Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Fabrikation af anisotrope polymere kunstige Antigen præsentere celler for CD8 + T-celle aktivering

Published: October 12, 2018 doi: 10.3791/58332
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2
1Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Biomedical Engineering, Translational Tissue Engineering Center, Institute for Nanobiotechnology, Ophthalmology, Oncology, Neurosurgery, Materials Science and Engineering, Chemical and Biomolecular Engineering, and the Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Johns Hopkins University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at hurtigt og reproducerbar generere biologisk inspirerede, biologisk nedbrydelige articifical antigen præsentere celler (aAPC) med afstemmelige størrelse, form og overflade protein præsentation for T-celle ekspansion ex vivo eller in vivo .

Abstract

Kunstige antigen præsentere celler (aAPC) er en lovende platform for immun graduering på grund af deres potent evne til at stimulere T-celler. Acellulær substrater tilbyder vigtige fordele over celle-baserede aAPC, herunder præcis kontrol af signal præsentation parametre og fysiske egenskaber af aAPC overflade til at modulere dens interaktioner med T-celler. aAPC fremstillet af anisotrope partikler, især elliptisk partikler, har vist sig at være mere effektiv end deres sfæriske modstykker til stimulere T-celler på grund af øget bindende og større areal tilgængelig for T-celle kontakter, samt som reduceret uspecifik optagelse og forbedret farmakokinetiske egenskaber. Trods øget interesse for anisotrope partikler, accepteret selv bredt metoder til at generere anisotrope partikler, såsom tynde film stretching kan være en udfordring at implementere og bruge reproducerbar.

Til dette formål, vi beskriver en protokol for den hurtige, standardiseret fabrikation af bionedbrydeligt anisotrope partikel-baseret aAPC med afstemmelige størrelse, form, og signal præsentation for T-celle ekspansion ex vivo eller i vivo, sammen med metoder til at karakteriserer deres størrelse, morfologi og overflade proteinindhold, og vurdere deres funktionalitet. Denne tilgang til at opdigte anisotrope aAPC er skalerbar og reproducerbar, gør det ideelt til at generere aAPC for "hyldevare" immunoterapi.

Introduction

Kunstige antigen præsentere celler (aAPC) har vist lovende som immunmodulerende stoffer, fordi de kan skabe en robust antigen-specifikke T-celle respons. Essential til disse platforme er deres evne til effektivt præsentere vigtige signaler for T-celle aktivering. Acellulær aAPC er et attraktivt alternativ til celle-baserede aAPC, fordi de er nemmere og billigere at fabrikere, færre udfordringer under skala-up og oversættelse, og mindske risici forbundet med celle-baserede behandlinger. Acellulær aAPC også mulighed for en høj grad af kontrol over signal præsentation parametre og fysiske egenskaber af den overflade, der vil kommunikere med T celler1.

aAPC skal sammenfatte mindst to signaler afgørende for T-celle aktivering. Signal 1 giver antigen anerkendelse og opstår, når T-celle receptoren (TCR) genkender og engagerer med en MHC klasse I eller II forsynet med dens beslægtet antigen, som kulminerede i signalering gennem TCR kompleks. For at omgå antigen specificitet behov, bærer aAPC systemer ofte en agonistisk monoklonale antistoffer mod CD3 receptor, som nonspecifically stimulerer TCR kompleks. Rekombinant former for MHC, især MHC multimerer, har også været brugt på overfladen af aAPC for at give antigen specificitet2,3. Signal 2 er en costimulatory signal, der dirigerer T-celleaktivitet. For at give den nødvendige for T-celle aktivering costimulation, er CD28 receptor generelt stimuleret med en agonistisk antistof præsenteret på aAPC overflade, selv om andre costimulatory receptorer som 4-1BB har været succesfuldt målrettet4. Signal 1 og 2 proteiner er typisk immobiliseret på overfladen af stive partikler til at syntetisere aAPC. Historisk set har aAPC været fremstillet af en række materialer, herunder polystyren4,5 og jern dextran6. Nyere systemer udnytter biologisk nedbrydelige polymerer som poly (mælkesyre-co-glycolic acid) (PLGA) til at generere aAPC, der kan kobles nemt til at signalere proteiner og er egnet til direkte administration i vivoog kan lette den vedvarende frigivelse af indkapslet cytokiner eller opløselige faktorer til at forøge T-celle aktivering7,8.

