 나노-그리고 미는이 프로토콜에서 설명 하 고 각각 편 (그림 3A)와 sem의 (그림 3B)를 사용 하 여 몇 군데 단일 에멀젼 기술을 사용 하 여 합성 했다. 구형 나노 입자 DL와 224로 측정 된 237.3 ± 4.0 nm의 직경을 했다 NTA (그림 3C)로 측정 된 nm. 미 3 ± 1 μ m (그림 3D)의 평균 직경이 구형 입자를 생성 하기 위해 5000 rpm에서 균질 화에 의해 합성 되었다. 입자는 팽창이 타원 입자 생성 하 prolate 타원 나노-및 미 생성 하 한 차원에서 90 ° C에서 장치를 기지개 하 고 2 차원에서 70 ° C에서 뻗어 자동된 필름을 사용 하 여 신축 했다. 모든 3 개의 도형이의 미의 종횡비는 긴 축과 입자의 짧은 축 거리를 측정 하 고 2 분할 하 여 분석 되었다. 구형 미 1.05 ± 0.04의 가로 세로 비율, 1 D 뻗어 prolate 타원 입자 3.6 ± 0.8 (그림 3E)의 큰 화면 비율 했다. 2D 뻗어 팽창이 타원 입자 1.2 ± 0.2, 대략의 가로 세로 비율을 유지 가로 세로 비율을 했다.
EDC/NHS 반응 화학 켤레를 붙일 이라는 펩 티 드 로드 MHC IgG 이합체 및 안티 CD28 항 체 뻗어와 구형 PLGA 입자의 표면에 사용 되었다. 활용 효율성 결과 구형 및 타원 마이크로-aAPC (그림 4A)와 (그림 5A) 나노-aAPC의 표면에 단백질의 비슷한 금액을 입증 하 고 aAPC 합성 동안 결합 하는 단백질에서 발생 하는 것을 입증 한 농도-종속 방식입니다. AAPC 기능에 모양의 효과 평가 하려면 구형 prolate 타원 aAPC gp100 로드 MHC IgG 이합체로 활용 하 고 안티 CD28 PMEL 유전자 변형 CD8 + T 세포를 자극 하는 데 사용 했다. T 세포 CFSE와 표시 되었고 (그림 4B, 5B) 확산을 평가 하기 위해 3 일 후 cytometry에 의해 평가. Prolate 타원 aAPC 0.01 밀리 그램의 복용량에서 달성 하는 최고의 분리 구형 aAPC 보다 하위 포화 복용량에서 T 세포 확산의 상부를 유도 하는 것으로 나타났다. 7 일 후, T 세포는 수동으로 세어 졌다. Prolate 타원 aAPC는 보다 효과적으로 눈금 (그림 4C)와 나노 (그림 5C), 둥근 그들의 대응에 비해 T 세포를 자극 하 고 복용량 의존 T 셀 확장 관찰 되었다.
그림 1: 자동화 된 박막 들의 도식 대표. (A) 박막 들 것에 대 한 제어 콘솔의 회로도 (B) 박막 들 것에 대 한 기계적인 하드웨어의 회로도 (왼쪽) 기계적인 하드웨어의 오버 헤드 보기입니다. (오른쪽) 박막에 대 한 메커니즘을 창과의 단면입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 이방성 모양으로 고분자 입자를 스트레칭 조립된 자동화 된 박막 들의 사진. 장치를 기지개 2 차원 박막 영화 그립 알루미늄 마운트 두 축 구성 됩니다. 두 축을 서로 이동 반대 방향에서 리드 나사 포함. 스트레칭 절차를 자동화 하려면 USB 연결 마이크로컨트롤러 열 케이블을 통해 신호를 유 니 폴라 스테퍼 모터 릴레이 2 명의 스테퍼 모터 드라이버에 연결 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 구형 타원 PLGA 입자의 크기 및 가로 세로 비율 분석. (구면의 가장 A)와 (B) SEM 이미지, 1 D 뻗어 prolate 타원, 그리고 2D 뻗어 팽창이 타원 PLGA (A) 나노 입자와 (B) 미. (C) 구면 나노 NTA에 의해 크기 했다와 224 결정 nm 직경에서. PLGA 미의 SEM 이미지는 구형 입자의 분포 (D) 및 (E) 모든 입자 도형의 가로 세로 비율에 대 한 분석 했다. (C) 복제와 함께 적응 작은13, 저작권 일리 VCH 2015에서에서 권한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 