Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以快速和可重复生成生物启发, 可生物降解的 articifical 抗原呈现细胞 (aAPC) 与可调谐的大小, 形状和表面蛋白呈现的 T 细胞扩张的体内或体内.
Abstract
人工抗原呈现细胞 (aAPC) 是一种有潜力的免疫调节平台, 由于其强大的刺激 T 细胞的能力。脱细胞基质提供了与基于细胞的 aAPC 的关键优势, 包括精确控制信号表示参数和 aAPC 表面的物理特性, 以调节其与 T 细胞的相互作用。由各向异性粒子 (特别是椭球粒子) 构造的 aAPC 在刺激 t 细胞时比球形对应体更有效, 因为可用于 t 细胞接触的增强的结合和更大的表面积, 以及减少非特异性摄取和增强药代动力学特性。尽管增加了对各向异性粒子的兴趣, 但即使是广泛接受的方法来生成各向异性粒子, 如薄膜拉伸, 也可能对实现和使用可重复具有挑战性。
为此, 我们描述了一种快速、标准化的可生物降解各向异性粒子基 aAPC 的协议, 其可调谐大小、形状和信号呈现用于 T 细胞在体内或体内的扩张, 以及方法表征其大小、形态和表面蛋白质含量, 并评估其功能。这种制造各向异性 aAPC 的方法是可扩展的, 可以重现, 因此非常适合为 "现成" 免疫疗法生成 aAPC。
Introduction
人工抗原呈现细胞 (aAPC) 已表明承诺作为免疫调节剂, 因为他们可以产生一个强大的抗原特异 T 细胞反应。这些平台的关键是它们能够有效地为 T 细胞活化提供关键信号。脱细胞 aAPC 是一种有吸引力的替代细胞的 aAPC, 因为它们更容易和成本更低的制造, 面临更少的挑战, 在扩大和翻译, 并减轻与细胞疗法相关的风险。脱细胞 aAPC 还允许对信号表示参数和表面物理特性进行高度控制, 这将与 T 细胞1连接。
aAPC 必须重述至少两个信号, 对于 T 细胞激活至关重要。信号1提供抗原识别和发生时 T 细胞受体 (TCR) 识别和参与的 MHC i 类或 II 轴承其同源抗原, 最终通过 TCR 复合信号。为了绕过抗原特异性要求, aAPC 系统经常承受竞赛 CD3 受体的单克隆抗体, 特异刺激 TCR 复合物。重组形式的 mhc, 特别是 mhc 多聚体, 也被用于 aAPC 的表面, 以提供抗原特异性2,3。信号2是指示 T 细胞活动的共刺激信号。为了提供 T 细胞活化所必需的刺激, CD28 受体通常用 aAPC 表面上的竞赛抗体刺激, 尽管共刺激的其他4-1BB 受体已经成功地瞄准了4。信号1和2蛋白通常固定在刚性颗粒表面, 以合成 aAPC。从历史上看, aAPC 是由各种材料制成的, 包括聚苯乙烯4、5和铁葡聚糖6。较新的系统利用生物降解聚合物 (聚乳酸-乙醇酸) (aAPC) 生成可以很容易地耦合到信号蛋白, 适合于体内直接管理, 并可促进持续释放封装细胞因子或可溶性因子, 以增加 T 细胞活化7,8。
除了存在必要的信号蛋白外, 在 aAPC/t 细胞相互作用期间, 受体在足够大的表面积上的参与对于 T 细胞活化是必不可少的。因此, aAPC 的物理参数 (如大小和形状) 会极大地改变其可用接触区域, 并影响其刺激 T 细胞的能力。微米级的 aAPC 在刺激 T 细胞方面比它们的纳米尺度对应9、10更有效。然而, 纳米 aAPC 可以有优越的生物分布和更好的引流到淋巴结, 可能提高其在体内的性能在微 aAPC11。形状是对基于粒子的 aAPC 系统感兴趣的另一个变量。在刺激 T 细胞时, 各向异性 aAPC 最近被证明比各向同性粒子更有效, 主要是由于增强了与靶细胞的相互作用以及减少了非特异细胞吸收。单元格优先绑定到椭球粒子的长轴, 曲率和平坦表面的半径越大, aAPC 和 T 细胞12之间的接触就越多。