Udover tilstedeværelse af nødvendige signal proteiner er receptor engagement over et tilstrækkeligt stort areal under aAPC/T celle interaktion afgørende for T-celle aktivering. Således fysiske parametre af aAPC størrelse og form drastisk ændre deres tilgængelige kontaktområde og påvirke deres evne til at stimulere T-celler. Micron mellemstore aAPC har vist sig at være mere effektive på stimulere T-celler end deres nanoskala modparter9,10. Nano-aAPC kan dog have superior biodistribution og bedre dræning til lymfeknuderne, der kan forbedre deres præstationer i vivo over mikro-aAPC11. Figuren er en anden variabel af interesse i partikel-baserede aAPC systemer. Anisotropisk aAPC har for nylig vist sig at være mere effektiv end isotropic partikler på stimulere T-celler, hovedsagelig på grund af forbedrede interaktion med target-cellerne kombineret med reduceret uspecifikke celle optagelse. Celler binder sig fortrinsvis til den lange akse af elliptisk partikler, og større radius af krumningen og fladere overflade giver mulighed for mere kontakt mellem aAPC og T-celle12. Den lange akse af elliptisk partikler også afskrækker fagocytose, hvilket resulterer i øget omsætning tid sammenlignet med sfæriske partikler efter i vivo administration12,13. På grund af disse fordele mægle elliptisk partikler større ekspansion af antigen-specifikke T celler in vitro- og i vivo sammenlignet med sfæriske partikler, en effekt observeret på både mikro- og nanoscales12, 13. Der er forskellige strategier til at fabrikere anisotrope partikler, men tynd-hinde stretching er en enkel, almindeligt anerkendte metode bruges til at generere en række forskellige partikel figurer14. Efter syntese, partikler er støbt ind i film og strakte sig i en eller to dimensioner ved en temperatur over glasset overgang temperatur af partikel materiale. Filmen er så opløst for at hente partikler. Trods en voksende interesse for anisotrope partikler, nuværende strategier for opdigte partikel-baserede aAPC er for det meste begrænset til isotropic systemer og metoder til at ændre partikel form kan være vanskelige at gennemføre, uforenelig med visse aAPC syntese strategier, og mangel på præcision og reproducerbarhed15. Vores tynd-hinde strækker teknik kan udføres manuelt eller i en automatiseret måde til hurtigt at generere anisotrope partikler syntetiseret fra en bred vifte af biologisk nedbrydelige polymerer, strakt til en ønskede størrelsesforhold i et eller to dimensioner15.

Baseret på vores tidligere arbejde, udviklede vi en biologisk nedbrydeligt partikel-baserede tilgang kombineret med skalerbar tynd-hinde strækker teknologi til hurtigt at generere aAPC med afstemmelige størrelse og form på en standardiseret måde for T-celle ekspansion ex vivo eller i vivo. Vores protein konjugation strategi kan bruges til at koble eventuelle de(n) af interesse til carboxyl grupper på partikel overflade på en ønskede tæthed, giver denne aAPC system en høj grad af fleksibilitet. Vi beskriver også metoder til at karakterisere størrelse, morfologi og overflade protein indhold af aAPC og evaluere deres funktionalitet i vitro. Denne protokol kan tilpasses nemt at udvide immunceller ex vivo eller i vivo til en lang række immunterapeutisk applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Johns Hopkins University.

1. fabrikation af sfæriske PLGA partikler af afstemmelige størrelse

  1. Udarbejdelse af materialer til partikel syntese
    1. Forberede 5% w/w polyvinylalkohol (PVA) løsning.
      1. Tilføje 500 mL deioniseret vand (DI) vand til en Erlenmeyer-kolbe med en magnetisk røre bar og placere på varmepladen omrører ved 500 rpm og overvåge temperatur med termometer. Dække kolbe med stanniol at forhindre fordampning.
      2. Når vandtemperaturen når ca. 70 ° C, tilføje 25 g total af PVA i små partier over tid, venter PVA krystallerne før du tilføjer mere.
      3. Når alle PVA er opløst (typisk 30-60 min), lad løsning cool og sterile filter. Opbevares ved 4 ° C til fremtidig brug.
    2. Forberede film casting løsning af 10% w/w PVA og 2% w/w glycerol.
      1. Tilsættes 500 mL Deioniseret vand til en Erlenmeyer-kolbe med en magnetisk røre bar. Tilføje 8 mL glycerol ved stuetemperatur og mix af ændring.
      2. Sted kolbe på varmepladen omrører ved 500 rpm og overvåge temperatur med termometer. Dække kolbe med stanniol at forhindre fordampning.
      3. Når løsningen temperaturen når ca. 70 ° C, tilføje 50 g total af PVA i små partier over tid, venter PVA krystallerne før du tilføjer mere.
      4. Når alle PVA er opløst (typisk 60 min), lad løsning cool og sterile filter ved hjælp af en flaske-top vakuum filter med en porestørrelse på 0,22 μm. Opbevares ved stuetemperatur til fremtidig brug.
    3. Forberede en 50 mL 1% w/w PVA løsning. Tilføje 40 mL Deioniseret vand og 10 mL 5% PVA løsning (lavet i 1.1.1) til en 100-150 mL bægerglas.
    4. Forberede en 100 mL 0,5% w/w PVA løsning. Tilføje 90 mL Deioniseret vand og 10 mL 5% PVA løsning til en 150-250 mL bægerglas.
    5. Tilføje en magnetisk røre bar til 0,5% PVA løsning og sted i en kemisk hætte på en røre pladen ved stuetemperatur på 500 rpm.
  2. Microparticle syntese
    1. Afvejes 100 mg af poly (mælkesyre-co-glycolic acid) (PLGA) ind i en scintillation hætteglas og opløses i 5 mL dichlormethan (DCM). Vortex at opløse PLGA.
    2. Placer homogeniseringsapparat i 50 mL 1% PVA løsning, så homogeniseringsapparat er så tæt på bunden af bægerglasset som muligt uden at røre den. Tænd homogeniseringsapparat og justere til ønsket hastighed — 3.200 rpm i 5 μm diameter partikler, 5.000 rpm i 3 μm, 15.000 rpm i 1 μm (stigende homogenisering hastighed falder partikelstørrelse). Én gang på den ønskede hastighed, tilføje PLGA løsning til bægerglasset og homogeniseres i 1 minut.
    3. Efter homogenisering, hæld 1% PVA, PLGA microparticle løsning i 100 mL 0,5% PVA løsning på en røre pladen og omrøres i mindst 4 timer for opløsningsmiddel fordampning i en kemisk hætte.
    4. Vask partikler 3 gange i osmosevand.
      1. Hæld opløsningen partikel i 50 mL koniske rør og centrifugeres ved 3000 x g i 5 minutter. Hæld supernatanten og tilsættes ca 20 mL Deioniseret vand.
      2. Resuspend partikler af vortexing. Når genopslemmes, fylde koniske rør til 50 mL med Deioniseret vand.
      3. Vask igen på samme måde to gange mere.
  3. Nanopartikel syntese
    1. 200 mg af PLGA i en scintillation hætteglas der afvejes og opløses i 5 mL af DCM. Vortex at opløse PLGA.
    2. Placere et baegerglas med 50 mL 1% PVA løsning i container fyldt med is. Placer sonikator sonden i bægerglasset så tæt på bunden som muligt uden at røre. Begynde ultralydbehandling og straks tilføje PLGA løsning i bægerglasset. Læg instrumenterne i ultralydsbad med en effekt på 12 W 2 minutter til at generere nanopartikler med en anslået diameter på 200 nm.
    3. Efter ultralydbehandling, hæld 1% PVA, PLGA nanopartikler løsning i en 100 mL 0,5% PVA løsning på en røre pladen og omrøres i mindst 4 timer for opløsningsmiddel fordampning i en kemisk hætte.
    4. Hæld opløsningen partikel i 50 mL koniske rør og centrifugeres ved 3.000 x g i 5 minutter for at fjerne mikropartikler. Fjern supernatanten og hæld i høj hastighed centrifugeglas.
    5. Vask partikler 3 gange med Deioniseret vand. Der centrifugeres ved 40.000 x g i 15 minutter. Hæld supernatanten og resuspend i DI vand af vortexing. Vask igen på samme måde to gange mere.