특성화 및 구형과 prolate 타원 마이크로 aAPC의 기능 평가. (A) 활용 효율성 붙일 셔 서 펩 티 드 로드 MHC IgG 이합체 및 안티 CD28 항 체의 구형 prolate 타원 미의 표면에. (B) CD8 + T 세포 CFSE와 표시 되었고 구형 및 1 D 뻗어 마이크로 aAPC 0.01, 0.1, 1 밀리 그램 복용, 또는 비 동계어 컨트롤에서 함께 알을 품을. 3 일 후, 셀 cytometry 확산을 평가 하 여 평가 되었다. (C) T 세포 또한 수동 계산 하 여 7 일 후에 평가 되었다. 셀 수 배 확장을 계산 하기 위해 초기 카운트를 정상화 했다. Prolate 타원 및 둥근 배 확장 사이 비교에 대 한 * = p < 0.05 * * p < 0.01, = 및 * * * p < 0.001 =. 오차 막대는 3 복제에 대 한 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 바이오 소재12, 저작권 Elsevier 2014에서에서 복제와 적응된 권한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 특성화 및 구형과 prolate 타원 나노 aAPC의 기능 평가. (A) 활용 효율성 붙일 셔 서 펩 티 드 로드 MHC IgG 이합체 및 안티 CD28 항 체의 구형과 prolate 타원 나노 입자의 표면에. (B) CD8 + T 세포 CFSE와 표시 되었고 구형 및 prolate 타원 나노-aAPC 0.01, 0.1, 1 밀리 그램 복용량에서 다양 한 배 스트레치의와 알을 품을. 3 일 후, 셀 cytometry 확산을 평가 하 여 평가 되었다. (C) T 세포 배 스트레치 (1.5에서 3.5에 배열 되는) 변화의 prolate 타원 입자와 알을 품을 수동 계산 하 여 7 일 후에 평가 했다. 셀 수 배 확장을 계산 하는 치료 상태를 정상화 했다. p < 0.05를 = * * p < 0.01, = 및 * * * = p < 0.001 구형에 비해. 오차 막대는 3 복제에 대 한 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. 작은13, 저작권 일리 VCH 2015에서에서 복제와 적용할된 권한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜 이방성 고분자 입자의 정확한 세대에 대 한 다양 한 방법을 자세히 설명합니다. 여기서 설명 하는 기술 스트레칭 박막 확장성, 높은 재현성 및 저렴 한입니다. 비 등방성 입자를 생성 하기 위한 대체 기술 높은 비용, 낮은 처리량, 그리고 제한 된 입자 크기를 포함 하 여 많은 한계에서 고통. 박막 접근 스트레칭 또한 유리 입자 합성, 후 이방성 되도록 수정 때문에 이며, 결과적으로 다양 한 입자 크기 및 합성 기술을와 호환 됩니다. 그림 1 자동 2 차원 기지개 장치의 설치를 자세히 설명합니다. 이 장치 또한 영화 스트레칭의 원하는 수준에 도달 했습니다 때까지 나사를 수동으로 설정 하 여 전자 부품 없이 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리가 훨씬 더 일관 되 고 수동 작업15보다 빠른 자동화 된 프로세스를 발견 했다. 다양 한 기술은 미세 접근17,,1819,21, 레이어, 레이어 코팅 및 다른 상향식 종합 접근21 같은 비 등방성 입자 합성 개발 되었습니다. ,22. 그러나, 이러한 방법 강한 입자 형상 제어를 사용 하지 마십시오 그리고 생성 될 수 있는 모양 및 입자 재료 사용할 수 있는 다양 한 되지 않습니다. Nonspherical 입자 날조를 위한 인기 있는 하향식 방법 비 일로 템플릿 (인쇄)24입자 복제입니다. 인쇄 입자 모양 정밀 하 게 제어할 수 있습니다, 하지만 비싼 기계를 필요로 하 고로 접근 가능 하 고 간단한 스트레칭 방법 박막으로 구현 되지 않습니다.