椭圆形颗粒的长轴也会抑制吞噬, 从而在体内施用12、13的情况下, 与球形颗粒相比, 循环时间增加。由于这些优点, 椭球粒子在体外和体内与球形颗粒相比, 能更好地调节抗原特异 T 细胞的扩张, 这在微 nanoscales12中观察到的效果, 13。制造各向异性粒子有多种策略, 但薄膜拉伸是一种简单、广泛接受的方法, 用于生成一系列不同的粒子形状14。合成后, 粒子被投射到薄膜中, 在一个或两个维度上拉伸, 温度高于粒子材料的玻璃过渡温度。然后将胶片溶解以检索粒子。尽管对各向异性粒子的兴趣越来越大, 但目前制造粒子基 aAPC 的方法大多限于各向同性系统, 改变颗粒形状的方法很难实现, 与某些 aAPC 合成不相容。策略, 缺乏精度和重现性15。我们的薄膜拉伸技术可以手动或以自动方式进行, 以快速生成由各种可生物降解聚合物合成的各向异性粒子, 在一个或两个维度中拉伸到所需的纵横比15。
基于我们以前的工作, 我们开发了一种可生物降解的粒子基方法, 结合可以扩展的薄膜拉伸技术, 快速生成 aAPC, 可调谐尺寸和形状, 以标准化的方式用于 T 细胞扩张, 例如体内或体内。我们的蛋白质共轭策略可用于将任何感兴趣的蛋白质与颗粒表面上的羧基基团进行耦合, 以达到所需的密度, 从而使该 aAPC 系统具有高度的灵活性。我们还描述了 aAPC 的大小、形态和表面蛋白含量的表征方法, 并对其体外功能进行了评价。该协议可以很容易地适应扩大免疫细胞的体内或体内的各种免疫治疗应用。
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Protocol
这里描述的所有方法都是由约翰霍普金斯大学的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的。
1. 可调谐尺寸球形颗粒的制备
- 颗粒合成材料的制备
- 准备5% 瓦特/w 聚乙烯醇 (PVA) 溶液。
- 添加500毫升的去离子 (DI) 水到一个锥形烧瓶与一个磁力搅拌棒和放置在热板搅拌器在 500 rpm 和监测温度与温度计。用锡纸盖上烧瓶, 防止蒸发。
- 当水温达到约70摄氏度时, 随着时间的推移, 在小批次中添加 25 g 的 pva, 等待 pva 溶解, 然后再添加更多。
- 一旦所有 PVA 溶解 (通常为30-60 分钟), 让溶液冷却和无菌过滤器。存储在4摄氏度, 供将来使用。
- 制备 10% w/w PVA 和 2% w/w 甘油的薄膜铸造溶液。
- 用磁性搅拌棒将500毫升的 DI 水添加到锥形烧瓶中。在室温下加入8毫升甘油, 混合研制。
- 将烧瓶放在热板搅拌器上 500 rpm, 并使用温度计监控温度。用锡纸盖上烧瓶, 防止蒸发。
- 当溶液温度达到约70摄氏度时, 随着时间的推移, 在小批次中添加 50 g 的 pva, 等待 pva 溶解, 然后再添加更多。
- 一旦所有 PVA 溶解 (通常为60分钟), 让解决方案冷却和无菌过滤器使用瓶顶真空过滤系统, 孔径为0.22 微米。储存在室温下供将来使用。
- 准备50毫升1% 瓦特/w PVA 溶液。加入40毫升的 DI 水和10毫升 5% PVA 溶液 (1.1.1) 到100-150 毫升烧杯。
- 准备100毫升0.5% 瓦特/w PVA 溶液。将90毫升的 DI 水和10毫升 5% PVA 溶液添加到150-250 毫升烧杯中。
- 在 0.5% PVA 溶液中加入一个磁力搅拌棒, 在室温下以 500 rpm 的温度放置在搅拌板上的化学罩中。
- 准备5% 瓦特/w 聚乙烯醇 (PVA) 溶液。
- 微粒合成
- 将100毫克聚乳酸乙醇酸 (PLGA) 称量为闪烁小瓶, 并在5毫升二氯甲烷 (DCM) 中溶解。涡旋溶解的聚乳酸。