2. fabrikation af polymert partikler af afstemmelige form

  1. Efter vask PLGA resuspend partikler tre gange, partiklerne i ca. 1 mL Deioniseret vand. Tilføje film casting løsning til partikler for endelige partikel koncentration af partikler, 2,5 mg/mL.
  2. Der afpipetteres partikel suspension i 10 mL alikvoter i 75 x 50 mm rektangulære petriskåle for endimensional strække eller i 15 mL alikvoter til 100 x 100 mm kvadratiske petriskåle for to-dimensionelle stretching. Fjern bobler af enten pipette eller skubbe boblerne til side og lad film tørre natten over i en kemisk hætte.
  3. Når film har tørret, fjerne film fra plastic retter med pincet og afskære kanter af film med en saks. Gemme kanter i en 50 mL konisk slange anvendes som sfæriske partikler.
    1. Indlæse en film på automatiseret tynd filmen strækker enhed ved at montere en film på aluminium blokke. For 1D stretching, montere film på aluminium blokke af en akse af båre (figur 2) ved at placere to korte kanter af film i mellem to stykker neopren gummi. Ved hjælp af en unbrakonøgle, skrue greb metal på toppen af gummi til at holde filmen på plads. For 2D stretching, montere alle fire kanter på fire aluminium blokke til at strække på begge akser (figur 2).
    2. Måle og registrere længden af film i mellem aluminium blokke på én akse for 1 D strække eller begge akser for 2D stretching. Beregne afstanden skal strække filmen i én eller to retninger baseret på ønskede fold-strækning.
    3. Placer den film-loaded strækker enhed i en ovn ved 90 ° C og bringe filmen til temperatur over 10 minutter. Placere et stort bægerglas i ovnen med en lille mængde af vand.
    4. Strækfilm.
    5. Når stretching er fuldført, Fjern enhedens strækker sig fra ovnen og lad film køle til stuetemperatur i 20 minutter.
    6. For 1D klippe stretching, filmen ud af stretching enheden på kanterne. For 2D stretching, klip ud og Gem den center firkant af film, der er ensartet strakt på begge akser. Placer film i koniske rør med 2 film pr. tube og kassér resten af filmen.
    7. Tilføje ca. 25 mL Deioniseret vand til hver koniske rør og vortex, indtil filmene er opløst.
    8. Når filmene er opløst, vaske partikler 3 gange med Deioniseret vand.
      1. For mikropartikler, fylde koniske rør til 50 mL, og der centrifugeres ved 3000 x g i 5 minutter, hæld supernatanten, tilsættes ca 20 mL Deioniseret vand og vortex til resuspend partikler.
      2. For nanopartikler, overførsel partikler til høj hastighed centrifugeglas, og der centrifugeres ved 40.000 x g i 15 minutter, hæld supernatanten, tilsættes ca 20 mL Deioniseret vand og vortex til resuspend partikler.
    9. Efter den tredje vask, resuspend partikler i ca. 1 mL Deioniseret vand. Vægt af microcentrifuge rør og tilføje partikler til røret. Fryse partikler i et-80 ° C fryser i 1 time eller flash fryse i flydende kvælstof. Når frosne, lyophilize partikler natten over.
    10. Når frysetørret, vejer partikler i microcentrifuge rør og fratræk indspillet vægten af den tomme rør til at bestemme vægten af frysetørrede partikler.