단일 에멀젼 기술은 미12,13나노에서 배열 하는 다양 한 크기의 PLGA 입자를 조작 하 사용할 수 있습니다. 다양 한 균질 속도 또는 쥡니다 진폭, 여 microparticle 및 나노 크기, 각각, 수 수 변조. 일단 구형 입자 생성 된 박막 스트레칭 방법을 여기에 설명 된 다양 한 모양15로 입자를 변형 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 우리는 각각 하나 또는 두 개의 차원에서 늘려서 prolate 팽창이 타원 입자의 세대를 설명 합니다. 구형 입자는 PLGA의 유리 전이 온도 이상가 열 하 고 하나 또는 두 개의 입자를 변형 차원에서 뻗어 얇은 플라스틱 필름으로 캐스팅 됩니다. 입자의 가로 세로 비율 높은 제어 이다. 영화 스트레칭의 정도 조정 하 여 입자의 가로 세로 비율 변조 될 수 있다, 그리고 우리는 측정된 입자 종횡비는 매우 예측된 값12,13연관 발견. 스트레칭 하는 동안 온도 또는 스트레칭의 학위를 수정 하 여 다른 다양 한 형태를 생성할 수 있습니다. 예를 들어 혈액 세포의 모양을 닮은 biconcave discoidal 입자 90 ° c.에 미 1.5-fold에서 2 치수 늘려서 생성할 수 있습니다. 15. 스트레칭 기법이이 영화 또한 웜, 배럴, 및 직사각형 디스크21를 포함 하 여 많은 이방성 모양으로 구형 폴리스 티 렌 입자를 변환 하는 데 사용 되었습니다. 장치를 기지개 하는 영화는 수동으로 나사를 조절 하 여 사용할 수 있습니다 또는 더 많은 과정을 그림 1 에서 같이 장치를 자동화할 수 있습니다 효율적이 고 일관 된15. 이 간단한 기술은 안정적으로 생리 조건24에서 그들의 모양을 유지 하는 비 등방성 입자를 생성 합니다. 또한,이 방법에 적용 된 다른 고분자 재료에 더하여 PLGA, polycaprolactone (PCL) 등 및 하이브리드 입자는 PLGA와 폴 리 (베타 아미노 에스테 르)의 만든 (PBAE).
이 프로토콜은 또한 aAPC로 CD8 + T 세포 활성화에 필요한 표면 단백질 PLGA 입자의 다양 한 크기와 모양 수 활용 하는 방법을 설명 합니다. 단백질은 이방성을 구형 covalently 활용 PLGA 마이크로 포커스 및 나노 입자 표면에 carboxyl 그룹에 단백질에 1 차 아민의 EDC/NHS 중재 커플링에 의해 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명 된 대로 입자의 표면에 붙일 레이블된 단백질을 결합 하 여 단백질 활용의 효율성을 측정할 수 있다 그리고 우리는이 기술은 15-20% 효율12, 입자에 단백질 커플 발견 13. Prolate 타원 마이크로 포커스 및 나노 aAPC CD8 + T 활성화에 구형 들 세포 확산 및 확장 생체 외에서12,13보다 더 효과적입니다. 타원 aAPC에 바인딩 및 연락처12에 대 한 그들의 더 큰 표면적으로 인해 T 세포와의 상호 작용 향상 했습니다. 비 등방성 입자는 또한 구형 입자에 비보에 그들의 향상 된 biodistribution와 저항 먹어서13을 통해 우수한 재산이 있다. 이 플랫폼 높은 모듈식 이며 다른 많은 약물 전달 응용 프로그램에 맞게 될 가능성이 있다. 이 절차를 사용 하 여 가변 모양 및 크기의 고분자 입자를 생성할 수 있습니다 하 고 입자 표면 관심의 어떤 단백질으로 활용 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891)와 KRR (DGE-1232825) NSF 대학원 연구 친교 프로그램을 지원 위한 감사합니다. RAM 국가 연구 서비스 상 NIH NCI F31 감사 (F31CA214147)와 지원을 위해 대학 과학자 들은 친목을 위한 성과 보상. 저자 감사 NIH (R01EB016721 및 R01CA195503), 방지 실명 제임스와 캐롤 무료 카 탈 수상, 연구 및 지원에 대 한 암 Immunotherapy JHU 블룸버그 Kimmel 연구소.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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