- 将均质机放置在 50 mL 1% PVA 溶液中, 使均质机尽可能靠近烧杯底部, 而无需触摸。打开均质机并调整至所需的 speed—3,200 rpm, 适用于5微米直径的颗粒, 5000 rpm 3 微米, 1.5万 rpm (1 微米) (增加均匀化速度可减小颗粒尺寸)。一旦在所需的速度, 添加到烧杯溶液和匀质1分钟。
- 均匀化后, 将 1% pva、聚乳酸微粒溶液倒入搅拌板上的 100 mL 0.5% pva 溶液中, 搅拌至少4小时, 用于化学罩中的溶剂蒸发。
- 在 DI 水中洗涤颗粒3次。
- 将颗粒溶液倒入50毫升锥形管中, 离心 3000 x g 5 分钟。倒入上清液, 加入约20毫升的 DI 水。
- 通过涡旋重悬粒子。一旦重悬, 用 DI 水填充锥形管至50毫升。
- 再用同样的方式洗两次。
- 纳米颗粒合成
- 将200毫克的 PLGA 称量为闪烁的小瓶, 并在5毫升的 DCM 中溶解。涡旋溶解的聚乳酸。
- 将50毫升 1% PVA 溶液的烧杯放入装满冰块的容器中。将超声仪探针放在烧杯中尽可能靠近底部, 而无需接触。开始超声, 并立即添加到烧杯溶液。油脂实验的功率为 12 W, 2 分钟, 以产生近似直径为 200 nm 的纳米粒子。
- 超声后, 将 1% pva、聚乳酸纳米颗粒溶液倒入搅拌板上的 100 mL 0.5% pva 溶液中, 搅拌至少4小时, 用于化学罩中的溶剂蒸发。
- 将颗粒溶液倒入50毫升锥形管中, 离心 3000 x g 5 分钟, 去除微粒。取出上清液, 倒入高速离心管中。
- 用 DI 水洗涤颗粒3次。离心 4万 x g 15 分钟。用涡旋倒出上清液并在 DI 水中重悬。再用同样的方式洗两次。
2. 可调谐形状的高分子颗粒的制备
- 三次洗涤后, 在大约1毫升的 DI 水中重悬粒子。将薄膜铸造溶液添加到颗粒中, 最终颗粒浓度为2.5 毫克/毫升颗粒。
- 将10毫升等份中的颗粒悬浮液移入 75 x 50 mm 长方形培养皿中, 用于一维拉伸或 15 mL 等份成 100 x 100 mm 方形培养皿, 用于二维拉伸。通过移液器或将气泡推到侧面, 让薄膜在化学罩中一夜之间干燥, 从而去除气泡。
- 薄膜干燥后, 用镊子去除塑料盘子中的胶片, 并用剪刀切断薄膜边缘。将边缘保存在50毫升锥形管中, 用作球形颗粒。
- 通过将薄膜安装到铝块上, 将胶片加载到自动薄膜拉伸装置上。对于1D 拉伸, 将薄膜安装在担架的一个轴的铝块上 (图 2), 方法是将两条短边的胶片放在两块氯丁橡胶橡胶之间。使用艾伦扳手, 拧紧橡胶顶部的金属夹具, 将胶片固定到位。对于2D 拉伸, 将所有四条边安装到四个铝块上, 以在两轴上拉伸 (图 2)。
- 测量和记录在铝块之间的胶片长度在一个轴的1D 拉伸或两个轴的2D 拉伸。根据所需的褶皱拉伸计算在一个或两个方向拉伸胶片所需的距离。
- 将薄膜加载的拉伸装置放置在90摄氏度的烤箱中, 使薄膜温度超过10分钟。用少量的水将一个大烧杯放在烤箱里。
- 拉伸膜。
- 拉伸完成后, 从烤箱中取出拉伸装置, 使薄膜冷却至室温20分钟。
- 对于1D 拉伸, 将胶片从边缘拉伸装置中切出。对于2D 拉伸, 切出并保存在两个轴上均匀拉伸的胶片的中心方形。将薄膜放置在锥形管中, 每管2片, 然后丢弃胶片的其余部分。
- 将大约25毫升的 DI 水添加到每个锥形管和涡旋, 直到薄膜溶解为止。
- 一旦薄膜溶解, 用 DI 水洗涤颗粒3次。
- 对于微粒, 将锥形管填充到50毫升, 在 3000 x g 处离心5分钟, 倒入上清液, 添加大约20毫升的 DI 水, 涡旋重悬粒子。
- 对于纳米粒子, 将粒子转移到高速离心管和离心机的 4万 x g 15 分钟, 倒出上清, 增加约20毫升的 DI 水, 涡旋重悬粒子。
- 第三次洗涤后, 在大约1毫升的 DI 水中重悬粒子。记录微量离心管的重量, 并将颗粒添加到管中。在-80 摄氏度冷冻机中冷冻颗粒1小时或在液氮中冷冻。一旦冰冻, lyophilize 颗粒一夜之间。