3. overflade Protein konjugation at skabe kunstige Antigen præsentere celler

  1. Forberede 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer. Gøre en 0,1 M opløsning af MES i vand og ph indstilles til 6,0 ved titrering med 1M natriumhydroxid (NaOH).
  2. Resuspend frysetørret PLGA/PBAE micro/nanopartikler på 20 μg/mL i MES buffer af vortexing. Fyld en polypropylen microcentrifuge tube med 900 μl af MES buffer og tilsæt 100 μL af partikel løsning til røret.
  3. Forberede EDC/NHS løsning. Opløse 40 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) og 48 mg N-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) i 1 mL MES buffer.
  4. Tilsæt 100 μL EDC/NHS løsning til partikler og vortex at blande.
  5. Inkuber røret på en inverter ved stuetemperatur i 30 minutter.
  6. Spin ned mikropartikler på 5.000 x g i 5 minutter, eller nanopartikler på 17.000 x g i 5 minutter. Supernatanten og resuspend i 1 mL PBS ved vortexing (mikropartikler) eller sonicating på 2-3 W i 5 sekunder (nanopartikler).
  7. For mikropartikler, skal du tilføje 8 μg af det ønskede signal 1 protein og 10 μg anti-mus CD28 (klon 37.51) til partikler. For nanopartikler, tilføje 16 μg signal 1 og 20 μg anti-mus CD28. Tilføje PBS for at bringe lydstyrken i røret til 1,1 mL.
  8. Inkuber røret på en inverter på 4 ° C natten over.
  9. Den næste dag, vaske partikler. Spin ned mikropartikler på 5.000 x g i 5 minutter, eller nanopartikler på 17.000 x g i 5 minutter. Supernatanten fjernes, og pelleten partikler i 1 mL steril PBS ved vortexing (mikropartikler) eller ultralydbehandling på 2-3 W i 5 sekunder (nanopartikler). Gentag to gange.
  10. Resuspend partiklerne i den ønskede koncentration i dyrkningsmediet nemlig umiddelbar hjælp. Til langtidsopbevaring, resuspend partikler på 10 mg/mL i en 100 mM rørsukkeropløsning. Fryse, lyophilize og gemme partikler ved-80 ° C.

4. karakterisering og vurdering af aAPC

  1. Karakterisering af aAPC størrelse og form (figur 3)
    1. Karakterisere microparticle størrelse og form af imaging partikler ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). For SEM imaging, spredt frysetørret partikler til kulstof tape levet op til en aluminium tack og sputter frakke med guld-palladium.
    2. Analysere størrelse og skærmformat af partikler ved hjælp af billede analyse software.
    3. Bestem partikelstørrelse, indstille skala ved hjælp af skalalinjen og måle partikel diameter. Gentag for ca. 100 partikler til at bestemme den gennemsnitlige partikel diameter og generere et histogram af partikelstørrelser.
    4. Til at afgøre højde-breddeforhold, måle afstanden på tværs af den lange akse og den korte akse af partikler og opdele lange akse af korte akse. Gentag for ca 50 partikler af hver enkelt figur til at bestemme det gennemsnitlige partikel formatforholdet for hver figur og generere histogrammer.
    5. Karakterisere nanopartikel størrelse og form af imaging partikler ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi (TEM). Analysere størrelse og skærmformat af nanopartikler bruger billede analyse software som beskrevet i 5.1.2. Alternativt kan du måle sfæriske nanopartikel størrelse ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS) eller nanopartikel tracking analyse (NTA).
  2. Protein konjugation effektivitet
    1. Forberede aAPC efter metoder 1-3, men i trin 3.7 bruge fluorescently mærket signal 1 protein og anti-mus CD28. Efter konjugering og vask, resuspend på aAPC i 1 mL PBS til en slutkoncentration på 2 mg/mL aAPC.
    2. Forberede protein standarder i en sort polystyren 96-brønd mikrotiterplade. Tilføj 5 μg fluorescently mærket signal 1 protein til PBS i de første godt af pladen og gøre 10 1:2 fortyndinger i PBS på tværs af rækken af pladen. Efterlade de sidste godt tom. Gentag dette trin for at generere et andet sæt af standarder med fluorescently mærket anti-CD28.
    3. Der afpipetteres 100 μl af opløsningen aAPC i Repliker wells af den sorte polystyren mikrotiterplade i tre eksemplarer.
    4. Læs fluorescens på et fluorescens-Pladelæser ved relevante bølgelængder. Bruge fluorescens aflæsninger fra protein standarder til at generere standard kurver for hver fluorescerende antistof. Du bruger standardkurven, beregne koncentrationerne af signal 1 og anti-CD28 i hver prøve godt, og derefter beregne mængden af overflade proteiner og konjugation effektivitet (figur 4A, figur 5A).
  3. Evaluering af aAPC til i vitro stimulation af CD8 + T celler
    1. Forberede B' medier (RPMI medium suppleret med L-glutamin, 10% FBS, 1% ikke-essentiel aminosyre opløsning, 1% natrium pyruvat, 1% MEM Vitamin løsning, 92 μM β-mercaptoethanol, 10 ng/mL ciprofloxacin og 30 U/mL IL-2.
    2. Ofre en sort 6 mus via CO2-eksponering.
    3. Høste milt fra mus efter en tidligere etableret protokol16. Indsamle milt i en 50 mL konisk slange med 10 - 15 mL PBS. Med en pistil, mash milten gennem en 70 µm celle si i en 50 mL konisk slange. Under mæskningen, vaske si med 40 mL PBS.
    4. Spin splenocytes på 300 x g i 5 minutter. Hæld supernatanten og resuspend på splenocytes i 4 mL af Ack Lysing Buffer til at lyse røde blodlegemer. Give røret til at sidde uforstyrret i 1 minut, derefter tilføje PBS for at bringe lydstyrken i røret til 20 mL.
    5. Spin celler på 300 x g i 5 minutter. Hæld supernatanten og resuspend celler i 1 mL PBS. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer.
    6. Spin celler på 300 x g i 5 minutter og resuspend i den ønskede mængde af celle adskillelse buffer. Isolere CD8 + T celler fra enkelt celle suspensionen ved hjælp af en CD8 + negative valg T-celle isolering kit, efter producentens protokol.
    7. Efter magnetisk separation, spin CD8 + T celler på 300 x g i fem minutter og fjerne celle adskillelse buffer. Resuspend celler i 1 mL PBS og tælle cellerne. Navngive celler med carboxyfluorescein succinyl ester (CFSE) efter producentens protokol.
    8. Inkubér 8,333 CD8 + T-celler og 0.0833 mg eller ønskede dosis af aAPC i 150 μL B' medier i hver brønd med en 96 godt U-bunden vævskultur-behandlet plade.
    9. Der inkuberes ved 37 ° C i 7 dage. Efter 3-4 dage, skal du opdatere dyrkningsmediet ved at tilføje 75 μl frisk medium til hver brønd.
    10. Efter 3 dages inkubation, analysere CFSE mærkede celler på et flow forskellige for at vurdere spredningen. Hver peak flow flowcytometri CFSE histogrammet repræsenterer en generation af celler på grund af CFSE fortyndingen med hver efterfølgende celledeling.
    11. Efter 7 dage, skal du bruge en hemocytometer til at tælle antallet af celler i hver brønd. Før tælle, pletten døde celler med en Trypan blå løsning. Udelukke døde celler fra endelige celletal. Normalisere den sidste celle koncentration til begyndelseskoncentration til at beregne fold-udvidelsen (figur 4 og figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En skematisk for automatiseret 2D tynd filmen strækker enhed som vist i figur 1. En skematisk og beskrivelse for en 1D tynd film strækker enhed er givet i Ho et al.17 båre er konstrueret af aluminium dele ved hjælp af standard fræsning og spåntagende teknikker. Svarende til 1D båre, den 2D båre består af metallisk greb og styreskinner. Tovejs bly skruer bruges til at oversætte lineær til roterende bevægelse. Bly skruerne er knyttet via mekaniske haner til identiske steppermotorer med tilstrækkelig drejningsmoment. 8 stepper motorisk kontrol ledninger kan være loddet på 8-pin varmebestandige amphenol stik til nem fastgørelse til kontrol-konsol i en ovn for tynd film stretching. Polytetrafluorethylen (PTFE) belagt ledning af tilstrækkelig længde skal bruges til at forbinde steppermotorer til chauffører i konsollen kontrol. Anbefalet computer kontrol-ordningen gives i figur 1A. De to motorer skal være tilsluttet via varmebestandige ledninger til 2 selvstændige chauffører. De to chauffører skal derefter blive tilsluttet en microcontroller til at interface med en computer. Chaufførerne bør forbindes med x-aksen og y-aksen udgange på mikrokontroller. Drivere og microcontroller kræver ekstern strømforsyning. Før der forbindes strømforsyningen til disse tre komponenter anbefales det, at en 4 A sikring indsættes mellem hver af de drevne forbindelser at beskytte komponenterne mod nuværende overbelastning. Endelig kan mikrokontroller sammenkædes via en Parallel Port Input til en computer ved hjælp af en DB25 mandlige til mandlige kabel. Elektronik bruges til at styre steppermotorer er varme følsomme og derfor skal placeres uden for en varmekilde (såsom en ovn) bruges under drift til at opvarme de tynde film til tilstrækkelig temperatur at strække. Selvom de anbefalede motorer er varmebestandig op til de temperaturer, der er fastsat i denne protokol for at strække partikler, vil motorer og chauffører opbygge ekstra varme mens de er knyttet til de vigtigste strømforsyning. Det anbefales derfor, at enheden kun være tændt i løbet af selve filmen strækker sig for at minimere potentielle varmeudvikling.