- 一旦冻干, 在微量离心管中称量颗粒并减去空管的记录重量, 以确定冻干颗粒的重量。
3. 表面蛋白共轭形成人工抗原呈现细胞
- 准备 2-(n-吗啉代) 乙烷磺酸 (MES) 缓冲器。用1M 氢氧化钠 (氢氧化钠) 滴定法, 在水中进行 MES 0.1 米溶液, 并将 pH 值调整到6.0。
- 通过涡旋在 MES 缓冲器中重悬冻干粉/PBAE 微/纳米颗粒在20微克/毫升。用900微升的 MES 缓冲器填充聚丙烯微量离心管, 然后将100微升的粒子溶液添加到管中。
- 准备 EDC/NHS 解决方案。溶解40毫克 1-乙基 3-(3-丙基) 氢化物 (EDC) 和48毫克 n-hydroxysulfoxuccinimide (NHS) 在1毫升 MES 缓冲器。
- 添加100微升 EDC/NHS 解决方案的颗粒和涡混合。
- 在室温下将管在变频器上孵育30分钟。
- 在 5000 x g 下旋转微粒5分钟, 或纳米粒子在 1.7万 x g 5 分钟。用涡旋 (微粒) 或 sonicating 在 2-3 W 上丢弃1毫升 PBS 中的上清和重悬5秒 (纳米粒子)。
- 对于微粒, 添加8微克的所需信号1蛋白和10微克反老鼠 CD28 (克隆 37.51) 到粒子。对于纳米颗粒, 添加16微克信号1和20微克反小鼠 CD28。添加 PBS, 使管内的体积为1.1 毫升。
- 在4摄氏度的逆变器上孵育管。
- 第二天, 清洗粒子。在 5000 x g 下旋转微粒5分钟, 或纳米粒子在 1.7万 x g 5 分钟。丢弃上清液, 并在1毫升无菌 PBS 中重悬颗粒, 涡旋 (微粒) 或超声 2-3 W 5 秒 (纳米颗粒)。重复两次。
- 在培养基中以所需浓度重悬颗粒, 立即使用。长期贮存时, 在100毫米蔗糖溶液中重悬10毫克/毫升的颗粒。冻结, lyophilize, 并将颗粒储存在-80 摄氏度。
4. aAPC 的表征和评价
- aAPC 尺寸和形状的表征 (图 3)
- 使用扫描电子显微镜 (SEM) 表征微粒的大小和形状。对于 SEM 成像, 将冻干颗粒涂在碳带上, 粘附在铝粘性和溅射涂层上的金钯。
- 利用图像分析软件分析粒子的大小和纵横比。
- 要确定颗粒大小, 请使用比例尺和测量颗粒直径来设置比例。重复大约100个粒子, 以确定平均颗粒直径并生成颗粒大小的直方图。
- 要确定纵横比, 测量长轴和颗粒短轴之间的距离, 并用短轴除以长轴。重复每个形状的大约50个粒子, 以确定每个形状的平均粒子纵横比, 并生成直方图。
- 通过透射电镜 (TEM) 成像粒子表征纳米颗粒的大小和形状。用5.1.2 中描述的图像分析软件分析纳米颗粒的尺寸和纵横比。或者, 使用动态光散射 (DLS) 或纳米粒子跟踪分析 (NTA) 测量球形纳米颗粒的大小。
- 蛋白质共轭效率
- 根据方法1-3 准备 aAPC, 但在步骤3.7 中使用荧光标记的信号1蛋白和反小鼠 CD28。在共轭和洗涤后, 在1毫升 PBS 中重悬 aAPC, 最终浓度为2毫克/毫升 aAPC。
- 在黑色聚苯乙烯96孔微孔板中制备蛋白质标准。添加5微克的荧光标记信号1蛋白到 pbs 在第一井的板块和做 10 1:2 稀释在 pbs 跨行的板块。把最后一个井留空。重复此步骤可生成与荧光标记为 anti-CD28 的另一组标准。
- 将100微升的 aAPC 溶液移入黑色聚苯乙烯微孔板的复制孔三份。
- 在合适的波长上读取荧光板读取器上的荧光。使用蛋白质标准的荧光读数为每种荧光抗体生成标准曲线。使用标准曲线, 计算每个样本井中信号1和 anti-CD28 的浓度, 然后计算表面蛋白和共轭效率的量 (图 4A, 图 5A)。
- aAPC 对 CD8+ T 细胞体外刺激的评价