PLGA nano- og mikropartikler blev syntetiseret ved hjælp af enkelt emulsion teknikker beskrevet i denne protokol og afbildet med TEM (figur 3A) og SEM (figur 3B), hhv. Sfærisk nanopartikler havde en diameter på 237.3 ± 4,0 nm målt af DLS og 224 nm målt af NTA (figur 3 c). Mikropartikler blev syntetiseret af homogenisering ved 5000 rpm for at generere sfæriske partikler med en gennemsnitlig diameter på 3 ± 1 μm (figur 3D). Partiklerne var strakt ved hjælp af automatiserede filmen strækker enhed ved 90 ° C i én dimension til at generere prolate ellipsoide nano- og mikropartikler og strakt ved 70 ° C i to dimensioner til at generere fladtrykt elliptisk partikler. Formatforhold af mikropartikler i alle tre figurer blev analyseret ved at måle længdeaksen og korte akse afstanden af partikler og dividere de to. Sfærisk mikropartikler havde et skærmformat på 1,05 ± 0,04, mens 1D strakte prolate ellipsoide partikler havde en større billedformat på 3,6 ± 0,8 (figur 3). 2D strakte fladtrykt elliptisk partikler havde et skærmformat på 1,2 ± 0,2, groft opretholde et skærmformat på en.

EDC/NHS reaktion kemi blev brugt til konjugat en fluorescently mærket peptid-læsset MHC IgG dimer og anti-CD28 antistof på overfladen af strakte og sfæriske PLGA partikler. Konjugation effektivitet resultater viser tilsvarende mængder af protein på overfladen af sfæriske og elliptisk mikro-aAPC (figur 4A) og nano-aAPC (figur 5A) og demonstrere, at protein kobling under aAPC syntese forekommer i en koncentration-afhængige måde. For at evaluere effekten af figuren på aAPC funktionalitet, sfæriske og prolate ellipsoide aAPC konjugeret med gp100-læsset MHC IgG dimer og anti-CD28 blev brugt til at stimulere PMEL transgene CD8 + T celler. T-celler blev mærket med CFSE og evalueret ved flowcytometri efter 3 dage til at vurdere spredning (figur 4B, 5B). Prolate elliptisk aAPC fandtes for at fremkalde højere niveauer af T celle spredning på sub mætte doser end sfæriske aAPC, med de bedste adskillelse opnået ved en 0,01 mg dosis. Efter 7 dage, blev T-celler manuelt tælles. Prolate elliptisk aAPC mere effektivt stimuleres T celler i forhold til deres sfæriske modstykker til individuel (figur 4 c) og nanoskala (figur 5 c), og dosis-afhængige T celle ekspansion blev observeret.

Figure 1
Figur 1: skematisk fremstilling af automatiserede tyndfilm båre. (A) skematisk af control console for tynd film båre. B skematisk af mekaniske hardware for tynd film båre. (Venstre) Overhead-visning af mekaniske hardware. (Højre) Tværsnit af gribende mekanisme for tynde film. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: fotografier af samlet automatiseret tyndfilm båre at strække polymere partikler til anisotrope figurer. 2D tynd filmen strækker enhed er sammensat af to akser med aluminium mounts, der greb filmen. De to akser indeholde bly skruer i modsatte retninger, så de flytter fra hinanden. For at automatisere den strække procedure, er en USB-forbundet microcontroller tilsluttet to stepper motor drivere, som relæ signaler til unipolar stepmotor motorer gennem en termisk kabel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: størrelse og skærmformat analyse af sfæriske og elliptisk PLGA partikler. (A) TEM og SEM (B) billeder af sfæriske, 1D strakte prolate elliptisk, og 2D strakte fladtrykt elliptisk PLGA (A) nanopartikler og (B) mikropartikler. (C) sfærisk nanopartikler var størrelse af NTA og fast besluttet på at være 224 nm i diameter. SEM billeder af PLGA mikropartikler blev analyseret for (D) størrelsen distribution af sfæriske partikler og (E) skærmformater for alle partikel figurer. (C) gengives og tilpasset med tilladelse fra små13, Copyright Wiley-VCH 2015. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: karakterisering og funktionel vurdering af sfæriske og prolate ellipsoide mikro-aAPC. (A) konjugation effektivitet af fluorescently mærket peptid-læsset MHC IgG dimer og anti-CD28 antistof på overfladen af sfæriske og prolate ellipsoide mikropartikler. B CD8 + T-celler blev mærket med CFSE og inkuberes med sfæriske og 1D-strakt mikro-aAPC på 0,01, 0,1 og 1 mg doser, eller ikke-cognate kontrol. Efter 3 dage, blev celler evalueret ved flowcytometri at vurdere spredning. (C) T-celler blev også vurderet efter 7 dage ved manuel optælling. Celletal var normaliseret til den oprindelige tæller til at beregne fold-udvidelse. Til sammenligning mellem prolate ellipsoide og sfæriske fold ekspansion, * = p < 0,05, ** = p < 0,01, og *** = p < 0,001. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM) for 3 replikater. Gengivet og tilpasset med tilladelse fra biomaterialer12, Copyright Elsevier 2014. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: karakterisering og funktionel vurdering af sfæriske og prolate ellipsoide nano-aAPC. (A) konjugation effektivitet af fluorescently mærket peptid-læsset MHC IgG dimer og anti-CD28 antistof på overfladen af sfæriske og prolate ellipsoide nanopartikler. B CD8 + T-celler blev mærket med CFSE og inkuberes med sfæriske og prolate ellipsoide nano-aAPC af varierende fold-strækning på 0,01, 0,1 og 1 mg doser. Efter 3 dage, blev celler evalueret ved flowcytometri at vurdere spredning. C T celler inkuberes med prolate ellipsoide partikler af forskellig fold strækning (spænder fra 1.5 til 3.5) blev også vurderet efter 7 dage ved manuel optælling. Celletal var normaliseret til en ubehandlet tilstand til at beregne fold-udvidelse. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, og *** = p < 0,001 sammenlignet med sfæriske. Fejllinjer udgør standard fejl af middelværdien (SEM) for 3 replikater. Gengivet og tilpasset med tilladelse fra små13, Copyright Wiley-VCH 2015. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver i detaljer en alsidig metode for den præcise generation af anisotrope polymere partikler. Den tynde film stretching teknik beskrevet her er skalerbar, stærkt reproducerbare og billig. Alternative teknikker til at generere anisotrope partikler lider af mange begrænsninger, herunder høje omkostninger, lav overførselshastighed og begrænset partikelstørrelse. Den tynde film stretching tilgang er også en fordel fordi partiklerne er ændret til at være anisotrope efter syntese og som følge heraf er forenelig med en bred vifte af partikelstørrelser og syntese teknikker. Figur 1 detaljer setup af de automatiserede todimensionale strækker enhed. Denne enhed kan også bruges uden elektroniske komponenter ved manuelt at dreje skruerne, indtil filmen har nået den ønskede grad af stretching. Dog har vi fundet, at automatiserede processen er langt mere konsekvent og hurtig end manuel drift15. Forskellige teknikker er blevet udviklet for at syntetisere anisotrope partikler, såsom mikrofluid tilgange17,18,19, lag på lag belægning21og andre bottom up syntese tilgange21 ,22. Men disse metoder aktivere ikke stærk kontrol over partikel geometri og er ikke så alsidige figurer, der kan genereres og partikel materialer, der kan bruges. En populær top-down metode for at fabrikere nonspherical partikler er partikel replikering i Non-befugtning skabeloner (PRINT)24. Selv om PRINT giver præcis kontrol over partikel form, det kræver dyre maskiner og er ikke så tilgængelig og simpel at gennemføre som tynd filmen strækker metode.

Enkelt emulsion teknik kan bruges til at fremstille PLGA partikler i forskellige størrelser, lige fra nano til individuel12,13. Af varierende homogenisering hastighed eller ultralydbehandling amplitude, kan microparticle og nanopartikel størrelse, henholdsvis, gradueres. Når sfæriske partikler er blevet genereret, kan tynd filmen strækker metode beskrevet her bruges til at deformere partiklerne i forskellige figurer15. I denne protokol beskriver vi generation af prolate og fladtrykt elliptisk partikler af strækker sig i en eller to dimensioner, henholdsvis. Sfæriske partikler er kastet ud i en tynd plastfolie, der er opvarmet til over glasset overgang temperatur PLGA og strakte sig i en eller to dimensioner til at deformere partiklerne. Formatforholdet af partikler er meget styrbar. Ved tuning graden af filmen stretch, formatforholdet af partiklerne kan moduleres og vi har fundet, at målte partikel aspekt ratio er stærkt korreleret med forudberegnede værdi12,13. Forskellige andre figurer kan genereres ved at ændre temperaturen under strække eller graden af stretching. For eksempel, kan biconcave skiveformede partikler der ligner formen af røde blodlegemer genereres ved at strække mikropartikler 1.5-fold i to dimensioner ved 90 ° C. 15. denne film stretching teknik er også blevet brugt til at omdanne mange anisotrope figurer, herunder orme, Tønder og rektangulære diske21sfæriske polystyren partikler. Filmen strækker enhed kan bruges ved manuelt at kontrollere skruerne eller enheden kan automatiseres, som vist i figur 1 at gøre processen mere effektiv og konsekvent15. Denne enkle teknik producerer pålideligt anisotrope partikler, der bevarer deres form under fysiologisk betingelser24. Desuden, denne metode er blevet anvendt til andre polymere materialer, desuden at PLGA, såsom polycaprolactone (PCL) og hybrid partikler fremstillet af PLGA og poly (beta-amino ester) (PBAE).

Denne protokol beskriver også, hvordan PLGA partikler af varieret størrelse og form kan være konjugeret med overflade proteiner kræves for CD8 + T celle aktivering til at fungere som aAPC. Proteiner kan være kovalent konjugeret til anisotrope og sfæriske PLGA mikro- og nanopartikler af EDC/NHS medieret kobling af primære aminer på proteiner til carboxyl grupper på partikel overflade. Effektiviteten af protein konjugation kan måles ved at koble fluorescently mærket protein til overfladen af partikler, som beskrevet i denne protokol, og vi har fundet, at denne teknik par protein til partikler på 15-20% effektivitet12, 13. Prolate ellipsoide mikro- og nanopartikel aAPC er mere effektiv end deres sfæriske modstykker til aktivering af CD8 + T celle spredning og ekspansion in vitro-12,13. Elliptisk aAPC har forøget binding til og interaktion med T-celler på grund af deres større areal for kontakt12. Anisotropisk partikler har også overlegne egenskaber over sfæriske partikler i vivo på grund af deres øget biodistribution og modstand mod fagocytose13. Denne platform er yderst modulære og kan tilpasses til mange andre drug delivery applikationer. Brug denne procedure, polymere partikler afstemmelige form og størrelse og kan genereres og partikel overflade kan være konjugeret med et protein af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