- 准备 B ' 培养基 (RPMI 培养基补充 l-谷氨酰胺, 10% FBS, 1% 非必需氨基酸溶液, 1% 丙酮酸钠, 1% MEM 维生素溶液, 92 微米β巯基乙醇, 10 ng/毫升环丙沙星, 和 30 U/毫升 IL-2。
- 通过二氧化碳照射牺牲一只黑色的6只老鼠。
- 根据先前建立的16号议定书, 从老鼠身上采集脾脏。收集脾脏在一个50毫升锥形管与 10-15 毫升 PBS。使用杵, 捣碎脾脏通过70µm 细胞过滤器成50毫升锥形管。在糖化过程中, 用40毫升 PBS 洗涤过滤器。
- 旋转脾细胞在 300 x g 5 分钟。倒出上清和重悬脾细胞在4毫升的 Ack 裂解缓冲液裂解红细胞。允许管不受干扰地坐1分钟, 然后添加 PBS, 使在管的体积20毫升。
- 旋转细胞在 300 x g 5 分钟。倒出上清液, 在1毫升 PBS 中重悬细胞。使用血细胞计数器计数单元格。
- 在 300 x g 旋转细胞5分钟, 并在所需的细胞分离缓冲液中重悬。根据制造商的协议, 使用 CD8+ 阴性选择 t 细胞隔离套件, 将 CD8+ t 细胞与单细胞悬浮液隔离。
- 在磁分离后, 在 300 x g 处旋转 CD8+ T 细胞五分钟, 然后取出细胞分离缓冲液。在1毫升 PBS 中重悬细胞并计数细胞。根据制造商的协议, 用羧基荧光素琥珀酰酯 (CFSE) 标记细胞。
- 孵育 8333 CD8+ T 细胞和0.0833 毫克 (或所需剂量) 的 aAPC 在150微升 B ' 培养基中每孔96井 U 底组织培养处理板。
- 在37摄氏度孵育7天。3-4 天后, 通过添加75微升新鲜培养基对每个油井刷新培养基。
- 在孵育3天后, 分析流式细胞仪上 CFSE 标记的电池以评估增殖。流式细胞术 CFSE 直方图上的每个峰值都代表着由于 CFSE 稀释而产生的细胞分裂。
- 7天后, 使用血细胞计数器计算每个井中的细胞数。在计数之前, 用台盼蓝溶液染色死细胞。从最终的细胞计数中排除死细胞。将最终细胞浓度正常化为初始浓度以计算折叠膨胀 (图 4 和图 5)。
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Representative Results
图 1给出了自动2D 薄膜拉伸装置的示意图。给出了一种1D 薄膜拉伸装置的原理图和描述.17担架是由铝零件使用标准铣削和加工技术制造的。与1D 担架类似, 2D 担架由金属夹具和导轨组成。双向引线螺钉用于将线性转换为旋转运动。引线螺钉通过机械丝锥连接到具有足够扭矩的相同步进电机。8步进电机控制导线可焊接到8针耐热的安费诺连接器上, 便于在烤箱中连接控制台, 以进行薄膜拉伸。必须使用足够长的聚四氟乙烯 (PTFE) 涂层导线将步进电机连接到控制台的驱动程序。图 1A给出了推荐的计算机控制方案。两台电机必须通过耐热布线连接至2个独立驱动器。然后, 两个驱动程序必须连接到微控制器以与计算机接口。驱动程序应连接到微控制器上的 X 轴和 Y 轴输出。驱动程序和微控制器都需要外部电源。在将电源连接到这三组件之前, 建议在每个电源连接之间插入 4 a 保险丝, 以保护组件不受电流过载的限。最后, 微控制器可以通过一个并行端口输入连接到使用 DB25 公电缆的计算机上。用于控制步进电机的电子元件是热敏的, 因此必须放置在操作过程中使用的任何热源 (如烘箱) 之外, 以将薄膜加热到足够的温度以实现拉伸。尽管推荐的电机耐热性高达本协议中为拉伸颗粒指定的温度, 但在连接到主电源时, 电机和驱动器会增加额外的热量。因此, 建议仅在实际胶片拉伸期间打开设备, 以最小化潜在的热积聚。
采用本协议所述的单乳液技术合成了聚乳酸纳米微粒, 分别采用透射电镜 (图 3A) 和 SEM (图 3B) 进行成像。球形纳米颗粒的直径为237.3 ± 4.0 nm, 由 DLS 和 NTA 测量的 224 nm 测量 (图 3C)。以 5000 rpm 的均质性合成微粒, 产生球形颗粒, 平均直径为3±1微米 (图 3D)。使用自动薄膜拉伸装置在一个维度的90摄氏度下拉伸粒子, 生成扁长椭球纳米微粒, 并在两个维度下拉伸70摄氏度以生成扁椭球粒子。通过测量颗粒的长轴和短轴距离, 并将两者分割, 分析了三种形状微粒的纵横比。球形微粒的纵横比为1.05 ± 0.04, 而1D 拉伸扁长椭球粒子的纵横比为3.6 ± 0.8 (图 3E)。2D 拉伸扁椭球粒子的纵横比为1.2 ± 0.2, 大致保持一个纵横比。
采用 EDC/NHS 反应化学方法, 将荧光标记的肽负载 MHC IgG 二聚体和 anti-CD28 抗体结合到拉伸和球形聚乳酸颗粒表面。共轭效率结果在球面和椭圆形微 aAPC (图 4A) 和纳米 aAPC (图 5A) 的表面上显示了类似的蛋白质含量, 并证明 aAPC 合成过程中的蛋白质耦合发生在浓度依赖性的方式。为了评价形状对 aAPC 功能的影响, 利用 gp100-loaded MHC IgG 二聚体和 anti-CD28 的球形和扁长椭球 aAPC 来刺激 PMEL 转基因 CD8+ T 细胞。T 细胞被标记与 CFSE 和评估的流式细胞术后3天评估增殖 (图 4B, 5B)。扁长椭球 aAPC 被发现在亚饱和剂量比球形 aAPC 诱导更高水平的 T 细胞增殖, 最佳分离达到0.01 毫克剂量。7天后, T 细胞被手动计数。扁长椭球 aAPC 比微尺度 (图 4C) 和纳米尺度 (图 5C) 更有效地刺激 t 细胞, 观察到剂量依赖性 t 细胞扩张。
图 1: 自动薄膜担架的原理图表示.(A) 薄膜担架控制台示意图。(B) 薄膜担架机械硬件示意图。左机械硬件的头顶视图。权利薄膜夹持机构的横截面。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 2: 组装的自动薄膜担架的照片, 将聚合物颗粒拉伸成各向异性形状.2D 薄膜拉伸装置由两个轴组成, 带有铝制支架, 用于夹持胶片。两个轴在相反方向上包含引线螺钉, 以便它们彼此分开。为了使拉伸过程自动化, USB 链接微控制器连接到两个步进电机驱动器, 通过热电缆将信号中继到单极步进电机。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 3: 球形和椭球粒子的大小和纵横比分析.(a) 透射电镜和 (b) 球面、1D 拉伸扁长椭球体和2D 拉伸扁椭球 (A) 纳米颗粒和 (b) 微粒的 SEM 图像。(C) 球形纳米粒子的大小由 NTA, 确定为直径 224 nm。分析了聚乳酸微粒的扫描电镜图像 (D) 球形颗粒的大小分布和所有颗粒形状的纵横比。(C) 转载和改编的许可从小13, 版权威利-VCH 2015。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 4: 球面和扁长椭球微 aAPC 的表征和功能评估.(A) 荧光标记的肽负载 MHC IgG 二聚体和 anti-CD28 抗体对球形和扁长椭球微粒表面的共轭效率。(B) CD8+ T 细胞被标记为 CFSE, 用球形和 1 d 拉伸微 aAPC 在0.01、0.1 和1毫克剂量或非同源控制中孵育。3天后, 通过流式细胞仪评估细胞增殖。(C) T 细胞也通过人工计数在7天后进行评估。单元计数被规范化为初始计数以计算折叠扩展。对于扁长椭球体和球面折叠展开的比较, ** = p < 0.05, *** = p < 0.01, 和 *** = p < 0.001。误差线表示3个复制的平均值 (SEM) 的标准误差。复制和改编自生物材料12, 版权爱思唯尔2014。请点击这里查看这个数字的更大版本.
图 5: 球形和扁长椭球纳米 aAPC 的表征和功能评估.(A) 荧光标记的肽负载 MHC IgG 二聚体和 anti-CD28 抗体对球形和扁长椭球纳米颗粒表面的共轭效率。(B) CD8+ T 细胞被标记为 CFSE, 并与球形和扁长椭球纳米 aAPC 在0.01、0.1 和1毫克剂量变化的折叠拉伸。3天后, 通过流式细胞仪评估细胞增殖。(C) 通过人工计数, 在7天后评估了扁长椭圆形颗粒的不同褶皱伸展 (范围从1.5 到 3.5) 的 T 细胞。细胞计数被规范化到一个未经处理的条件来计算折叠膨胀。* = p < 0.05, *** = p < 0.01, 和 *** = p < 0.001 相比球形。误差线表示3个复制的平均值 (SEM) 的标准误差。复制和改编的许可从小13, 版权威利-VCH 2015。请点击这里查看这个数字的更大版本.
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Discussion
本协议详细介绍了一种用于精确生成各向异性聚合物粒子的通用方法。这里描述的薄膜拉伸技术是可扩展的, 高度重现性和成本低廉。产生各向异性粒子的替代技术受到许多限制, 包括高成本、低吞吐量和有限的粒子大小。薄膜拉伸方法也是有利的, 因为粒子在合成后被修改为各向异性, 因此, 与各种颗粒尺寸和合成技术兼容。图 1详细介绍了自动二维拉伸装置的设置。该装置还可在不使用电子元件的情况下手动转动螺钉, 直至胶片达到所需拉伸程度。然而, 我们发现自动化过程比手动操作15更加一致和快速。已经开发出各种不同的技术来合成各向异性粒子, 如微流控方法17、18、19、分层涂层21和其他自下而上的合成方法21 ,22。但是, 这些方法不允许对粒子几何体进行强大的控制, 并且在可以生成的形状和可使用的粒子材料方面并不多用途。一种常用的自上而下的制造非球形粒子的方法是在非润湿模板 (打印)24中进行粒子复制。虽然打印能够精确控制颗粒形状, 但它需要昂贵的机械, 并且不像薄膜拉伸方法那样易于访问和简单实现。
单乳液技术可用于制造各种尺寸的聚乳酸颗粒, 从纳米到微型12,13不等。通过不同的均质速度或超声振幅, 微粒和纳米颗粒的大小分别可以调制。一旦生成球形粒子, 此处描述的薄膜拉伸方法可用于将粒子变形成各种形状15。在本协议中, 我们分别描述了在一个或两个维度中拉伸扁长和扁椭球粒子的生成。球形颗粒被浇铸成薄薄的塑料薄膜, 在玻璃过渡温度下加热, 并在一个或两个维度上拉伸以变形粒子。粒子的纵横比是高度可控的。通过调整胶片拉伸的程度, 可以对粒子的纵横比进行调制, 我们发现测量的粒子纵横比与预测值12、13高度相关。可以通过修改拉伸过程中的温度或拉伸程度来生成各种其他形状。例如, 双凹透镜盘状颗粒类似于红血球的形状可以通过拉伸微粒1.5 倍在两个维度90°c 产生。15. 这种薄膜拉伸技术也被用于将球形聚苯乙烯颗粒转化成许多各向异性形状, 包括蠕虫、桶和矩形圆盘21。薄膜拉伸装置可通过手动控制螺钉或设备自动实现, 如图 1所示, 使工艺更加高效和一致15。这种简单的技术可靠地产生在生理条件下保持其形状的各向异性粒子24。此外, 该方法还被应用于其他高分子材料, 包括聚己 (PCL) 和由聚乳酸和保利 (β-氨基酯) (PBAE) 制成的混合粒子。
该协议还描述了不同大小和形状的 CD8+ 粒子如何与所需的表面蛋白结合, 以使 T 细胞活化成为 aAPC。蛋白质可以通过 EDC/NHS 介导的主要胺与颗粒表面上的羧基基团之间的耦合, 与各向异性和球形的聚乳酸微纳米粒子相互作用。蛋白质共轭的效率可以通过将荧光标记蛋白与粒子表面的耦合来测量, 如本协议所述, 我们发现这一技术将蛋白质与颗粒的结合率提高了 15-20%, 效率为12, 13。扁长椭球微粒子和纳米颗粒 aAPC 在激活 CD8+ T 细胞增殖和体外扩张时比球形对应物更有效12,13。由于接触12的表面积较大, 椭球 aAPC 增强了与 T 细胞的结合和相互作用。各向异性粒子在体内的球形粒子上也具有优越的性能, 因为它们增强的生物分布和抗吞噬能力13。这个平台是高度模块化的, 有可能适应许多其他药物交付应用。使用此程序, 可以生成可调谐形状和尺寸的聚合物颗粒, 并且粒子表面可以与任何感兴趣的蛋白质共轭。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
EBA (DGE-1746891) 和 KRR (DGE-1232825) 感谢 NSF 研究生研究奖学金计划的支持。RAM 感谢国家研究服务奖国立卫生研究院 NCI F31 (F31CA214147) 和大学科学家奖学金的成就奖励支持。作者感谢 NIH (R01EB016721 和 R01CA195503), 预防失明詹姆斯和卡罗尔免费催化剂奖的研究, 以及 JHU 彭博-Kimmel 癌症免疫治疗研究所的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(vinyl alcohol), MW 25000, 88% hydrolyzed | Polysciences, Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Digital Thermometer | Fluke | N/A | Model name: Fluke 52 II |
| Immersion Temperature Probe | Fluke | N/A | Model name: Fluke 80PK 22 |
| Digital Hotplate & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint stirrer | Thermo Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | D65100 | |
| Homogenizer | IKA | 0003725001 | |
| Sonicator | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Model number: VC 505 |
| Sonicator sound abating enclosure | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0427 |
| Sonicator probe | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & Materials, Inc. | N/A | Part number: 630-0423 |
| High speed centrifuge | Beckman Coulter | N/A | Model number: J-20XP (discontinued), alternative model: J-26XP |
| High speed centrifuge rotor | Beckman Coulter | 369691 | Model number: JA-17 |
| High speed polycarbonate centrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 mL, screw cap |
| Rectangular disposable petri dish | VWR International | 25384-322 | 75 x 50 x 10 mm |
| Square disposable petri dish | VWR International | 10799-140 | 100 mm x 100 mm |
| LEAF Purified anti-mouse CD3ε Antibody | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab anti-mouse CD28, clone 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100212 | |
| APC anti-mouse CD28 Antibody | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 Well Solid Polystyrene Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | flat bottom, black polystyrene |
| Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | Heat Inactivated, sterile-filtered |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Recombinant Human IL-2 (carrier-free) | Biolegend | 589102 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a+ T Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Flow Cytometer | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 Multi-Detection Microplate Reader | BioTek | ||
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| Cell Strainer | ThermoFisher Scientific | 22363548 | Sterile, 70 µm nylon mesh |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL/6J (Black 6) Mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, at least 7 weeks old |
| U-Bottom Tissue Culture Plates | VWR | 353227 | Sterile, 96-well tissue culture treated polystyrene plates |
| 40 V DC Power Supply | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE Coated Wire | Mouser | 602-5858-100-01 | This is for a 100 ft. spool but an equivalent wire will work |
| Stepper Motor Driver | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector Kit | Probotix | IDCM-10-12 | |
| Microcontroller | Probotix | PBX-RF | |
| 4A Fuses | Radio Shack | 2701026 | Equivalent fuses will work as well |
| DB25 Male to Male Cable | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A to USB-B Cable | Staples | 2094915 | Equivalent cable will work as well |
| 8-Pin Amphenol Connectors Male and Female | Mouser | 654-97-3100A-20-7P and 654-97-3106A20-7S | |
| Stepper Motor | Probotix | HT23-420-8 | |
| Right Hand Lead Screw | Roton | 60722 | |
| Left Hand Lead Screw | Roton | 60723 | |
| Screws | McMaster Carr | 92196A151 | |
| Neoprene Rubber | McMaster Carr | 8698K51 | |
| Right Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91962 | |
| Left Handed Flanged Lead Nut | Roton | 91963 | |
| Linux Control Computer | Probotix | LCNC-PC | Any computer with matching specification and Linux operating system will work |
| Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4 % | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
References
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