EBA (DGE-1746891) og KRR (DGE-1232825) takke NSF Graduate Research Fellowship program for støtte. RAM tak National Research Service Award NIH NCI F31 (F31CA214147) og præstation belønninger for College forskere Fellowship for støtte. Forfatterne takke NIH (R01EB016721 og R01CA195503), forskning at forebygge blindhed James og Carole gratis katalysator Award, og JHU Bloomberg-Kimmel Institute for Cancer immunterapi for støtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed Polysciences, Inc. 02975-500
Glycerol Sigma-Aldrich G9012
Digital Thermometer Fluke N/A Model name: Fluke 52 II
Immersion Temperature Probe Fluke N/A Model name: Fluke 80PK 22
Digital Hotplate & Stirrer Benchmark Scientific H3760-HS
Multipoint stirrer Thermo Fisher Scientific 50093538
Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) Sigma-Aldrich 719900
Dichloromethane Sigma-Aldrich D65100
Homogenizer IKA  0003725001
Sonicator Sonics & Materials, Inc. N/A Model number: VC 505
Sonicator sound abating enclosure Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0427
Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0220
Sonicator microtip Sonics & Materials, Inc. N/A Part number: 630-0423
High speed centrifuge Beckman Coulter N/A Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP
High speed centrifuge rotor Beckman Coulter 369691 Model number: JA-17
High speed polycarbonate centrifuge tubes Thermo Fisher Scientific 3118-0050 50 mL, screw cap
Rectangular disposable petri dish VWR International 25384-322 75 x 50 x 10 mm
Square disposable petri dish VWR International 10799-140 100 mm x 100 mm
LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody Biolegend 100314
InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 Bio X Cell BE0015-1
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride Sigma-Aldrich E6383
N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt Sigma-Aldrich 56485
MES Sigma-Aldrich M3671
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody Biolegend 100212
APC anti-mouse CD28 Antibody Biolegend 102109
Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate Sigma-Aldrich CLS3915 flat bottom, black polystyrene
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL Eppendorf 22431081
RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11875093
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F4135 Heat Inactivated, sterile-filtered
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Recombinant Human IL-2 (carrier-free) Biolegend 589102
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360070
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11140050
MEM Vitamin Solution (100X) ThermoFisher Scientific 11120052
CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse Miltenyi Biotech 130-104-075
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit ThermoFisher Scientific C34554
LS Columns Miltenyi Biotech 130-042-401
MidiMACS Separator Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS Multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
Flow Cytometer Accuri C6
Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader BioTek
autoMACS Running Buffer Miltenyi BIotech 130-091-221
Cell Strainer ThermoFisher Scientific 22363548 Sterile, 70 µm nylon mesh
ACK Lysing Buffer ThermoFisher Scientific A1049201
C57BL/6J (Black 6) Mouse The Jackson Laboratory 000664 Male, at least 7 weeks old
U-Bottom Tissue Culture Plates VWR 353227 Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates
40 V DC Power Supply Probotix LPSK-4010
PTFE Coated Wire Mouser 602-5858-100-01 This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work
Stepper Motor Driver Probotix MondoStep5.6
IDC Connector Kit Probotix IDCM-10-12
Microcontroller Probotix PBX-RF
4A Fuses Radio Shack 2701026 Equivalent fuses will work as well
DB25 Male to Male Cable Probotix DB25-6
USB-A to USB-B Cable Staples 2094915 Equivalent cable will work as well
8-Pin Amphenol Connectors Male and Female Mouser 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S
Stepper Motor Probotix HT23-420-8
Right Hand Lead Screw Roton 60722
Left Hand Lead Screw Roton 60723
Screws McMaster Carr 92196A151
Neoprene Rubber McMaster Carr 8698K51
Right Handed Flanged Lead Nut Roton 91962
Left Handed Flanged Lead Nut Roton 91963
Linux Control Computer Probotix LCNC-PC Any computer with matching specification and Linux operating system will work
Corning bottle-top vacuum filter system Sigma-Aldrich CLS431097
Trypan Blue Solution, 0.4 % ThermoFisher Scientific 15250061

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
  2. Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
  3. Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
  4. Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
  5. Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
  6. Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
  7. Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
  8. Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
  9. Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
  10. Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
  11. Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
  12. Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
  13. Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
  14. Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
  15. Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
  16. Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
  17. Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
  18. Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
  19. Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
  20. Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
  21. Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
  22. Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
  23. Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
  24. Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).

Tags

Miljøvidenskab spørgsmål 140 aAPC immunoengineering polymer anisotrope partikel figur
Fabrikation af anisotrope polymere kunstige Antigen præsentere celler for CD8 + T-celle aktivering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ben-Akiva, E., Rhodes, K. R., Meyer, … More

Ben-Akiva, E., Rhodes, K. R., Meyer, R. A., Green, J. J. Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation. J. Vis. Exp. (140), e58332, doi:10.3791/58332 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter